细胞的抗原表位研究方法

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牛羊乳α-酪蛋白的B细胞抗原表位预测及免疫反应性分析

牛羊乳α-酪蛋白的B细胞抗原表位预测及免疫反应性分析薛海燕;韩波;李珊;操歌【摘要】牛羊乳的α-酪蛋白营养功能相似,但蛋白质亚类结构和含量不同,可能是造成其过敏性差异的原因.本文旨在利用生物信息学DNAStar Protean软件、SOPMA以及the Bepi Pred 1.0服务器对牛羊乳主要过敏蛋白αs1-酪蛋白（Casein,CN）的二级结构、亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性进行预测,分析鉴定主要B细胞抗原表位.合成相应表位肽段序列,制备酪蛋白抗体,采用间接ELISA法分析验证合成多肽的免疫反应性.结果表明：牛羊乳αs1-CN的氨基酸序列同源性89%,但抗原表位存在差异,与牛乳αs1-CN相比,羊乳抗原表位数目相差不大,但两者抗原表位区域存在一定的包含重叠关系.且羊乳αs1-CN合成肽段P-1037（26-31,LSPEVP）、P-1040（140-142,EGN）和牛乳αs1-CN合成肽段P-1038（189-208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK）、P-1039（99-102,EDVP）都具有免疫反应性,该结果为过敏原表位的选择提供基础,为牛羊乳过敏原性比较及改性加工提供理论依据.【期刊名称】《陕西科技大学学报》【年(卷),期】2017(035)005【总页数】6页(P133-138)【关键词】牛羊乳;αs1-酪蛋白;二级结构;抗原表位【作者】薛海燕;韩波;李珊;操歌【作者单位】陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安710021【正文语种】中文【中图分类】Q518.1Abstract:Bovine and goat milk α-casein were very similar in the aspect of nutrition and function,but they induced different allergen reaction in consumers because of the differences in protein subclass structure and content.The purpose of this paper was to analyze and identify the B cell epitopes by predicting the secondary structure,hydrophilicity,antigenicity index,surface accessibility and flexibility of major allergic protein αs1-casein from cow and goat milk using DNAStar Protean software,SOPMA and the BepiPred 1.0 server.Prepared the casein antibody by synthesizing the corresponding epitope peptide sequence and then used an indirect ELISA method to identify the immunoreactivity of the synthetic polypeptide.The results showed that the amino acid sequence homology of cow and goat milk αs1-CN was 89%,but the epitopes were different.The number of epitopes of goat milk was similar compared with cow milk αs1-CN,but there was a certain overlap between the two epitope regions.The peptide fragment P-1037 (26～31,LSPEVP),P-1040 (140～142,EGN) synthesized by the goat milk αs1-CN and the peptide P-1038 (189～208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK),P-1039(99～102,EDVP) synthesized by the cow milk αs1-CN had the immunoreactivity,which provided the basis for the selection of the allergen epitope,and provided the theoretical basis for the comparison of sensitization and modification of cow and goat milk. Key words:cow and goat milk; αs1-CN; the secondary structure; epitopes牛乳中富含多种蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质，是人体优质的营养来源，但同时也是联合国粮食及农业组织FAO (1995)报告的八大类过敏食物之一[1].