结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化
结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用
结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用王晓玮;程筱雯;张焰;徐东芳;王东萍;韦薇;王庆;徐元宏【摘要】Building a stable method of ELISPOT by the expression and purification of the protein CFP10 and ESAT6 from mycobacterium tuberculosis. 164 suspected tuberculosis cases were checked by ELISPOT and T-SPOT ·TB with peripheral blood samples,compared with the clinical diagnosis. It was found that the concentration and purity of the recombinant ESAT6 were 0. 5 mg/ml,84%;the concentration and purity of recombinant of the CFP10 were 4 mg/ml, 98%. The most appropriate conditions of ELISPOT were 2 × 105/well as cell concentration, 10μg/well ESAT6/CFP10 recombinant protein as stimulus and 20 hours of incubation period. There was no statistically significant difference between ELISPOT and T-SPOT·TB(χ2 =0. 57).%以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比. 表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10 为0. 5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%. ELISPOT方法最佳实验条件为每孔细胞密度2 × 105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10 μg/孔,细胞孵育时间20 h. ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88. 50%、82. 35%,检测结果与 T-SPOT·TB 方法结果一致(χ2 =0. 57).【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2015(050)009【总页数】5页(P1347-1351)【关键词】结核病诊断;γ-干扰素;ELISPOT;CFP10;ESAT6【作者】王晓玮;程筱雯;张焰;徐东芳;王东萍;韦薇;王庆;徐元宏【作者单位】安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥 230022;安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥 230022;安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥 230022;安徽省胸科医院检验科,合肥 230022;安徽省胸科医院检验科,合肥 230022;安徽省胸科医院检验科,合肥 230022;安徽省胸科医院检验科,合肥 230022;安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥 230022【正文语种】中文【中图分类】R446-61结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用王晓玮1，程筱雯1，张焰1，徐东芳2，王东萍2，韦薇2，王庆2，徐元宏1作者单位：1安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥 2300222安徽省胸科医院检验科，合肥 230022作者介绍：王晓玮，女，硕士研究生；徐元宏，男，教授，硕士生导师，责任作者，E mail：xy hong1964＠163．com摘要以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础，建立稳定的ELISPOT方法；检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT，与临床诊断及T SPOT·TB结果对比。
结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定
结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定娄培安;章辉;刘加彬;王晓婷;周艳秋;赵广法;朱荫昌【期刊名称】《中国校医》【年(卷),期】2006(20)1【摘要】目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10,研究其免疫学特性,为结核病的血清学诊断提供物质基础。
方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(+)中,构建pET32c(+)-linker。
PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。
将CFP10克隆入改建的载体pET32c(+)的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(+)linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠肝菌BL21中表达,通过Westernblot分析其抗原性。
结果二个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c(+)的linker前或后。
重组质粒pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。
融合蛋白在BL21菌中高效表达。
Westernblot分析表明,融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。
结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6二种蛋白的抗原性。
本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断的中应用奠定了基础。
