第九章 DNA序列分析
dna序列分析原理
dna序列分析原理DNA序列分析是一种用于研究和解析DNA的技术方法。
通过对DNA序列中的碱基进行分析和比较，可以推断出DNA的组成、功能以及可能的遗传信息。
DNA序列分析的基本原理是通过测定DNA中的碱基序列来分析其结构和功能。
DNA是由四种碱基（腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G和胞嘧啶C）组成的链状分子。
通过对DNA碱基序列的测定，可以确定DNA中各个碱基的顺序和相对位置。
DNA序列分析通常包括以下几个步骤：1. DNA提取：从细胞或组织中提取DNA，通常采用化学方法或者商业化的DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增：为了得到足够多的DNA样本，通常需要进行多轮的PCR（聚合酶链式反应）扩增。
通过选择合适的引物，可以选择性地扩增出目标DNA片段。
3. DNA测序：利用测序技术对扩增的DNA进行测序。
目前常用的测序方法包括传统的Sanger测序和新兴的高通量测序技术。
测序结果可以得到DNA的碱基序列信息。
4. DNA比对和注释：将测序得到的DNA序列与已知的DNA序列数据库进行比对，可以确定DNA的来源、功能和可能的变异。
同时，对测序结果进行注释，可以推断DNA中可能的基因、编码蛋白质以及调控元件等。
5. 功能预测：通过分析DNA序列中的开放阅读框（ORF）、启动子、转录因子结合位点等功能元件，可以预测DNA的功能。
此外，还可以利用同源比对和结构预测等方法来预测DNA序列可能的结构和功能。
DNA序列分析在生物学研究、基因工程和生物信息学等领域具有广泛的应用。
通过深入分析DNA序列，可以揭示基因的结构和功能，为疾病的诊断和治疗提供理论依据，以及推动生物技术的发展和应用。
基因工程7-DNA序列分析ppt课件
第二节 Sanger双脱氧链终止法
一、基本原理
双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的脱氧核糖的3’位置的羟基缺 失，当它与正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在 DNA聚合酶的作用下，虽然它也能参与DNA合成，但由于 其3’位置的羟基缺失，使其下面的核苷酸的5’磷酸基无法与 之结合。也就是说，一旦双脱氧核苷酸整和到正在合成的 DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。
1977年，A. M. Maxam 和W. Gilbert首先建立了DNA片段序 列的测定方法，由于该方法是用特定化学试剂修饰不同碱基， 并在相应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的，故称之为 Maxam-Gilbert 化学降解法。
二、化学降解测序法的基本步骤
• 对待测DNA片段的5’端磷酸基团作放射性标记； • 用化学修饰剂修饰特定碱基； • 凝胶电泳分离和放射自显影及读序。
• 通用引物指导未知序列的测定 • 引物步移 • 随机克隆测序 • 缺失克隆测序
随机克隆测序详细过程：http://smcg.cifn.unam.mx/enpunam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/humanShot.swf
3ห้องสมุดไป่ตู้缺失克隆测序
第九章 DNA序列分析
DNA双螺旋结构解明之后，研究基因组中每一 个基因的作用就成为了生物科学工作者的主要 课题。为此，首先必须设法知道目的基因的核 苷酸排列顺序，即基因测序。
DNA测序方法：
• Maxam-Gilbert 化学降解法 • 双脱氧链终止法（Sanger酶学法）
第一节 Maxam-Gilbert 化学降解法
二、序列分析的基本步骤
1、模板制备和引物设计 模板：单链或双链DNA，必须保证足够的浓度 引物：18-22nt，55-60℃，尽量避免3个以上碱基重复，
生物信息学中的DNA序列分析技术研究
生物信息学中的DNA序列分析技术研究1. 引言生物信息学是一门跨学科的学科，通过整合生物学、计算机科学和数学等领域的知识，研究生物学中的各种分子生物信息。