牛乳过敏是指机体对牛乳蛋白的高反应性(hypersensitivity)，是婴幼儿最常见的食物过敏之一，在欧美发达国家，婴儿牛乳过敏症状发生率达0.3%～7.5%[2].目前普遍认为，牛乳蛋白中的酪蛋白(Casein，CN)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)是最主要的过敏原，其中酪蛋白主要由αs1、αS2、β和κ酪蛋白组成，约80%是由αs1-酪蛋白(αs1-CN)组成，对酪蛋白过敏的患者一般都对αs1-CN过敏[3,4].羊乳总热量、干物质、蛋白质、脂肪以及矿物质含量均高于牛乳，具有较高的营养价值，且易被人体消化吸收利用，在国际营养学界被誉为“乳中之王”[5].以羊乳替代牛乳作为婴幼儿主要的营养来源被广泛认可.羊乳和牛乳中酪蛋白所占比例相似，但羊乳中以β和κ-酪蛋白为主，αs1-CN含量(18.9%)远低于牛乳中的含量 (30.8%)[6].羊乳中αs1-CN含量较低，理论上具有较低的致敏性，Hodgkinson等[7]也证实了低αs1-CN含量的山羊乳可以减少抗原摄入量，降低致敏性.然而Muraro等[8]认为山羊乳与牛乳具有相同的致敏性.所以，就目前山羊乳的低致敏性及其在预防婴幼儿牛乳过敏中的应用仍存在争议.食物蛋白质引起机体致敏的主要原因是消化道内未水解的蛋白质抗原表位被免疫系统识别.抗原表位预测中，B细胞线性表位预测是目前研究的重点，它是研究抗原表位与已知氨基酸序列在蛋白质上的某些结构特征之间的关系，从氨基酸序列的二级结构，亲水性，表面可及性，柔韧性等方面，进行序列的分析预测[6,9].常用的分析软件有ABCpred[10]，BepiPred[11]，SOPMA[12]，DNAStar[13]，其中BepiPred，SOPMA，DNAStar这三种软件较为常用，其基本原理是结合抗原蛋白的结构特点，统计显著性度量，理化性质等指标进行简单预测，操作简单，只需输入蛋白质氨基酸序列，即可得出结果.该研究采用BepiPred，SOPMA和DNAStar这三种预测软件对牛羊乳过敏原αs1-CN B细胞线性抗原表位进行预测分析，并通过实验验证合成的抗原表位是否具有免疫反应性，为进一步对比验证牛乳和羊乳之间的抗原关系提供一定的理论基础.1.1 材料与仪器(1)主要材料：兔抗牛α-CN多克隆抗体(α-CN-IgG，效价1∶204800)，本室制备；HRP-羊抗兔Ig G抗体，北京博奥森生物技术有限公司；碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、明胶等常规试剂均为进口或国产分析纯.(2)主要仪器：MULTISKANmk3型酶标仪，赛默飞世尔上海仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海岛析实业有限公司.1.2 试验方法1.2.1 牛羊乳αs1-CN氨基酸序列通过NCBI数据库检索牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，该序列在NCBI的基因登录号分别为NP_851372、P18626.1.2.2 牛羊乳αs1-CN二级结构预测利用DNAStar Protean软件(Gamier-Robson方法)和SOPMA网络服务器输入检索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列分析预测两者的二级结构.1.2.3 牛羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测应用DNAStar Protean软件，采用Kyte-Doolittle法、Jameson-Wolf法、Emini法和Karplus-Schulz法分别对检索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列进行亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测.1.2.4 B细胞线性抗原表位确定利用the BepiPred 1.0服务器，直接输入牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，抗原指数高于1即为可能表位区域[14].并与牛羊乳αs1-CN二级结构预测结果和亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测结果相结合，综合分析得到B细胞线性抗原表位.1.2.5 牛羊乳αs1-CN多肽合成及鉴定选择牛羊乳差异较大的抗原表位肽段，由杭州丹港生物科技有限公司，应用全自动多肽合成仪，采用固相合成法从肽链C端向N端依次合成.经反高效液相色谱(RP-HPLC)以及质谱对其进行纯度鉴定，纯度大于98%，符合实验室要求.1.2.6 多肽免疫反应性鉴定采用间接ELISA检测合成多肽的免疫反应性.将上述合成的多肽用包被缓冲液稀释至10 μg/mL，每孔加入100 μL，以α-CN、β-LG蛋白分别作为阳性、阴性对照，4 ℃包被过夜[15].弃去蛋白包被液，每孔加入300 μL PBST洗涤液洗涤3次，每次4 min，拍干，除去残留气泡和液体.每孔加入200 μL明胶封闭液，37 ℃温箱封闭1.5 h，洗涤，拍干.