【总页数】6页(P1-6)【关键词】CFP-10蛋白(71—85);结核杆菌;6-kDa早期分泌性抗原靶;重组蛋白;血清学检验【作者】娄培安;章辉;刘加彬;王晓婷;周艳秋;赵广法;朱荫昌【作者单位】徐州市疾病预防控制中心;江苏省血吸虫病防治研究所【正文语种】中文【中图分类】R378.911;R392.11【相关文献】1.结核分枝杆菌14 000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析 [J], 杨柳;苏明权;岳乔红;程晓东;马越云;郝晓柯2.四种结核分枝杆菌特异性抗原的克隆表达与血清鉴定 [J], 徐磊;李慧云;马立恒3.结核分枝杆菌Rv3871抗原优势肽段的克隆表达及抗原性鉴定 [J], 郄霜;戴振华;杨锡琴;修冰水;陈堃;郭兰芹;冯晓燕;张庆波;张贺秋4.牛结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83基因的串联表达及其抗原性鉴定 [J], 布日额;陈金龙;叶俊;吴金花;锡林高娃;王金良5.重组结核分枝杆菌特异性分泌抗原融合蛋白的活性鉴定及初步应用 [J], 娄培安;章辉;李玲;刘加彬;王晓婷;周艳秋;赵广法;朱荫昌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达
结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达陈雪倩;方诗宇;于江;段绍琪;孙杰;刘凤君【期刊名称】《川北医学院学报》【年(卷),期】2024(39)1【摘要】目的:探究结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达。
方法:收集经病理学诊断的19例石蜡包埋肺结核组织标本,以20例正常肺组织(肺癌切除标本正常组织断端)为阴性对照,采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10,并与抗酸染色进行对比。
结果:ESAT-6及CFP-10的阳性信号主要分布在结核病灶的坏死区域及其周围的巨噬细胞和多核巨细胞中,其分布与抗酸杆菌有关,范围更广。
免疫组化检测ESAT-6的敏感度、特异度分别为73.68%、90.00%;CFP-10的敏感度和特异度分别为63.16%和95.00%;抗酸染色敏感度为52.63%,免疫组化的敏感度高于抗酸染色(P<0.05)。
结论:采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10在结核诊断中有潜在的应用价值。
【总页数】4页(P18-21)【作者】陈雪倩;方诗宇;于江;段绍琪;孙杰;刘凤君【作者单位】川北医学院附属医院感染科【正文语种】中文【中图分类】R521【相关文献】1.以ESAT-6、CFP-10为基础的ELISPOT试验、血清TB-SA抗体检测、PPD试验在肺结核诊断中应用价值研究2.复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核辅助诊断中的价值3.结核菌特异性抗原ESAT-6及CFP-10在肺结核及肺炎患者中的诊断价值4.结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达5.结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10及rCFP10-ESAT6融合基因在大肠埃希菌中的表达及比较因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备
用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备郭芳芳;邹立林;吴英松;胡志明;李金龙;吕建新;高基民【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2011(031)006【摘要】目的通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)、链亲和素(SA),CFP10融合蛋白(包括SA-CFP10、CFP10-SA),筛选灵敏度最高、稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测(TRFIA)的参考标准品.方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组为模板,扩增CFP10基因,将其克隆到pET24b、pET24b-SA、pET21a-SA三种载体中,转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达,表达产物经镍离子亲和层析(Ni-NTA)柱纯化,透析法复性.三种重组蛋白用双抗体夹心法TRFIA从灵敏度、稳定性两方面进行评价.结果成功构建了pET24b-CFP10、pET24b-SA-CFP10和pET21a-CFP10-SA三种表达载体,重组蛋白CFP10主要为可溶形式表达,融合蛋白CFP10-SA、SA-CFP10均以包涵体形式存在,Ni-NTA柱纯化后透析复性,纯度均可达90%以上.三种重组蛋白经双抗体夹心TRFIA,CFP10-SA灵敏度最高(0.02μg/L),稳定性最好.结论得到了灵敏度高、稳定性好的TRFIA 检测CFP10的参照品CFP10-SA融合蛋白,为研制该结核分支杆菌时间分辨荧光诊断试剂盒,并应用于临床打下了基础.%Objective To prepare reference samples of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate protein-10 (CFP-10) and CFPlO-streptavidin fusion proteins (CFP10/SA) for time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA). Methods The CFP10 gene was amplified by PCR from Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv and cloned intopET24b, pET24b-streptavidin (SA) or pET21a-SA expression vectors. The recombinant proteins CFP10, CFP10-SA and SA-CFP10 were expressed in Rosetta cells, purified via nickel affinity chromatography and refolded by dialysis. The sensitivity and stability of the resultant proteins as reference samples