示差分光光度法三
1
2
A
（
x
1
x
2）bC
x
Y 的存在不干扰 X 的测定
单色器
光 源
检测器
单色器
切 光 器
狭 缝
吸 收 池
问题
光 源
单色器 单色器
切 光 器
狭 缝
吸 收 池
检测器
1. 双波长法与常规参比法比较，有什么特点？
2.如何借助于双波长法消除干扰？
六、双波长分光光度法
X
Y
A
A A1 A 2
A B
c
推导
将上各式整理得：
Ka
AHB A [ H ] A AB
pKa
pH
lg
A AB AHB A
六、双波长分光光度法
X
Y
A
A A1 A 2
(Ax1 Ay1) （Ax2 Ay2）
∵ x2
二. 示差分光光度法
若采用示差法，可以提高测量的准确度。
(cx>cS 时，适宜高浓度的测 定)
方法 常规法
定量
误差
示差法
因 I0>IS 故 Tr>Tx 有
结 论：示差法提高了准确度
例题
1. 已知ST ＝ 0.01,样品Tx = 2.00％，标准TS = 10.0% 示差法
常规法误差 示差法误差
国家标准（GB）采用二苯碳酰二 肼分光光度法测定六价铬。
例2 维生素B6注射液的测定
维生素B6在290 ± 1 nm处有最大吸收，药典采用
紫外可见分光光度法测定维生素B6注射液。测量
在0.1
mol·L-1HCl介质中进行，按
E1% 1cm
(290
1nm)
427
计
算维生素B6的含量。
例3 蛋白质在280 nm处有最大吸收，可 用于蛋白质的定量测定。
例题
1. 将0.376g土壤样品溶解后定容至50mL。取25mL试液进行处 理，以除去干扰元素，显色后定容至50mL，用1cm吸收池 在510nm处和656nm处分别测得吸光度为0.467和0.374，计 算土壤样品中钴和镍的质量分数。已知M(Co)=58.93， M(Ni)=63.55。
钴和镍的配合物有如下数据:
当络合物很稳定时，曲线的转折 点明显，而络合物的稳定性稍差 时，可画切线外推找出转折点。
图3－4 连续变化法
五、酸碱离解常数的测定
1. 原 理
HB ⇌ H+ + B-
Ka
[H ][ B ] [ HB ]
2. 测定方法
下面以一元弱酸解离常数的测定为例介绍该方 法的应用。
配制三种分析浓度(c =[HB]+[B-])相等而pH不同
吸光光度法的应用
一、微量组分的测量 二、示差分光光度法 三、光度滴定法 四、络合物组成的测定 五、酸碱离解常数的测定 六、双波长分光光度法
1.单组分的测定
A-c 标准曲线法
举例
例1 水中六价铬的测定
在酸性条件下，六价铬与二苯碳酰二肼反应生 成紫外红色络合物，λmax＝540 nm，
ε＝2.6×104~4.17×104 L·mol-1·cm-1。
(Ax1 Ay1) （Ax2 Ay2）
三、光度滴定法
光度滴定法是依据滴定过程中溶液的吸光度的突变来确 定滴定终点的滴定分析方法。
↑ 例, 滴定反应M + R = MR 随着 R 的加入，[M] [MR] ↑ ,
滴定曲线随各物质的吸收性质的不同而不同。
四、络合物组成的测定
1. 摩尔比法 2.等摩尔连续变化法
1. 摩尔比法
图3-3 摩尔比法
的溶液。
第一种溶液
A AHB AB HB[HB]B [B]
A HB
[H ]c [H ] Ka
B
Kac [H ] Ka
第二种溶液
AHB HB[HB] HBc
HB
AHB c
第三种溶液
A B
B[B] Bc
B
适应范围：此法适用于离解度较小，配位比高的配合物组成 的测定，当离解度较大时，因无明显转折点，不能准确测定。
2.等摩尔连续变化法
④ 以A cM 作图 cM cR
⑤曲线转折点所对应的cR/cM值，即为ｎ
适应范围：适用于配位比低，稳定 性高的配合物组成的测定。
此外还可以测定络合物的不稳定 常数。
wCo
m ms
100 %
9.70 10 6 50 10 3 0.376 25.00
58.93
100 %
=0.015%
50.00
wNi
m ms
100 %
2.06 10 6 50 10 3 58.69 0.376 25.00
100 %
50.00
=0.032%
656 Ni Ni