每孔加入浓度为5μg/mL的α-CN-Ig G 100 μL(实验室制备，抗牛乳α-CN多克隆抗体兔血清)，同时设置阴性血清对照，37 ℃温箱温育1.5 h，使抗原抗体充分反应，洗涤拍干.用PBS稀释液将羊抗兔HRP-Ig G以1∶4000的比例稀释作为二抗，每孔加入100 μL，37 ℃温箱温育1 h，洗涤，拍干.每孔加入50 μL TMB显色液，37 ℃温箱避光显色15 min，显色后每孔加入50 μL终止液2 mol/L H2SO4终止反应，450 nm测定吸光值.检测时以P/N值>2.1(即多克隆抗体上清的吸光值大于阴性血清值的2.1倍)判定检测结果为阳性，P/N值<2.1(即多克隆抗体上清的吸光值小于阴性血清值的2.1倍)判定检测结果为阴性[15].2.1 牛羊乳αs1-CN所对应的氨基酸序列MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEV LNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGS ESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQ KHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGV NQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVP LGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW MKLLILTCLVAVALARPKHPINHRGLSPEV PNENLLRFVVAPFPEVFRKENINELSKDIGS ESTEDQAMEDAKQMKAGSSSSSEEIVPNSA EQKYIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYNV PQLEIVPKSAEEQLHSMKEGNPAHQKQPMI AVNQELAYFYPQLFRQFYQLDAYPSGAWY YLPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSGKTTMPLW对比分析牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，将不同差异位点标出，其同源性达到89%，且牛乳αs1-CN氨基酸序列相比羊乳氨基酸差异位点大多为一些极性亲水性氨基酸.2.2 牛羊乳αs1-CN的二级结构利用SOPMA网络服务器对牛羊乳αs1-CN二级结构预测，结果如图1所示.利用DNAStar Protean软件对牛羊乳αs1-CN二级结构预测，结果如图2所示.蛋白质的二级结构是抗原表位预测的重要参数之一.β-转角和无规则卷曲由于其松散的结构，易发生扭曲、盘旋，并展示在蛋白质的表面，因此该区域常含有优势抗原表位而α-螺旋和β-折叠化学键能比较高，结构规则不易变形，较难结合抗体，一般不作为抗原表位[16-18].综合上述两者的预测结果可推出牛乳αs1-CN可能抗原表位区域为19～27，41～43，60～62，99～102，118～120，127～129，148～150，185～186，189～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位区域为18～31，41～42，59～62，78～83，99～103，119～121，128，140～142，172～178，183～186，189～210.对比分析预测出的牛羊乳αs1-CN抗原表位区域，从二级结构预测结果显示羊乳可能抗原区域数目高于牛乳，且它们具有相同抗原区域189～210.2.3 牛羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测结果利用DNAStar Protean软件对αs1-CN(bovine、capra hircus)亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性进行预测，结果如图3所示.蛋白质的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性在抗原形成方面起着主要作用，当亲水性>0、抗原指数>0和表面可及性>1时，形成表位的可能性较大[19-21].综合预测结果推出牛乳αs1-CN可能抗原表位区域为17～19，22～26，50～52，63～67，70～74，77～83，85～105，117～122，129～134，145～149，185～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位区域为17～19，27，30～31，35，48～52，55，62～67，70～76，81～84，90～105，117～119，129～134，139～149，205～219.对比分析两者抗原表位差异得出羊乳αs1-CN抗原表位区域与牛乳相比，其大多分布在αs1-CN氨基酸序列的C端，且羊乳αs1-CN表位区域于牛乳表位区域存在一定的包含重叠关系.2.4 B细胞线性抗原表位综合预测蛋白质的二级结构和氨基酸残基的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性都是影响B细胞线性抗原表位的重要因素[22].利用the BepiPred 1.0服务器对牛乳αs1-CN氨基酸序列的抗原指数进行预测得到的可能性抗原表位是21，60～68，80～81,85～86，99～102，142～152，173～179，187～208，羊乳αs1-CN可能性抗原表位是26～31，60～70，74～91，100～102， 140～146，187～208.