DNA序列分析是生物信息学中的一项重要研究内容，它可以揭示DNA序列中的遗传信息，对于研究物种的进化、基因功能和人类疾病等方面具有重要意义。
2. DNA序列分析的基本原理DNA序列是由四种核苷酸（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶）构成的线性链状分子，其中每个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来。
DNA序列分析的基本原理是通过计算机对DNA序列进行比对、注释、预测和分析等操作，从而获得有关该序列的各种信息。
3. DNA序列比对技术DNA序列比对是指将两个或多个DNA序列进行匹配，以找出它们之间的相似性和差异性。
常用的DNA序列比对技术包括全局比对和局部比对。
全局比对适用于较长的DNA序列，如整个基因组；局部比对则适用于具有局部重复结构的DNA序列。
4. DNA序列注释技术DNA序列注释是指对DNA序列进行功能标记和注释，以便于理解和解释该序列的生物学意义。
DNA序列注释常涉及基因识别、CDS（编码序列）预测、启动子区识别等内容。
常用的DNA序列注释软件有NCBI的BLAST、Exonerate、GEISA等。
5. DNA序列预测技术DNA序列预测是指利用计算机方法推测DNA序列的相关信息，如基因位置、蛋白质编码区域、剪接位点等。
常用的DNA序列预测方法包括基于启发式模型和机器学习模型，如HMM（隐马尔可夫模型）、SVM（支持向量机）等。
6. DNA序列分析的应用领域DNA序列分析技术在生物学研究的多个领域都有广泛应用。
例如，在基因组学领域，DNA序列分析可用于比较基因组学、遗传多样性研究等；在进化生物学领域，DNA序列分析可用于系统发育关系研究、种群遗传学分析等；在人类疾病研究领域，DNA序列分析可用于基因突变检测、致病基因鉴定等。
7. DNA序列分析的挑战和发展方向虽然DNA序列分析技术已经取得了重大突破，但仍存在一些挑战。
DNA的序列分析与基因识别
DNA的序列分析与基因识别DNA，即脱氧核糖核酸，是构成生物遗传信息的基本分子。
通过对DNA序列的分析，我们可以了解生物的遗传特征、进化关系以及疾病的发生机制等。
而基因识别则是通过分析DNA序列中的基因编码区域，确定其中的基因。
DNA序列分析是一项复杂而重要的工作。
在过去，科学家们只能通过实验室的手工方法逐个测序，耗时且费力。
然而，随着高通量测序技术的出现，我们现在可以在短时间内获得大量的DNA序列数据。
这为DNA序列分析提供了更广阔的可能性。
DNA序列分析的第一步是序列比对。
通过将待测序列与已知的DNA序列进行比对，我们可以确定它们之间的相似性和差异性。
这可以帮助我们了解基因的进化关系以及物种间的亲缘关系。
此外，序列比对还可以帮助我们寻找特定的基因区域，如启动子、转录因子结合位点等。
在序列比对的基础上，我们可以进行进一步的分析，如基因预测和注释。
基因预测是指通过分析DNA序列中的编码区域，确定其中的基因。
这是一个复杂的过程，需要考虑到编码区域的特征，如起始密码子、终止密码子等。
同时，我们还需要考虑到非编码区域的干扰，如转座子和重复序列等。
基因注释是指对已经预测出的基因进行功能和结构的注释。
这需要将基因序列与已知的基因数据库进行比对，并通过功能预测算法进行分析。
通过基因注释，我们可以了解基因的功能、参与的代谢途径以及与疾病的关联等。
这对于研究生物的生理过程和疾病的发生机制具有重要意义。
除了基因识别，DNA序列分析还可以用于研究基因组结构和变异。
通过比较不同个体的DNA序列，我们可以了解基因组中的变异情况，并研究其与个体特征、疾病易感性等之间的关系。
这对于个性化医学和疾病预防具有重要意义。
DNA序列分析在医学领域有着广泛的应用。
通过分析患者的DNA序列，我们可以确定其患有的遗传疾病、药物代谢能力以及潜在的疾病风险。
这为个体化治疗和疾病预防提供了依据。
此外，DNA序列分析还可以用于研究疾病的发生机制和进化关系，为新药的研发和治疗策略的制定提供指导。
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
生物学中的DNA序列分析
生物学中的DNA序列分析DNA（脱氧核糖核酸）是人类和所有生物的基本遗传物质，它决定了细胞功能和身体的发育。
DNA序列分析是生物学中非常重要的一种研究方法，它可以揭示DNA的组成，结构和功能。