即
0.467 3.64 10 4 CCo 5.52 103 CNi
0.374 1.24 103CCo 1.75 10 4 CNi
解得
cCo =9.70×10-6 (mol·L-1) cNi =2.06×10-5(mol·L-1)
土壤样品中Co和Ni的含量计算如下：
/nm
510nm
656nm
/nm
Co
3.64×104 1.24×103
Ni
510nm 5.52×104
656nm 1.75×104
解：已知b=1cm，由公式A=bc和吸光度的加和性， 可得联立方程组：
A510=
c c 510 Co Co
510 Ni Ni
A656=
c c 656 Co Co
结论： 示差法提高了准确度
2. 已知ST ＝ 0.01,样品Tx = 2.00％，标准TS = 5.00% 3、例题
采用专门设计的示差光度计，这就使其 应用受到了一定限制。
例题
1. 用一般光度法测 0.0010mol.L-1 锌标液和含锌的试 液，分别测得 As = 0.700 和 Ax =1.00，两溶液的透 光度相差多少？若用 0.0010mol.L-1锌标液作参比， 试液的A为多少？示差光度法与一般光度法相比， 读数标尺放大了多少倍？
例4 氨基酸与茚三酮反应生成红色络合物， 可用于氨基酸含量的测定。
2.双组分的测定
同时测定一种试样中的多种组分的基础：
是吸光度具有加合性，即总吸光度为各个组分 吸光度的总和。
设试液中含有两种吸光物 质X和Y，其吸收光谱互相重叠， 根据吸光度的加合性，得
ε为物质得特征参数，可通过配制标准测得 解联立方程，可求得cX, cY。
分光光度法
( C )2. 用普通分光光度法测得标液c1的透光度为20%， 试液的透光度为12%；若以示差分光光度法测定以c1 为参比，则试液的透光度为
A. 40% B. 50%
C. 60%
D. 70%
( D )3. 按一般光度法用纯溶剂做参比溶液时，测得某试 液的透光度为10%。若参比溶液换为透光度为20%的
(×) 4. 有色溶液的吸光度为0，其透光率也为0。
1.5 吸 光 系 数
吸光系数K物理意义：吸光物质在单位浓度、 单位厚度时的吸光度。
1. 质量吸光系数 c单位g/L，b单位cm，K单位L ·g-1 ·cm-1 A = Kbc
2. 摩尔吸光系数 c单位mol/L，b单位cm，ε单位L ·mol-1 ·cm-1 A = εbc
1.4 光吸收基本定律—朗伯比尔定律
( ✓)1. 朗伯－比耳定律的应用条件：一是必须使
用单色光；二是吸收发生在均匀的介质；三是吸 收过程中，吸收物质相互不发生作用。
(×) 2. 有色物质的吸光度A是透光度的倒数。 (×) 3. 在分光光度分析中，入射光强度与透射光
强度之比称为吸光度，吸光度的倒数的对数为透 光率。
( ✓)1. 如果显色剂有色，则要求有色化合物与显色剂
之间的颜色差别要大，以减小试剂空白值，提高测定 的灵敏度。通常把两种有色物质最大吸收波长之差称 为“对比度”。一般要求显色剂与有色化合物的对比 度在∆λ60nm以上。
( ✓)2. 分光光度法中，可选择不同厚度的比色皿以
控制吸光度在合适范围内。
1.5 吸 光 系 数
摩尔吸光系数ε意义： 1）吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。 3）可作为定性鉴定的参数。 4）同一物质在不同波长下的ε值不同。
示差分光光度法
示差分光光度法示差分光光度法1示差法的原理吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待测定组分浓度过高或过低，亦即吸光度测量值过大或过小时，从上节的测量误差的讨论得知，在这种情况下即使没有偏离朗伯—比耳定律的现象，也会有很大的测量误差，导致精准度大为降低。
采纳示差法可克服这一缺点。
目前重要有高浓度示差法，稀溶液示差法和使用两个参比溶液的精密示差法。
其中以高浓度示差法应用*多，本节将侧重讨论。
示差光度法和一般的光度法不同之处重要在于，示差法不是以空白溶液（不含待测组分的溶液）作为参比溶液，而是采纳比待测溶液浓度稍低的标准溶液作参比溶液，然后测量待测溶液的吸光度，再从测得的吸光度求出它的浓度。