将the BepiPred 1.0、SOPMA、和DNAStar这三种预测软件得到的抗原表位综合分析得出牛乳αs1-CN可能抗原表位为22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位为18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.对比分析预测得到的牛羊乳αs1-CN抗原表位，较牛乳αs1-CN相比，羊乳αs1-CN同样具有较多区域的抗原表位，且二者存在一定的包含关系.2.5 牛羊乳αs1-CN合成肽的设计综合上述可能抗原表位，选择其长度不同的四条预测表位肽段采用固相合成法合成.分别来自于羊乳αs1-CN命名为：P-1037(26～31，LSPEVP)和P-1040(140～142，EGN)；来自于牛乳αs1-CN命名为：P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)和P-1039(99～102，EDVP).2.6 合成肽免疫反应性鉴定利用实验室制备的兔抗牛α-CN多克隆抗体作为一抗，间接ELISA法检测合成肽的免疫反应性，以P/N>2.1为判断标准，结果如图4示.由图4可知，合成的四种多肽和α-CN均与α-CN-Ig G呈阳性反应，且α-CN测出的吸光值高于合成的四种多肽；而β-LG与α-CN-IgG呈阴性反应，由此初步说明，合成多肽具有免疫反应性.其免疫原性还需进一步验证.关于牛乳主要过敏原抗原表位的预测研究报道较多.B Ruite等[23]利用重叠肽的方法发现牛乳αs1-CN的T细胞表位识别位点即43-66，73-96，91-114和127-180.Picariello G等[24]利用体外模拟胃肠消化后的牛乳蛋白水解液通过在Caco-2细胞的转运吸收研究发现β-Lg 40～60和125～135具有一定的致敏性.但目前从抗原位点出发研究羊乳过敏性的报道并不多见，Sanz C L等[25]利用豚鼠进行研究，发现豚鼠经口给予羊奶、牛奶和抗乳血清时，山羊奶的变应原性低于牛奶，其变应原性可能是由酪蛋白和抗乳血清不同蛋白质之间的特异性抗原决定簇引起.本研究对牛羊乳主要过敏原αs1-CN B细胞线性抗原表位进行预测，可为对目前山羊乳的低致敏性及其在预防婴幼儿牛乳过敏中的应用提供一定的理论和技术参考. 蛋白引起致敏的前提是它具有抗原性，而抗原表位是蛋白质具有抗原性的关键因素，是抗原与抗体特异性识别的基本单位.B细胞线性抗原表位是指抗原表面可被B细胞抗体识别的线性片段.所以，准确预测B细胞线性抗原表位，可为单克隆抗体的制备、羊乳抗原性的研究等奠定一定的基础.该研究首先采用SOPMA网络服务器，DNAStar软件对牛羊乳αs1-CN氨基酸序列进行对比分析，得出二者氨基酸序列同源性虽较高，但预测出二级结构仍存在差异，其中羊乳αs1-CN β-转角和无规则卷曲的数量较多，如上述利用SOPMA网络服务器对牛乳αs1-CN二级结构预测得到β-转角和无规则卷曲的数目为3.74%和38.32%，羊乳预测得到的数目为4.21%和44.39%，明显大于牛乳.这些差异同牛羊乳αs1-CN氨基酸序列上个别氨基酸的不同存在一定的关系.其次采用DNAStar软件对牛羊乳αs1-CN的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性预测，由于在肽段1～200位个别氨基酸的不同，预测出的抗原表位在该位存在部分差异且有一定的包含关系，而在200～214肽位间的氨基酸几乎无明显差异，使得此区段预测出的牛乳αs1-CN抗原表位羊乳αs1-CN也同样具有该表位.本研究仅采用了生物学软件对牛羊乳αs1-CN的二级结构，亲水性，抗原指数，表面可及性和柔韧性等预测并通过实验验证了所预测氨基酸序列的免疫反应性，为深入研究羊乳过敏原提供一定的理论依据.在乳过敏性差异方面，该结果还不能全面的说明羊乳是否可作为低致敏产品代替牛乳作为牛乳过敏患者的直接乳源，还有待对主要过敏原αs2-CN和β-LG等对比分析.但该结果可初步判定羊乳αs1-CN抗原表位合成多肽具有免疫反应性，后续进一步通过动物实验验证其多肽是否具有免疫原性产生抗体.该研究综合三种软件预测参数得到牛乳αs1-CN可能抗原表位为22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位为18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.分析比较牛羊乳αs1-CN B细胞线性抗原表位差异，与牛乳αs1-CN抗原表位相比，羊乳αs1-CN同样具有相当的抗原表位区域.因此，可以初步确定羊乳中虽含有少量的αs1-CN但其仍具有一定的抗原性.通过间接ELISA检测合成多肽的免疫性，实验表明合成多肽呈阳性反应，与抗体发生反应，具有免疫反应性，其免疫原性及过敏原性有待验证.【相关文献】[1] Kattan J D,Cocco R R,Järvinen K k and soy allergy[J].Pediatric Clinics of North America,2011,58(2):407-426.[2] Yibin Wang,Sha Xu,Yanmei Hou,et al. 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抗原表位鉴定方法的研究进展

