结核分枝杆菌基因组学
结核分枝杆菌pst S1基因的扩增及生物信息学分析
结核分枝杆菌pst S1基因的扩增及生物信息学分析目的扩增编码结核分枝杆菌分泌蛋白的pst S1基因，运用生物信息学方法和软件预测其编码蛋白的生物学特征，为早期结核病的诊断以及新的抗结核药物的研制奠定基础。
方法采用聚合酶链反应扩增出pst S1基因，对其核苷酸序列进行测定；利用序列对比分析和蛋白质结构预测软件进行生物信息学分析和模拟。
结果获得的pst S1基因的全长1112bp，基因序列与Genbank公布的标准株的基因序列的核苷酸同源性为92.6%，初步预测出该蛋白的分子特征、抗原性和二级结构。
结论成功扩增MTB的pst S1基因，通过生物信息学分析获得了该蛋白的信息特征，为进一步研究其生物学功能和免疫学活性奠定了基础。
标签：结核分枝杆菌；pst S1基因；扩增；生物信息学结核病（Tuberculosis，TB ）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）所致的、以呼吸系统感染为主的慢性传染病。
世界卫生组织全球结核病疫情报告表明，当前结核病已成为可治性感染疾患中头号致死疾病[1]。
到目前为止对结核分枝杆菌的研究已经发现了很多特异性的抗原，但还没有一个单抗原能达到WHO对结核诊断抗原的阳性率要求，即总阳性率大于80%，特异性大于95%[2]。
动物实验表明，结核分枝杆菌分泌蛋白Pst S1是比较重要和相对特异的一种抗原，可引起特异的保护性免疫反应。
因此，可用作亚单位疫苗。
本研究对pst S1基因进行扩增，利用生物信息学方法对该基因进行分析，为构建新型结核疫苗、制造诊断试剂和设计药物靶点提供理论依据。
1材料和方法1.1材料DNA标准分子量marker、2×PCR Master Mix、细菌基因组提取试剂盒、DNA 电泳凝胶回收试剂盒购自Promega公司，Agarose购自西班牙，其他试剂均为国产分析纯，结核分枝杆菌为潍坊市第二人民医院患者体内分离。
1.2方法1.2.1 引物的设计根据GenBank报道的结核分枝杆菌pst S1基因序列，自行设计特异性引物，序列如下：P1：gtggaattcgtgaaaattcgtttgcat；P2：atactcgaggctggaaatcgtcgcgat。
结核分枝杆菌VII型分泌系统的研究进展
ｓｉｓ）中，有些蛋白（如Ｔ细胞抗原Ａ９８５）含有典型的 ｒｉｎｕｍ）和非致病性分枝杆菌耻垢分枝杆菌（Ｍ．
信号肽序列，这些蛋白的分泌通过Ｓｅｅ途径进行，还 ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）中也发现了ＥＳＸ一１分泌系统。
有一些蛋白则通过Ｓｅｃ２旁路途径或者Ｔａｔ途径进 ２ ＥＳＸ一１系统的组成及分泌机制
行分泌。然而在结核分枝杆菌的培养滤液中含有很
遍认为ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥＡＳＴ一６、ＣＦＰ一１０、ＭｙｃＰｌ、
蛋白的代表。结核分枝杆菌具有十分复杂的细胞壁ＰＥ３５、Ｒｖ３６１４ｃ、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３８６８、Ｒｖ３８６９、
结构（图１），分枝菌酸和细胞壁基质共价结合，形成 Ｒｖ３８７０、Ｒｖ３８７１、Ｒｖ３８７７、Ｒｖ３８７９ｃ和Ｒｖ３８８２ｃ等
中国人兽共患病学报
７７２
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ
文章编号：１００２—２６９４１２０１０）０８—０７７２—０４
２０１０。２６（８）
结核分枝杆菌ＶＩＩ型分泌系统的研究进展＊