这样便大大提高测定结果的精准度。
设用作参比的标准溶液浓度为cs，待测溶液浓度为cx，且cxcs，依据朗伯—比耳定律得到Ax=εcxbAs=εcsb两式相减：A相对=Ax—As=εb（cx—cs）=εbΔc（2—12）实际操作是：用已知浓度的标准溶液作参比，调整其吸光度为零（透光率100%），然后测量待测溶液的吸光度。
这时测得的吸光度实际是这两种溶液吸光度的差值（相对吸光度）。
从（2—12）式可知，所测得的吸光度差值与这两种溶液的浓度差成正比。
这样便可以把空白溶液为参比的稀溶液标准曲线作为ΔA对应于Δc的工作曲线，依据测得的ΔA找出相应的Δc值，从cx=cs+Δc，便可求出待测溶液之浓度，这就是示差法定量测定的基本原理。
2示差法的误差用示差法测定浓度过高或过低试液，其精准度比一般分光光度法高。
这可从图2—3看出。
设图2—3示差法标尺原理按一般分光光度法用试剂空白作参比溶液，测得溶液的透光率Tx=6%，明显，这时的测量读数误差是很大的。
采纳示差法时，假如按一般分光光度法测得的Ts=10%的标准溶液作参比溶液，使其透光率从标尺上Ts1=10%处调至Ts2=100%处，相当于把检流计上的标尺扩展到原来的十倍（TS2/TS1=100/10=10），这样待测试液透光率原来为6%，读数落在光度计标尺刻度很密，测量误差很大的区域，改用示差法测定时，透光率则是60%，读数落在测量误差很小的区域，从而提高了测定的精准度。
示差分光光度法
示差分光光度法
示差分光光度法是一种在分子取向反应或光谱特性中应用广泛的
分析方法。
首先，示差分光光度法通过比较两种不同取向下的吸收光谱，来
探测反应中的分子结构变化。
通过这种方法，我们可以更好地理解反
应的机理和特性。
其次，示差分光光度法在不同波长或时间段内测量光谱信号，可
以得到很高的灵敏度和分辨率。
这使得该方法在许多不同领域都有应用，如化学、生物学、医学等等。
此外，示差分光光度法还可以用于探测微量物质的存在和浓度变化。
这种方法可以用于监测环境污染、药物代谢等方面。
需要注意的是，示差分光光度法需要设备精细和技术娴熟的操作。
对于初学者来说，需要认真学习理论知识和实验技能，才能获得准确
的测量结果。
总之，示差分光光度法是一种应用广泛、灵敏度高、分辨率高的
分析方法。
在化学、生物学、医学等领域都有广泛的应用前景。
如今，随着技术的不断发展和创新，示差分光光度法将会得到更广泛的应用
和挖掘。
分光光度法
基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，称为吸光光度法。包括：比色法、可见及紫外吸光光度法和红外光谱法。本章重点介绍：可见吸光光度法。在选定波长下，被测溶液对光的吸收程度与溶液中的吸光物质的浓度有简单的定量关系。吸收光波范围是紫外，可见和红外光区。它所测量的是物质的物理性质－物质对光的吸收，测量所需的仪器是特殊的光学电子学仪器，所以光度法不属于传统的化学分析法，而属于近代的仪器分析，这里只是按照我国现行教学习惯把可见光的光度法作为化学分析部分的一章。
(一)朗伯一比耳定律的推导
当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿表面反射。设入射的单色光强度为I0，反射光强度为Ir，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，则它们之间的关系为：
I0=Ir+Ia+It
因为λ射光常垂直于介质表面射λ，Ir很小(约为λ射光强度的4％)又由于进行光度分析时都采用同样质料，同厚度的吸收池盛装试液及参比溶液，反射光的强度是不变的。因此，由反射所引起的误差可校正，抵消。故上式可简化为：
ΔE=hc/λ
这里，ΔE=E2-E1，表示某一能吸级差的能量。由于不同物质的分子其组成与结构不同，它们所具有的特征能级不同，能级差也不同，所以不同物质对不同波长的光的吸收就具有选择性，有的能吸收，有的不能吸收。在电子能级发生变化时,不可避免地也伴随着分子的振动和转动能级的变化.分子光谱又成为带状光谱.