抗原表位鉴定方法的研究进展孙娟;王愉涵;刘艳;郭进露;武丽涛;李冬民【摘要】抗原决定簇又称为抗原表位,是抗原分子中决定抗原特异性的化学基团,也是蛋白质抗原性的基础.抗原抗体的特异性结合反应是针对特定的抗原表位而并非是完整的抗原,因此明确蛋白质的抗原表位对多肽和新型疫苗分子的设计及诊断试剂的发展具有重要意义.随着科技的发展,出现了一些新的鉴定单克隆抗体抗原表位的方法.本文在传统表位鉴定方法基础上简要综述了多技术结合鉴定抗原表位新方法.【期刊名称】《国外医学（医学地理分册）》【年(卷),期】2017(038)003【总页数】5页(P291-295)【关键词】抗原表位;多技术;鉴定方法【作者】孙娟;王愉涵;刘艳;郭进露;武丽涛;李冬民【作者单位】西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安710061;西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西西安 710061;西安交通大学2013级临床医学五年制,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西西安 710061;西安交通大学2013级临床医学五年制,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西西安710061;西安交通大学2013级临床医学五年制,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西西安 710061;西安交通大学2013级临床医学五年制,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安710061;西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西西安 710061【正文语种】中文【中图分类】R751抗体一般仅与大分子抗原的某一部位反应，这一特异的部位称为抗原决定簇，也称为抗原表位，它是抗原分子中决定抗原特异性的化学基团。