孙林，霍如松，焦新安
中图分类号：Ｒ３７８．９ 文献标识码：Ａ
细菌的致病性依赖于分泌毒力因子的能力，这
１ ＥＳＸ．１分泌系统
着一种特殊的分泌系统。
酶，Ｒｖ３８７０和Ｒｖ３８７１可能共同形成ＦｔｓＫ／Ｓｐｏ Ｉｌｌ Ｅ
类ＡＴＰ酶。其他参与ＥＳＸ—１分泌系统的蛋白质，
如Ｒｖ３８６９、Ｒｖ３８７７、Ｒｖ３８８１Ｃ以及Ｒｖ３８８２，它们与
已知功能的蛋白之间没有同源性，但预测其存在于
细胞质膜上。例如。Ｒｖ３８７７是一种多重跨膜蛋白，
不同的ＥＳＸ分泌系统之间是相互独立的，彼此 之间不能互补。ＥＳＸ一１被删除后，另外的４种ＥＳＸ 系统并没有使结核分枝杆菌的毒力得到恢复。 ＥＳＸ一５和ＥＳＸ一１一样，都参与了结核分枝杆菌从巨 噬细胞的逃逸以及细胞间的传播＝１“１４３，这就意味着 这两种分泌系统在细胞的感染过程中可能扮演独立 的角色。ＥＳＸ分泌系统的相互独立，可能是由于它 们不同的进化水平以及基因调控引起的。 ５其他革兰氏阳性菌的ＶＩＩ型分泌系统
结核分枝杆菌H37Ra的A级β-内酰胺酶的克隆和基因序列分析
结核分枝杆菌H37Ra的A级β-内酰胺酶的克隆和基因序列分析CORINNE J. HACKBARTH,* IBRAHIM UNSAL,† AND HENRY F. CHAMBERS 圣弗朗西斯科,加利福尼亚大学，医学部门杂志名称：ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, May 1997, p. 1182–1185影响因子：4.802摘要背景：来自于结核分枝杆菌H37Ra的粘粒文库被导入耻垢分枝杆菌，8个重组克隆显示出对于头孢西丁抵抗性的增加。
方法：等电点聚焦检测到结核分枝杆菌衍生的β-内酰胺酶在其中的一个重组克隆体中。
结论：基因序列分析证实出作为A类的β-内酰胺酶与抵抗表型增多有关。
前言随着结核分枝杆菌株的多重耐药的抵抗出现，新的有效的治疗方法急需来解决这种菌株引起感染的情况。
很少有动力去检查β-内酰胺类抗生素抗分支杆菌的效果，因为（i）最初发现β-内酰胺类抗生素治疗肺结核没有效果而且结核分枝杆菌也显示出产生β-内酰胺酶的特性。
然而，在近十年，β-内酰胺类稳定性药物已经产生，还有β-内酰胺类药物和β-内酰胺酶抑制剂组合制品都在体外的敏感性测定的试验中对结核分枝杆菌的抑制起到有效的作用。
是否体外敏感性试验的数据能预测临床上的效果不得而知，因为还没有相关于临床的研究。
这种类型的药物因为它的潜在的作用而需要重新的考虑，以便作为治疗结核病的治疗手段。
关于结核分枝杆菌抵抗β-内酰胺类抗生素的机制的研究是评价β-内酰胺类药物潜在效果的关键。
根据Bush的分类法等，将该酶分为A类和2b组的β-内酰胺酶。
它有青霉素酶和头孢菌素酶的活性，能够被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸，舒巴坦，他唑巴坦所抑制。
我们先前证明过β-内酰胺类抗生素在血清浓度达到一定浓度时其能够穿透结核分枝杆菌的细胞壁然后绑定到它们的目标蛋白上，即青霉素结合蛋白。
另外，我们还证明了氨苄西林，阿莫西林，头孢西丁和头孢曲松的MIC值均有所降低，当加入克拉维酸或舒巴坦。
结核分子生物学
结核分子生物学
结核分子生物学是一门研究结核病的分子机制和生物技术的学科。
它主要关注结核病的病原体——结核分枝杆菌的基因结构、基因表达、遗传变异等方面。
通过对结核分枝杆菌的基因组研究，科学家们可以更好地了解结核病的发病机制、传播方式以及耐药机制。
分子生物学技术如 PCR（聚合酶链式反应）、DNA 测序等，可以快速、准确地检测结核分枝杆菌的存在和耐药情况，为结核病的早期诊断和个体化治疗提供了有力的工具。