2、溶液有色的原因。
具有单一波长的光称为单色光，在可见光中，通常所说的白光是由许多不同波长的可见光组成的复合光。由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫这些不同波长的可见光按照一定的比例混合得到白光。进一步的研究又表明，只需要把两种特定颜色的光按一定比例混合，就可以得到白光，如绿光和紫光混合，黄光和蓝光混合，都可以得到白光。
实验九 差示分光光度法测定维生素B1片的含量
实验九 差示分光光度法测定维生素B 1片的含量一、实验目的1．掌握差示分光光度法的基本原理。
2．熟悉标准曲线定量的操作方法.二、实验原理(一）差示分光光度法(简称△A 法)，它保留了通常的分光光度法简便、快捷、直接读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰.方法：取两份相等的供试液，分别制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱,改变pH 或在其一中加能与供试品发生某种化学反应的试剂），然后将它们稀释至同样浓度后，分置于样品池和参比池中,于适当波长处，测定吸光度的差值（△A ）。
应用条件：①供试品在不同的化学环境中以不同的分子形式存在,它们的吸收光谱有显著的差异；②干扰物的吸收不受测定时化学环境的影响，光谱行为不变。
定量依据:设x 、y 分别代表在两种不同的化学环境中供试品的存在形式，它们在测定波长处的吸光度以A x 、A y 表示，背景和干扰的吸收度以A Z 表示，A Z 不受测定时化学环境改变的影响。
根据吸光度加和性原则:即在供试液的一定浓度范围内△A 值与其浓度C 呈线性关系,并消除了A Z 的干扰，可用标准曲线法或对照法定量.（二)维生素B 1片的测定维生素B 1分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，其紫外吸收随溶液pH 的变化而变化。
在pH7的磷酸盐缓冲液中具有两个吸收峰，在232~233nm 处，%11cm E =345;在266nm处，%11cm E =255。
在pH2时，最大吸收在246nm 处，%11cm E =425。
可用于维生素B 1片的差示分光光度法的测定.三、实验方法（一）测定波长的选择精密称取维生素B 1100mg ，用水溶解并稀释成100ml ，精密量取2ml 二份，分别用缓冲液（pH 7.0）和盐酸液(pH 2。
0)稀释成100ml ，以相应溶剂为空白，测定紫外吸收光谱。
再将前者放于参比池，后者放于样品池,绘制差示吸收光谱(见图11)。
差示光谱图表明在247nm处有最大差示吸收值(△A)，确定247nm为测定波长。
示差法
要求：
示差法要求仪器光源强度要足够 大，仪器检测要足够灵敏。因为只 有这样的仪器才能将标准参比溶液 调到T%为100%，否则调不到。
进一步ห้องสมุดไป่ตู้
设待测溶液的浓度为Cx，标准溶液为Cs（Cs〈 Cx）， 则有： △A=Ax-As=Ɛb(Cx-Cs)=Ɛb△c 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的 吸光度之差。示差法测得的吸光度与△c呈线性关系。由 标准曲线上查的相应的值，则待测溶液的Cx： Cx=Cs+△C
示差法标尺扩展原理：
示差法
722型可见分光光度计
——高含量组分的测定
微生物11301班 七组
了解：
普通分光光度计一般只适于测定微量组 分。然而，当待测组分含量较高时，其将产 生较大的误差。
思考：采用什么方法才适合于高含量组 分的测量计算？
示差法
示差法又称为示差分光光度法。它与一般 分光光度法区别仅仅在于它采用一个已知浓度 作参比溶液，才大大提高了测定的准确度，使 其用于测定过高含量的组分，所以将这种吸光 度测量方法来扩大测量范围并提高灵敏度和准 确度的方法称之为示差法。
为什么示差分光光度法可以提高测 定的准确度?
吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待 测定组分浓度过高或过低，亦即吸光度测量值过大或 过小时，即使没有偏离朗伯--比尔定律现象。也会有很 大的测量误差，导致准确度大为降低，采用示差法可 克服这一缺点。 示差法和一般的光度法不同之处在 于，示差法不是以空白溶液（不含待测组分的溶液） 作为参比溶液，而是采用比待测溶液浓度稍低的标准 溶液作为参比溶液，然后测量待测溶液的吸光度，从 而测出待测液的浓度，从而大大提高测定结果的准确 度。
紫外吸收光谱分析-下
⑵ 若各组分的吸收曲线互有重
叠，则可根据吸光度的加合性
求解联立方程组得出各组分的
含量。
A1 = Aa1 Ab1 = ea1bca eb1bcb
A2
=
Aa2
Ab2
=
e
a
2
bca
e
b
2
bcb
(3) 吸收光谱单向重叠
•在1处a、b组分都吸收
•在2处b组分吸收，a组分不干扰
T=50.0%, 二者之差为50%。示差法相当于把标尺扩大了10倍，测量读 数的相对误差也就缩小了10倍。此时试液的ΔT＝50％，令读数落在适 宜的范围内，提高了测定的准确度。
示差法的误差
方法
定量原理
相对误差
常规法 Ax = ebcx = lg Tx
dc x = dT
示差法
Tx
=
Ix I0
Ax = ebcx = lg Tr
= (e x 2
e
x
1
)bcx
λ2
测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干 扰组分y无关
选择波长组合λ1 、λ2的基本要求是：
⑴ 选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度，即：
Ax y
= Ax
Ay
=
Ax=
Ax2
Ax1
=
(e
x
2
e
x
1
)bcx
测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而
质的浓度（C）和 液层厚度（l）间的关系的定律，是光吸收的基
本定律，是紫外—可见光度法定量的基础。
I0
Sample (conc. C)
化学分析(试题三)
培训试题（第十三章-第十六章）一、填空(55分)1、紫外可见分光光度法所用的光谱区域为 200～780 nm ，红外光谱法为 2.5～1000 um 。
2、利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质含量的方法就称为比色法。
3、分光光度法特别适用于低含量、微量组分的测定，不适用于高含量组分的测定。
4、由价电子跃进而产生的光谱称为电子光谱。
5、光吸收程度最大处得波长称为最大吸收波长。
6、测量物质分子对不同波长的光的吸收强度的仪器称为紫外可见分光光度计，分光光度计的主要部件包括光源、单色器、吸收池、检测器、测量系统。
7、分光光度计的检测器是一种光电转换设备，它将光强度转变为电讯号显示出来，常用的有光电池、光电管、或光电倍增管。
8、显色反应一般可以分为两类：络合反应、氧化还原反应。
9、分光光度计测定样品时一般控制投射比为 15%～65% ，吸光度为 0.2～0.8 时，测量的相对误差较小，这就是适宜的吸光度范围。
可以采用调节溶液浓度和吸收池厚度来实现。