免疫组化PPT课件

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未封闭内源性过氧化物酶
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胃固有膜腺体
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⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
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五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因：１在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
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Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
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图10 免疫组化结果：肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
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抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
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（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
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抗原表位的意义及分类

抗原表位的意义及分类摘要：一、抗原表位的概念与作用二、抗原表位的分类1.连续抗原表位2.离散抗原表位3.共同抗原表位4.独特抗原表位三、抗原表位在免疫反应中的应用四、抗原表位的研究意义与展望正文：抗原表位是抗原分子上具有免疫活性的特定化学基团，能够与免疫细胞表面的抗体结合，诱导免疫应答反应。

抗原表位在生物学和医学领域具有重要的研究价值，对抗原表位的深入了解有助于疫苗设计、免疫诊断和治疗肿瘤等领域的发展。

抗原表位可以根据其性质和功能进行分类：1.连续抗原表位：存在于蛋白质抗原中，具有连续的氨基酸序列。

连续抗原表位通常具有较高的可变性，使得抗原分子能够逃避宿主免疫系统的识别和清除。

2.离散抗原表位：分布于抗原分子上的不连续区域，通常具有较高的保守性。

离散抗原表位在诱导免疫应答反应中起到重要作用，是疫苗设计和免疫诊断的研究重点。

3.共同抗原表位：存在于多个不同抗原分子上，具有相似的氨基酸序列。

共同抗原表位可诱导交叉免疫反应，有助于筛选具有广泛保护作用的疫苗抗原。

4.独特抗原表位：具有高度特异性的抗原表位，通常与病原体的种属特异性相关。

独特抗原表位在病原体诊断和疫苗研究中有重要意义。

抗原表位在免疫反应中起到关键作用，它们与抗体结合后，可诱导B细胞产生免疫球蛋白，激活T细胞，并促使效应细胞发挥抗病原体作用。

此外，抗原表位的研究对于疫苗设计和免疫诊断试剂的开发具有重要意义。

随着生物技术的不断发展，对抗原表位的研究将更加深入，为疫苗研发、免疫诊断和治疗肿瘤等领域带来新的突破。

总之，抗原表位作为抗原分子上具有免疫活性的特定化学基团，对抗原表位的深入了解有助于疫苗设计、免疫诊断和治疗肿瘤等领域的发展。

免疫学第二章抗原

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再次免疫应答的条件：体内同时存在半
抗原激活B记忆细胞（半抗原的特异性），
载体激活T记忆细胞。
主要决定于载体。
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2．2 决定免疫原性的因素
2.2.1 化学分子组成
多数是蛋白质。
含大量芳香族氨基酸（酪氨酸、苯
丙氨酸），尤其是含酪氨酸的免疫原性
更强；有些弱抗原（例如胶原）连接了
酪氨酸残基可增强免疫原性。
一般，颗粒性的抗原（细菌、细胞）用量少，可溶性的蛋白或多糖抗原用量适当加大，并加佐剂。
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2.2.7 机体方面的因素
（1）遗传因素：动物的不同种类、品系、个体对同一种免疫原应答差别很大。
如应用合成的抗原二硝基苯-多聚-左旋-赖氨酸（DNP-poly-L-L）在荷兰猪品系2（GP strain 2）可以引起应答，而对品系13（GP strain 13）则不能引起应答。
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功能性决定簇：与抗体结合、直接启动应答的抗原决定簇。隐蔽决定簇：位于蛋白的深层，当蛋白质结构改变或变性才显示出来触发应答的抗原决定簇。变性的自身抗原可导致自身免疫病（暴露了隐蔽决定簇）。
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载体决定簇和半抗原决定簇完全抗原产生的抗体产生分别针对载体决定簇和半抗原决定簇的抗体。
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超抗原的生物学意义
参与某些病理过程 SAg（金葡菌毒素）刺激大量 T细胞激活，使巨噬细胞、肥大细胞产生多种细胞因子或其他介质（TNF、IL-1、IL-2）引起疾病。 SAg与自身免疫应答 SAg的强大刺激可激活体内自身反应性T细胞，诱发自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎）。 SAg与免疫抑制 T细胞因过度激活而被耗竭。与抗肿瘤效应 CTL被大量激活而对肿瘤发挥杀伤作用。

说明免疫组织化学技术检测组织和细胞内蛋白质抗原的关键技术

说明免疫组织化学技术检测组织和细胞内蛋白质抗原
的关键技术
免疫组织化学技术是一种基于免疫学原理的实验技术，适用于检测组织和细胞内蛋白质抗原。

其关键技术包括以下几个方面：
1. 抗原表位的选择：选择合适的抗原表位对于正确识别目标抗原至关重要，通常需要根据已知的抗原序列设计合适的抗原表位。

2. 抗原修复处理：组织标本或细胞病理部分常常因为常规处理方式而导致抗原失活、免疫组织化学染色效果受阻，因此，要使用抗原修复处理方法，如热解或酶解等，来恢复抗原的免疫原性。