此外，结核分子生物学还研究结核分枝杆菌与宿主之间的相互作用。
宿主的免疫应答、基因多态性等因素也会影响结核病的发生和发展，通过对这些因素的研究，可以深入了解结核病的免疫病理学，为结核病的预防和免疫治疗提供新的思路。
在结核病的防控方面，结核分子生物学也发挥着重要作用。
例如，通过基因分型技术可以追溯结核病的传播链，及时采取措施控制疫情的传播。
同时，分子生物学还可以用于结核病疫苗的研发，通过对结核分枝杆菌的抗原基因进行研究和改造，开发出更有效的疫苗。
总的来说，结核分子生物学的发展为结核病的研究和防治提供了新的手段和方法，有助于提高结核病的诊断、治疗和防控水平，为最终消除结核病的危害做出贡献。
基因组学在结核病研究上的应用
基因组学在结核病研究上的应用基因组学是研究一个生物个体的所有基因组的科学领域。
在结核病研究中，基因组学的应用已经取得了重要的突破，为我们更好地了解这种疾病的传播和抗药性提供了重要的见解。
首先，基因组学在结核病研究中的一个重要应用是帮助我们理解结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的基因组特征。
通过对结核分枝杆菌的基因组进行测序和比较，科学家们发现了一些与其致病性和耐药性相关的基因。
这些发现有助于揭示结核病的传播机制和耐药机制，并为寻找新的治疗方法提供了线索。
其次，基因组学还可以用于研究结核病的传播路径和流行病学。
通过分析结核菌株的基因组，科学家们能够确定不同株系之间的遗传关系，从而了解结核病的传播途径和流行病学特征。
这对于制定针对结核病的预防和控制策略非常重要。
此外，基因组学还可以用于研究结核病的宿主遗传因素。
人类个体的基因组差异可能影响其对结核病的感染和发展程度。
通过对大规模的人类基因组数据进行分析，科学家们发现了一些与结核病易感性相关的基因。
这有助于理解个体对结核病的抗性和易感性差异，为个性化预防和治疗提供了新的思路。
最后，基因组学还可以用于研究结核病的耐药性机制。
结核病的耐药性是治疗该病时面临的重要挑战之一。
通过对耐药结核分枝杆菌的基因组进行分析，科学家们可以揭示耐药机制，并帮助开发更有效的治疗策略。
总而言之，基因组学在结核病研究中的应用已经取得了重要的进展。
通过揭示结核分枝杆菌的基因组特征、研究传播途径和流行病学特征、探索宿主遗传因素以及揭示耐药机制，基因组学为我们更好地了解和控制结核病提供了重要的见解。
这些研究成果有望在预防、诊断和治疗结核病方面产生深远影响。
结核分枝杆菌的分子生物学检测研究进展
第17卷 第3期医学研究生学报Vol.17 No.3 2004年3月Journal of Medical Postgraduates Mar.2004·综 述·结核分枝杆菌的分子生物学检测研究进展李子玲1综述, 刘忠令2审校(1.第二军医大学南京临床医学院南京军区南京总医院呼吸内科,江苏南京210002;2.第二军医大学长海医院呼吸内科,上海200433)摘要: 该文对用于结核分枝杆菌菌种及菌株鉴定的基因标记和序列作一综述。
这些基因标记和序列包括插入序列、串联重复序列、存在于质粒p TBN12中的多态性GC丰富的重复序列、36bp顺向重复序列、间隔子寡核苷酸等。