在本文中，我们将深入探讨DNA序列分析的核心原理，工具和应用。
DNA序列分析的原理DNA分子是由碱基对（adenine，thymine，guanine，cytosine）构成的双螺旋结构，它们以特定的方式组合在一起，形成基因。
DNA序列分析是根据这些碱基对的组成和排列，通过计算机模拟和分析，来确定基因的序列和功能。
DNA序列分析的工具DNA序列分析需要用到多种工具，其中最常用的是生物信息学工具和DNA测序技术。
生物信息学工具包括多种软件和算法，例如BLAST，ClustalW和PhyloXML等。
这些工具可以用来比较和分析DNA序列，建立进化树，预测蛋白质的结构和功能等。
DNA测序技术是最基本的DNA分析方法之一，它可以通过测量DNA中碱基对的数量和类型，来确定DNA的序列。
最常用的DNA测序技术是Sanger测序和下一代测序技术（NGS）。
Sanger测序技术是一种传统的测序方法，它使用化学方法来标记DNA碱基，然后通过电泳分离碱基，逐一确定DNA序列。
而NGS技术是一种高通量的测序方法，它可以同时测序成千上万个DNA分子，大大提高了测序速度和效率。
DNA序列分析的应用DNA序列分析在生物学中有着广泛的应用，包括基因组学，进化生物学，系统生物学，生物医学和生态学等领域。
在基因组学中，DNA序列分析被用来确定生物的基因组大小，结构和组成，预测基因位置和功能，寻找基因突变和揭示基因调控机制。
例如，人类基因组计划就是一个基于DNA序列分析的项目，它的目标是测序和分析人类基因组中的所有DNA，以了解人类基因的特点和功能。
在进化生物学中，DNA序列分析被用来研究不同物种之间的亲缘关系和演化历史。
通过比较不同物种的DNA序列，可以推断它们的共同祖先和分支时间，建立进化树，揭示演化过程和机制。
第9章_DNA序列分析
第9章_DNA序列分析DNA序列分析是指对DNA序列进行系统性研究和分析的过程。
DNA序列是生物体内的遗传信息的载体，对于了解基因功能、生物演化、疾病发生机制等具有重要意义。
本章将介绍DNA序列分析的方法和应用。
DNA序列分析的方法包括序列比对、基因预测、遗传变异检测和进化分析等。
序列比对是将已知DNA序列与未知序列进行对比，寻找相似之处，从而推断未知序列的功能。
常用的序列比对工具有BLAST、Bowtie等。
基因预测是利用生物信息学方法预测未知DNA序列中的基因位置和功能。
常用的基因预测工具有GeneMark、Glimmer等。
遗传变异检测是通过比较不同个体之间的DNA序列差异，寻找与疾病相关的遗传变异。
进化分析是利用DNA序列比较不同物种之间的遗传差异，推断它们的亲缘关系和演化过程。
常用的进化分析方法有多序列比对、系统发育树构建等。
DNA序列分析在生物学研究和应用领域具有广泛的应用。
在基础研究方面，DNA序列分析可以帮助研究人员了解基因的功能和调控机制。
通过比对不同物种之间的DNA序列，可以揭示物种的进化关系和演化过程。
在医学研究方面，DNA序列分析可以用于疾病的诊断和预测。
通过检测DNA序列中的遗传变异，可以发现与疾病相关的基因突变，并为疾病的治疗和预防提供理论基础。
在农业研究方面，DNA序列分析可以应用于作物和畜禽的遗传改良。
通过分析作物和畜禽的DNA序列，可以挖掘有益基因和导育改良品种，提高农作物和畜禽的产量和品质。
随着高通量测序技术的发展，DNA序列分析在研究领域的应用也得到了大幅度的提升。
高通量测序技术可以快速、准确地获取大量的DNA序列信息，为DNA序列分析提供了更为丰富的数据。
同时，也为DNA序列分析提供了更多的挑战，如序列比对的速度和精度、大规模数据的储存和分析等。
因此，进一步研发和改良DNA序列分析的方法和工具，提高分析效率和准确性，将是今后的研究重点。
综上所述，DNA序列分析是一项重要的生物信息学研究方法，具有广泛的应用前景。
DNA序列分析及其在生物学研究中的应用
DNA序列分析及其在生物学研究中的应用DNA是所有生物体中存储遗传信息的分子基础。
通过对DNA序列的分析，科学家们能够揭示生物物种之间的进化关系、研究基因功能以及预测基因的表达模式等。
DNA序列分析在生物学研究中扮演着至关重要的角色，本文将介绍DNA序列分析的一些基本方法以及它们在生物学研究中的各种应用。
DNA序列分析的基本方法包括DNA测序、DNA比对和基因注释。
DNA测序是将DNA分子中的碱基顺序测定出来的过程，研究者可以通过测序仪器获取基因组的完整DNA序列。