10、利用紫外分光光度进行定量分析一般不需要选用显色剂，测定条件的选择主要是选择测定最佳波长和溶剂。
11、由分子的振动和转动能级跃迁产生的连续吸收光谱称为分子光谱。
12、红外吸收光谱仪最常用的光源为能斯特灯和硅碳棒。
13、原子吸收光谱与共振荧光光谱互为逆过程。
14、原子吸收光谱仪由光源、原子化系统、分光系统、检测系统 4部分组成。
15、空心阴极灯的工作电流可以采用额定电流的 40%～60% 。
16、火焰原子化器由喷雾器、雾化室和燃烧器 3部分组成。
17、火焰原子化器燃烧器的作用是原子化。
18、采用石墨炉原子化分析过程中灰化是为了除去气体，以减少共存元素的干扰。
19、化学干扰是原子吸收光谱分析中的主要干扰。
20、实现色谱分离的先决条件是必须具备固定相和流动相。
固定相可以是固体吸附剂和涂渍于惰性载体表面上的液态薄膜，流动相可以是具有惰性的气体、液体或超临界流体。
紫外可见分析的应用-定量分析(示差光度法)
定量分析5. 示差分光光度法用普通分光光度法测定很烯或很浓溶液的吸光度时，测量误差都很大。
若用一已知合适浓度的标准溶液作为参比溶液，调节仪器的100％透射比点（即0吸光度点），测量试样溶液对该已知标准溶液的投射比，则可以改善测量吸光度的精确度。
这种方法称为示差分光光度法。
其原因如图13.25所示。
当测定低透射比（高吸光度）的高浓度试液时，用比试液浓度C1稍低的标准溶液C2作参比溶液，这种示差法叫高吸收法；当测定主透射比（低吸光度）的低浓度溶液时，用比试液浓度稍高的标准溶液作参比溶液，这种示差法叫低吸收法；若同时用浓度不同的两种标准溶液（试液的浓度需介于两标准溶液之间）分别调仪器的100%透射比点及零透射比点，这种示差方法叫最精密法。
较常用的时高吸收法，其原理如下：根据吸收定律有则即用C2作参比测得的A为示差法实质上是相当于把仪器的测量标尺放大，以提高测定的精确度。
如果C2以常规法测得的透射比为10％，在示差法用调至透射比为100％，意味着标尺扩大了10倍。
若待测试液以常规法的最终分析法得的透射比为5％，用C2作参比的示差法测得透射比为50％。
示差法的最终分析结果准确度比常规法高，这是因为尽管示差法测出的很小的ΔC，而测得的误差dC也很大，则仍很大，但最终分析结果的相对误差为，Cs是标准参比溶液，Cs相对很大，所相对误差仍然很小。
6. 光度滴定法分光光度滴定法是利用被测组分或滴定剂或反应产物在滴定过程中的吸光度的变化来确定滴定终点，并由此计算试液中被测组分含量的方法。
分光光度滴定曲线是在某一给定波长处在滴定过程中所测得的吸光度与已知浓度的滴定剂体积之间的关系曲线，其曲线的形状取决于反应体系中样品组分、滴定剂或产物的吸光程度，如图13.26所示。
图13.26（a）是用有色滴定剂（其摩尔吸光系数εt>0）滴定含非吸收组分（εs>0）的试液，生成的产物也无吸收（εp＝0），即εt>0，εs=εp=0；（b）是εp>0，εs=εt=0；（c）是εs>0，εp=εt=0；（d）是εs>0，εt=εp=0；（e）是εp >0，εs=εt=0；（f）是εs>0，εp=εt=0。
差示分光光度法含量测定的原理和方法
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