关键词: 结核分枝杆菌; 分枝杆菌; 检测中图分类号: R378.911 文献标识码: A 文章编号: 100828199(2004)0320267203ΞThe advance about study of molecular biology detection of Mycobacteria tuberculosisL I Z i2ling review ing,L IU Zhong2ling checking(1.Depart ment of gerontology,N anjing Clinical School of the Second Military Medical U niversity/N anjing General Hospital of N anjing Com m and,N anjing210002,Jiangsu,China;2.Depart ment of Pul monology,Changhai Hospi2 tal,the Second Military Medical U niversity,S hanghai200433,China)Abstract: This article reviewed the gene markers and the sequences for the detection of the s pecies and strains of My2 cobacteria tuberculosis.The gene markers and the sequences conclude insertion sequences,tandem repeat sequences,the polymorphic GC2rich repetitive sequences contained in the plasmid p TBN12,36bp direct repetitive sequences,spacer oligonucleotides.K ey w ords: Mycobacteria tuberculosis; Mycobacteria; Detection0 引 言 随着结核病的全球性复燃,结核分枝杆菌(M·tubercu2 losis)的菌株鉴定已成为结核病流行病学研究的重要方法。
结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与序列分析
２１ 年 第 ７ ００ 期
２６ ６ ｗｗｗ．ｄ ｈ ｍ ．Ｏｎ ｇ ｃ ｅ Ｃ Ｉ
第 Байду номын сангаас 卷 总第 ２ ７ ７ ０ 期
结核分 枝杆 菌 Ｅ Ａ 一 Ｓ Ｔ ６基 因的克 隆 与序 列分 析
曲 宁， 元 宝， 立 英 金 王
（ 吉林 大学 珠 海学 院 化 学与药 学系 ，广东 珠海 ５ ９ ４ ） １０ １
Ａｂｓｒ ｃ ：Ａｉ ｅ ｏ ｃｏ ｅ ａ ｄ ａ ａｙ ｅｏ Ａ － ｎ ｔＭ ｙ ｏ ａ ｔ ｒｕ ｔａ ｔ ｍ ｄ ｔ ｌ ｎ ｎ ｎ ｌ ｓ ｌＥＳ Ｔ ６ Ｇｅ ｅ ｏ＂ ｃ ｂ ｃ ｅｉ ｍ Ｔａ ｉ ｇ ｔ ｅ Ｍ ｙ ｏ ａ ｔ ｒ ｍ ｕ ｅ ｃ ｌ ｓｓ ｇ ｎ ｒ ｕ ｓ ｔ ｅｔ ｍｐｌｔ，ｂ ａｎ ． ｅ ｋ ｎ ｈ ｃ ｂ ｃｅ ｉ ｕ ｔ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ｅ ｅ ｇ ｏ ｐ ａ ｈ ｅ ａ ｅｏ ｔ ｉｓ Ｔｈ Ｅ ＡＴ一 ｅ ｅ ｓｎ ｈ ＣＲ ｅｈ ｄ ａ ｄ ｃ ｎ ｔｕ ｔ ｔ ｈ ｅ ｔ ｒｐ Ｅ — ｏ ｌｄ ｔ ｅ ｃ ｎ ｏ ｍ ｉ ａ ｅ ｉｌ ａ ｔ ｌ，ｔｅ ｒ ｎ ｆ ｒ ｅ ｈ ｉ ａｉ ｎ ｐ ｏ ｕ ｔｉ ｔ Ｓ ６ ｇ ｎ ｓｕ ｉ ｇ ｔ ｅ Ｐ ｍ ｔ ｏ ｎ ｏ ｓ ｃｓ ｏ ｔ ｅ ｖ ｃｏ Ｇ Ｍ Ｔ ｆ ｍ ｅ ｈ ｏ ｆ ｒ ｔ ｍ ｔ ｒ ｒｉ ｅ ｈ ｎ ｔａ ｓｏ ｍ ｄ ｔ ｅ ｌ ｔ ｒ ｄ ｃ ｎ ｏ ｒ ｙ ａ ｐ ｃ ｇ ｏ Ｅ ｃ ｌ Ｊ １ ９ Ｕｓｎ ｈ ｅｈ ｄ ｏ ｓｒｃｉ ｎ ｅ ｄ ｎ ｃｅ ｅ Ｃ ａ ｄ ｓ ｑ ｅ ｃｎ ｏ ｐ ｏ ｅ ｔ ａ ｔ ｅ ＥＳ － ｅ ｅｏ ｙ ｏ ａ ｔ ｒ ｍ ｕ ｅ ｃ ｌｓｓ ｈ ｄ ｂ ｅ ｌ ｎ ｄ ．