DNA比对是将已知DNA序列与未知DNA序列进行匹配的过程，可以确定两个序列之间的相似性。
基因注释是对已知DNA序列进行功能注释，通过将DNA序列与已知的基因数据库进行比较，确定基因的功能和表达情况。
DNA序列分析在生物学研究中的一个主要应用是亲缘关系和进化关系的研究。
通过比较不同物种的DNA序列，科学家们可以揭示物种之间的亲缘关系和进化关系。
例如，基因系统发生学利用DNA序列来构建进化树，揭示不同物种之间的进化关系。
此外，DNA条形码技术利用物种特定的DNA条形码序列来鉴定物种。
它已经广泛应用于物种鉴定、保护性监测和生态学研究等领域。
DNA序列分析还在基因功能研究中起到重要作用。
对DNA序列的注释可以预测基因的功能和表达模式。
通过对DNA序列中的密码子进行研究，科学家们可以预测一个基因的蛋白质翻译序列，并进一步研究蛋白质的结构和功能。
此外，DNA序列分析还可以预测基因的调控元件，包括启动子、增强子和转录因子结合位点等，这对于理解基因表达调控机制至关重要。
DNA序列分析在疾病遗传学研究中也发挥着重要作用。
科学家们通过对DNA序列的比较分析，可以鉴定以及研究与疾病相关的突变。
例如，全外显子测序技术可以对所有基因进行测序，从而发现与遗传病相关的基因变异。
此外，人类基因组计划的完成使得人类基因组的广泛研究成为可能，科学家们可以通过分析大规模的人类DNA测序数据，揭示与疾病相关的遗传变异以及基因组的结构和变异模式。
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第9章 DNA序列分析
o o o o Maxam—Gilbert化学降解法 Sanger双脱氧链终止法 DNA片段序列测定的策略※ 核苷酸序列的生物信息分析※
9.1 Maxam—Gilbert化学降解法
9.1.1 基本原理
o 1977年，A．M．Maxam和W．Gilbert首先建立了DNA片段 序列的测定方法 o 原理：将待测DNA片段的5‘端磷酸基团作放射性标记， 再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并 在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别 以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片 段群通过并列点样（lane-by-lane）的方式用凝胶电泳 进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基 序列。
o 核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰 并在被修饰的碱基处（5′或3′）打断磷酸二酯键，从 而达到识别不同碱基种类的目的。
1
9.1.2 化学降解测序法的基本步骤
o 化学降解测序法的基本步骤包括： （1）对待测DNA片段的5′端磷酸基团作放射性标记； （2）用化学修饰剂修饰特定碱基； （3）凝胶电泳分离和放射自显影显示出各片段的长度 （4）读序，由于在同一反应体系中，各DNA片段的标 记端相同、起始位点相同，所以，根据断裂部位至 标记端起始部位之间的距离（片段长度），即可得 出碱基顺序。
9.1.3 化学修饰试剂
碱基体系 G A+G C+T C A>C 化学修饰试剂 硫酸二甲酯 哌啶甲酸 肼 肼+NaCl 化学反应 甲基化 脱嘌呤 打开嘧啶环 打开胞嘧啶环
断裂部位 G G和A C和T C
90℃， 断裂反应 A和C NaOH(1.2mol/L） 哌啶（90℃，1mol/L）在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂
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图9-1 MaxamGilbert化学降 解法测序原理
9.1.4 化学降解测序法的应用
o Maxam-Gilbert化学降解测序法不需要进行酶催 化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来 的误差； o 对未经克隆的DNA片段可以直接测序。
o 化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基 腺嘌呤、G＋C含量较高的DNA片段以及短链的寡 核苷酸片段的序列。