were evaluated by double-antibody sandwich TRFIA. Results CFP10-SA and SA-CFP10 fusion proteins were expressed as inclusion bodies, whereas CFP10 was expressed in a soluble form. The resultant purity of the 3 recombinant proteins all exceeded 95%. TRFIA results showed that CFP-SA fusion protein possessed the best sensitivity (0.02ug/L) and stability. Conclusion The reference samples of CFP10 for TRFIA detection have been successfully prepared and can be used in the development of a diagnostic kit for Mycobacterium tuberculosis.【总页数】5页(P955-959)【作者】郭芳芳;邹立林;吴英松;胡志明;李金龙;吕建新;高基民【作者单位】南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所,广东,广州,510515;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室/浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江,温州,325035;南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所,广东,广州,510515;南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所,广东,广州,510515;南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所,广东,广州,510515;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室/浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江,温州,325035;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室/浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江,温州,325035【正文语种】中文【中图分类】R318.13【相关文献】1.结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白的制备和应用 [J], 都伟欣;杨蕾;苏城;沈小兵;徐苗;卢锦标;王国治;陈保文2.结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化 [J], 谢富佳;谭继英;梁正羽;乔梅;祝秉东;吴玉敏;杨燕;章国平3.结核分枝杆菌和4种缓慢生长非结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白分析 [J], 曹翌明;孟繁荣;谢贝;蔡杏珊;黄业伦;牛群;雷杰;高俊文;谭耀驹4.结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌培养滤液、胸腔积液和血清蛋白质组分析 [J], 刘志辉;彭德虎;孟繁荣;谢贝;牛群;雷杰;高俊文;张言斌;谭守勇5.结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定 [J], 江鹰;尚淑琴;赵勇;毛峰峰;赵善民;张彩勤;师长宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
结核分枝杆菌腺苷磷酰硫酸激酶的异源活性表达和酶学性质
结核分枝杆菌腺(磷酰硫酸激酶的异源活性表达和酶学性质胥睿睿1,王阳1,史仲平"12，康振12(1.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；2.江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)摘要：PAPS是生物体内磺化反应的惟一活性磺酸基团供体。
腺+磷酰硫酸激酶是催化APS和ATP生成PAPS和ADP的一类酶。
为实现PAPS的酶法合成，作者通过密码子优化来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis AUSMDU00018547%的腺+磷酰硫酸激酶编码基因与共表达硫氧还蛋白TrxB，实现了腺+磷酰硫酸激酶在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的异源高活性表达&采用His-Tag标签实现了对腺+磷酰硫酸激酶的纯化，进一步酶学性质分析结果表明，重组腺+磷酰硫酸激酶最适温度、最适pH以及比酶活分别为35"/7.5和(1.26±0.08)U/mg。
腺+磷酰硫酸激酶的异源活性表达与酶学性质分析为未来实现酶法合成PAPS奠定了基础&关键词：PAPS:腺+磷酰硫酸激酶；结核分枝杆菌；活性表达；活性分析中图分类号:Q814文章编号:1673-1689(2021)02-0049-08DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2021.02.007Heterologous Expression and Enzymatic Characterization of Adenylyl-Sulfate Kinase from Mycobacterium tuberculosis*1,2,KANG Zhen1#2XU Ruirui1,WANG Yang1,SHI Zhongping(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.Key Laboratory of CarbohydrateChemistry and Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China)Abstract:PAPS is the only active sulfonic acid group donor for sulfation in living organisms.Adenylyl-sulfate kinase catalyzes the formation of PAPS and ADP from APS and ATP.In order toachieve the enzymatic synthesis of PAPS,the