ｏ ｉ Ｍ ０ ． ｉｇ ｔｅ ｍ ｔ ｏ ｆｒ ｔｉｔ ｎ ｏ ｕ ｌａ ，Ｐ Ｒ ｎ ｅ ｕ ｎ ｉ ｇ ｔ ｒ ｖ ｈ ｔ ｈ ＡＴ ６ ｇ ｎ ｆＭ ｃ ｂ ｃｅ ｉ ｅ ｏ ｓ ｕ ｔ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ａ ｅ ｎ ｃｏ ｅ ｓ ｃ ｅ ｓ ｌ ｅＥ ＡＴ ６ ｇ ｎ ｆＭ ｙ ｏ ａ ｔｒｕ ｔ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ａ ｅ ｎ ｃｏ ｅ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｕ ｃ ｓ ｆ ｙ Ｔ Ｓ － ｅ ｅｏ ｕｌ ｈ ｃ ｂ ｃｅ ｉ ｍ ｅ ｃ ｌ ｓ ｈ ｄｂ ｅ ｌ ｎ ｄｓ ｃ ｅ ｓｕ ｌ ｕ ｓ ｙ
结核分枝杆菌mpt64基因真核表达载体的构建及表达
核表达 载体 ｐＤ Ａ ， （） ｃ Ｎ ３ １ 一 由本 室保存 ； 主要试剂 ：
ｍｔ ｐ６ ４蛋 白抗 体 由本 实 验 室 制 备 ； ＭＶ、 Ｎ 酶 抑 Ａ Ｒ Ａ 制剂 和 Ｔ Ｉｏ为 ｐｏ ｅａ公 司产 品 ； Ｒｚｌ ｒｍ ｇ 限制性 内切 酶 、 Ｔ Ｎ ４Ｄ Ａ连 接酶 和核 酸分 子 量标 准 品 由 Ｔｋｒ 司 ａａａ公 提供 ； 粒 提 取 试 剂 盒 购 自 Ｏ Ｇ 质 ＭＥ Ａ公 司 ；脂 质 体 Ｌｐｆ ｔ ｎ２０ ｉ ｅ ａ ｅ００购 自 Ｉｖｔ ｇｎ公 司 ； 抗 鼠 ＦＴ ｏ ｃ ｍｉ ｎｉｏｅ ｒ 羊 ＩＣ 荧光 抗体 购 自北京 中杉公 司 。
２０ ０ ６年 ｌ １月 １ ４日收到 国家 自然科学基 金 （０ ０ ４ ２ 、 ３ ５ ０ ３ ）
取保 存 于改 良罗 氏培 养 基 的 ＭＴ 接 种 于 ７ ９ Ｂ， Ｈ 液 体培养 基 （ 内含 终 浓度 ００ ％的 Ｔ ｅｎ０ 终 浓度 ，５ ｗ ｅ８ ， 为 １％ 的 Ａ Ｃ营养物 ）３ ｃ ０ Ｄ ，７Ｃ间或振 荡培 养 （— ３ ２ ） 周 。取 ５ ｍＬ液 体 培 养 物 以 １ ０ ／ ｎ离 心 ０ ０ ０ ｒｍｉ １ ｉ， ０ｍｎ 将沉 淀重 悬 于 ５ ０ 裂解 液 （０×Ｐ Ｒ缓 冲 １ Ｃ
物实验 表 明 ， Ｂ培 养滤 液蛋 白 （ｕｔｒ ｆｔ ｔ ｐｏ ＭＴ ｃｌ ｅｉ ｒ ｅ ｒ— ｕ ｌａ ｔｉｓ， Ｆ 如 ｍ ｔ 、 Ｓ Ｔ６ Ａ ８ ｅｎ Ｃ Ｐ） ｐ６ Ｅ Ａ －、 ｇ５复合 体 、 Ｔ ２ ４ ＭＰ ３
ＭＴ ３ Ｒ Ｃ Ｓ ＢＨ ７ ｖ、 Ｏ ＿７细 胞 由本 实 验 室保 存 ； 真
统感染为主的慢性传染病 。目前全球有 １３ ／ 的人 口 感染 Ｍ０
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序列(mycobacterial
interspersed
repetitive
unit,MIRU),直接重复序列(Direct repeat,DR)。
IS6110 RFLP DNA fingerprinting
IS6110属于IS3家族。IS6110是结核杆菌基因组 中最常见的IS序列，也是目前研究比较清楚的 IS序列。在不同株细菌中，IS6110的拷贝数变 化很大，从0个到超过25个，这种差别是利用IS 6110进行菌型鉴定的基础。
Rv1347c – acyltransferase
Rv2238c – AhpE
Pa2754 = Rv1720c
Pa2307 = Rv3735
Pa1218 = Rv0820
What is an operon?