o 测定长度大约250个碱基
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9.2 Sanger双脱氧链终止法
9.2.1 基本原理
p 1977年英国的F．Sanger设计的方法 o 双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3‘位置的OH缺失，致使下位核苷酸的5‘磷酸基团无 法与之结合。
一旦双脱氧核苷酸整合到正 在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此 终止。
图9-2 双脱氧 核苷酸 （ddNTP）分 子结构及DNA 链合成终止反 应 o A．正常 的DNA合 成反应； o B．ddNTP 掺入到 DNA合成 反应后导 致反应终 止
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9.2.2 序列分析的基本步骤 ⒈ 模板制备和引物设计
⑴ 模板制备
o 模板就是待测的DNA片段。
模板可以是由M13噬菌体载 体或嗜菌粒载体制备的单链DNA，或双链DNA。
无论使 用何种模板，必须保证足够的纯度和浓度，特别是使 用双链DNA模板。
⑵ 引物设计
o 作为测序引物的寡核苷酸。
为方便使用，在大多数情 况下可利用通用引物（正向引物）来测序，也可用反 向引物。
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⒉ 经典测序方法的反应步骤
⑴ 模板变性 将待测DNA模板与引物混合，通过加热使模 板变性。
⑵ 退火 将变性的模板与引物混合物缓慢降温，使引物与 模板结合。
⑶ 标记 主要有两种方式，其一是在DNA合成过程中掺入 标记的核苷酸，如利用[α-32P]dATP标记。
另一种是末 端标记。
⑷ 延伸和终止 反应体系中新生核苷酸链的合成和随机终 止的过程。
⑸ 电泳分析和数据读取 将终止反应产物并列点样进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳，分辨出大小相差1个核苷酸的反应 产物，然后进行放射自显影。
根据片段尾部的双脱氧核 苷酸类型解读出该DNA的碱基排列顺序。
9.2.3 序列分析的工作模式
⒈ 手动测序
o 手动测序（full manual operation）模式就是按 以上经典测序方法进行测序，在PCR技术广泛应用 之前是DNA测序的主导方法。
使用该方法工作强度 大，要求工作人员具备娴熟的操作技能。
⒉ PCR测序
o 在手动测序模式中的模板变性、退火、标记、延伸 和终止反应实际上相当于PCR反应的1个循环。
因此 可通过类似PCR的热循环反应来完成经典的测序反 应过程，而且还可以重复多次这样的反应（20-25 次）。
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⒊ 全自动测序
o 用4种不同的罗丹明荧光染料分别标记4种双脱氧核 苷酸。
由于这4种荧光染料可激发出不同颜色的荧 光，因此4种链终止反应可在同一个试管中进行并 在同一条泳道中检测。
o 将反应产物装入全自动测序仪后，这些产物在聚丙 烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳中按相差1个核苷酸 大小的DNA片段长度顺序向下泳动，当它们到达检 测器时，激光探测仪发出激光，激发荧光染料标记 的4种双脱氧核苷酸，故每一种荧光代表一种碱基。
o 这些荧光信号通过检测系统传输至计算机后，计算 机便能自动排列出DNA片段的碱基序列。
图9-4 ABI377全自动测序过程的荧光信号峰形图 每一种颜色的信号峰代表一种脱氧核苷酸，其排列顺序为 待测DNA的核苷酸序列。
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思考题
1. 简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。
2. 简述将Sanger的测序方法称为双脱氧链终止法的理 由。
3. 试述化学降解法和双脱氧链终止法的异同点。
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