adenylyl-sulfate kinase encoding gene fromMycobacterium tuberculosis AUSMDU00018547was codon-optimized and heterologouslyco-expressed with thioredoxin TrxB to achieve the active and high-level heterologous expression ofadenosine phosphorylsulfate kinase(APK)in Escherichia coli BL21(DE3).His-tagged recombinantadenylyl-sulfate kinase was successfully purified.Further enzymatic property analysis results showedthat the optimal temperature,pH and the specific enzyme activity of recombinant adenylyl-sulfatekinase were35°C,pH7.5and(1.26±0.08)U/mg,respectively.Heterologous expression of收稿日期：2020-02-09基金项目：国家&十三五’重点研发计划项目(2018YFA0901401)；国家轻工技术与工程一流学科自主课题(LITE2018-16)。
结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析
结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析陈曦;古淑香;贾红彦;李自慧;郑小静;刘忠泉;邢爱英;杜博平;张继增;张宗德【期刊名称】《结核病与胸部肿瘤》【年(卷),期】2009(000)004【摘要】目的构建结核分枝杆菌rv1837c．rv3803c基因原核表达重组质粒，进行表达、纯化，并分析其免疫原性。
方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rvrv1837c．rv3803c基因，并克隆入pTA2质粒。
测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c 重组体。
然后转化人表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），经0．4mmol／L异丙基硫代-β—D-半乳糖苷诱导1分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western—blot，鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。
经镍离子螯和氮川乙酸一组氨酸标签亲和树脂纯化，将纯化的重组蛋白分别免疫家免，取兔血清与纯化蛋白通过Western-blot方法，检测家兔血清中的抗体。
结果pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白，表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量分别占全菌蛋白质的30％及50％。
获得纯度为90％的重组蛋白。
纯化蛋白通过Western-blot鉴定证实为目的蛋白，有较强的免疫原性。
结论成功构建原核表达重组质粒pET30a （＋）：rv1837c,pET30a（＋）：rv3803c，并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白，为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。
【总页数】7页(P254-260)【作者】陈曦;古淑香;贾红彦;李自慧;郑小静;刘忠泉;邢爱英;杜博平;张继增;张宗德【作者单位】北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室【正文语种】中文【中图分类】R378.911【相关文献】1.结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定[J], 王晓闻;蔡宏;朱玉贤2.结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定 [J], 蔡宏;潘怡;汪竟;朱玉贤3.结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析 [J], 陈曦;张宗德;古淑香;贾红彦;李自慧;郑晓静;刘忠泉;邢爱英;杜博平;张继增4.结核分枝杆菌三种分泌蛋白在原核表达载体中的克隆、表达与鉴定 [J], 蔡宏;潘怡;汪竟;朱玉贤5.结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 [J], 宫强;刘思国;王牟平;王春来;彭永刚;沈国顺因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化
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技
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谢 富佳 谭继 英 ， 正羽 ， ， 梁 乔 梅 祝 秉 东 吴 玉敏。。杨 燕 章 国平。 ， ， 。， 。 ，
摘 要 ： 目的 构 建 结 核 分 枝 杆 菌 培 养 滤 液 蛋 白 ２ Ｃ ｌ ｒ ｉｒｔ ｐｏｅ １ Ｆ ２ ） 核 表 达 载 体 ， 得 Ｃ Ｐ １蛋 １（ ｕｔ ｅｆｔａｅ ｒｔｉ ２ ，Ｃ Ｐ １ 原 ｕ ｌ ｎ 获 Ｆ２ 白。 方 法 以结 核 分 枝 杆 菌 Ｈ。Ｒ ｖ株 基 因 组 Ｄ ＮＡ 为 模 板 ， Ｃ 扩 增 ｃｐ ｌ基 因 ， 粒 Ｐ Ｔ２ ａ（＋ ） 表 达 载 体 ， 建 ＰＲ ｆ２ 质 Ｅ ８ 为 构
要 以包 涵 体 形 式存 在 。 结论 目 的 基 因 克 隆 入 宿 主 菌 中 并 表 达 成 功 ， 化 得 到 Ｃ Ｐ １蛋 白 ， Ｃ Ｐ ｌ的 进 一 步 研 究 奠 定 纯 Ｆ２ 为 Ｆ２
基础 。
关键 词 ： 核 分 枝 杆 菌 ； Ｆ ２ ； 因克 隆 ； 白表 达 ； 化 结 Ｃ Ｐ １基 蛋 纯
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中 国 人 兽 共 患 病 学 报
２ ｌ， ２７ （ ０ｌ ２）
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文 章 编 号 ：０ ２ ６ ４ ２ １ ）２ １７ ３ １０ —２ ９ （０ １０ —０ １ —０
结核分枝杆菌培养滤液蛋 白 ２ （ Ｆ ２ ） １ Ｃ Ｐ １ 的基 因克 隆 、 达 及 纯 化 ＊ 表