An operon is a set of genes that are:
•located on the same DNA strand
Cole et al. (1998) Nature 393: 537-544
The Structure of DNA
Figure 1. Schematic diagram of sequencing strategy used by the publicly funded Human Genome Project. The DNA was cut into 150 Mb fragments and arranged into overlapping contiguous fragments. These contigs were cut into smaller pieces and sequenced completely.
• coded in the same direction •adjacent to one another
•transcribed/expressed together
Why predict operons? Knowing the operons of a genome helps researchers better understand its organization. If researchers know how one of the genes in the operon functions, they can be confident that the other genes in the operon function in a similar manner. A better understanding of the M. tuberculosis genome will lead to better treatment.
更好的了解疾病的发病机制 开发新型的更为有效的治疗措施
开发或改良疫苗
How to find function?
1. Multiple sequence alignment
• Conserved Asp and Glu residues
2. “Unknowns”
Rv2874 (DsbD) – EM domain
在 H37Rv基因组中已发现约 4000个开放 阅读框，约占细菌编码能力的 91 ％。通过
数据比较，现已确定了约40%的结核杆菌蛋
白的功能；另有44%的蛋白与其他蛋白有相
似性或可以获得其功能相关信息；剩余的
16%的蛋白与其他已知蛋白没有相似性，可 能是分枝杆菌特有的功能蛋白。
为什么要研究基因功能?
M. tuberculosis genome sequence
常用的基因分型技术的遗传学背景
RFLP Spolgotyping
MIRU-VNTR
基因组中的重要的结构序列-- 重复序列
结核杆菌基因组中存在重要的重复序列:插入序列
(insertion sequence, IS)，以及分枝杆菌分散重复
根据结核分枝杆菌基因组中存在插入序列 IS6110的数目和位置不同，利用限制性内切酶 切割IS6110上相应位点并电泳分离，可以得到 类似指纹（Fingerprinting）样的特征性条带， 这些条带被称为IS6110 RFLP DNA指纹，该项 技术为研究结核分枝杆菌基因分型奠定了基础。
Chromosome of Mycobacterium tuberculosis Hypothetical Strain X and Genotyping of M. bovis Bacille Calmette–Gué rin (BCG), the M. tuberculosis Laboratory Strain H37Rv, and Strain X on the Basis of IS6110 Insertion Sequences and Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRUs).
结核分枝杆菌的基本特征
H37Rv的全基因组由4 411 52枝杆菌蛋白质在氨基酸组成上存在偏 向性。H37Rv基因组中基因分布密度是平均1.1Kb 长度有一个基因，这一数值与大多数原核生物的 基因密度接近。与其他快生长的细菌如枯草杆菌 不同的是：H37Rv基因方向没有明显的偏向性， 59%的基因转录方向与复制叉移动方向相同，而 这一数值在枯草杆菌为75%。
Figure 2. Schematic diagram of sequencing strategy used by Celera. The DNA was cut into small pieces and sequenced completely. These fragments were organized into contigs based on overlapping sequences.
结核分枝杆菌基因组学
黄 海荣
国家结核病参比实验室
提
纲
一、结核分枝杆菌基因组总论
二、目前一些相关实验室技术的遗传学背景
1 基因分型技术
2 耐药的分子生物学诊断
3 新近的新疫苗、免疫诊断技术\
Genome of M. tuberculosis
MoreThan 4,000 genes Maps of other spp. nearly identical