3. 抗原特异性抗体的使用：使用特异性抗体与目标抗原发生特异性结合，通常用于检测和定位特定的抗原。

4. 免疫组化染色：将标本与特异性抗体反应后，通过适当的染色方法，如荧光染色、酶染色或放射性标记等方法，来进行成像和信号检测。

5. 图像分析和数据处理：通过数字化成像技术和计算机软件处理技术，对免疫组织化学染色的图像数据进行定量分析和计算，以实现更精确的数据表达和研究结果。

医学免疫学-第三章抗原

B
第一节抗原的性质与分子结构基础
一. 抗原的基本特性:
免疫原性
（Immuogenicity)：抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力。
免疫反应性
（immunoreactivity）：抗原与其诱生的抗体或致敏感淋巴细胞特异性结合的能力。
T immunoreactivity
抗原的特异性：是指抗原刺激机体产生免疫应答及其与
应答产物发生反应所显示的专一性，即某一种特定抗原只能刺激机体产生特异性的抗体或致敏淋巴细胞，且仅能与该抗体或对该抗原应答的致敏淋巴细胞特异性结合。
特异性是免疫应答最重要的特点。 T,下，有针对性地清除病原体/异物
胸腺依赖性抗原（TD-Ag）
B细胞 A
无应答
B细胞
T细胞 B
浆细胞
2．胸腺非依赖性Ag（thymus independent
antigen TI-Ag）：此类Ag刺激机体产生抗体时，不需要T细胞辅助,又称T细胞非依赖抗原。
TI-Ag
B细胞
浆细胞
TI－Ag可分为TI-1和TI-2抗原。
内源性抗原（endogenous antigen）：在抗原提呈细胞内合成的抗原
如：病毒抗原，肿瘤抗原抗原肽-MHCI类分子主要被CD8+ T细胞识别
外源性抗原（exogenous antigen）
来自抗原提呈细胞外的抗原，如APC通过各种方式吞噬的各种病原体抗原肽-MHCII 由CD4+ T识别
2．化学性质：天然的抗原多是大分子的有机物。
蛋白质是良好免疫原。
糖蛋白、脂蛋白和多糖类、脂多糖都有免疫原性，但脂类和哺乳动物的细胞核成分如DNA、组蛋白是难以诱导免疫应答。

(半抗原)和T细胞表位(载体)

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根据抗原与机体亲缘关系分类
* 异种抗原（xenoantigen）
* 同种异型抗原（allogeneic Ag）：如ABO血型抗原、
* 自身抗原（ autoantigen）：自身组织在创伤、感染、电
离辐射和药物等影响下，可以发生变性而成为具有免疫
原性的物质 * 异嗜性抗原（heterophilic antigen）一类与种属无关，存在于人、动物及微生物之间的共同抗原，又称 Forssman抗原
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其他分类方法 * 完全抗原和半抗原
* 天然抗原、人工抗原和基因工程抗原
* 外源性抗原指非APC自身所产生的抗原。
内源性抗原指免疫效应细胞的靶细胞自身所
产生的抗原。
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主要内容
一、抗原的概念和特性二、决定抗原免疫原性的条件三、抗原的特异性与交叉反应性
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抗原决定基及抗原结合价
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四、抗原的种类及其意义
五、几种重要的抗原及佐剂
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抗原刺激机体免疫应答的过程
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抗原的属性

免疫原性(immunogenicity)
刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞的特性。

抗原性(antigenicity)
抗原能够与其所诱生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的特性。
或5-7个核苷酸构象表位、线性表位
抗原分子任意部位抗原分子表面
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交叉抗原（cross antigen）
抗原异质性（heterogeneity）

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细胞的抗原表位研究方

法

孙建宏,曹殿军

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨。。。

中圈分类号文献标识码文章月号摘要多表位疚苗有望成为预防多种病原体感

染的理想疫苗,因而被认为是将来疚苗的发

展

方

向杭原表位是研究杭原的免疫机制和表位疫

苗的基袖,近年来在表位研究方面取得了一些可喜的进展,特别是抗原表位的研究方法细胞表位的研究方法已经不局限于通过交叠合成多

肤进行研究,又诞生了噬菌体随机肤序以及表位

预浏等方法在细胞杭原表位的研究方面也

有了相应的预浏方法,尤其是将

试

验体外杭原提呈试验等应用于细胞表

位

活

性的鉴定,极大的促进了细胞表位的研究进

展文章全面系统地对细胞表位与细胞表位的研究方法的进展进行了综述旨

在

为

表位

和表位疫苗的研究提供先进的多种技术方法关健词抗原细胞表位细胞表位

表位又称抗原决定簇

垃

是指存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的数个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间结构

表位一般只占个氨基酸和单糖残基的大小至多

不超过个氨基酸残基根据与抗原受体结合不同分

为细胞识别表位和细胞识别表位起关键作用的表位称为显性表位或称免疫优势表位但是最近

有人提出免疫优势表位和保护免疫反应之间没有直接

的关系在用结核菌素次优势表位多肤免疫时提供了与卡介苗免疫同样的保护效果其中的机理还有待深人

研究

细胞抗原表位

对于抗原表位的研究曾因为缺少检测技术及肤合成技术等困难而一度陷于停滞状态随着单克隆抗体技术计算机技术和固相合成肤技术的日臻成熟对细胞抗原表位的研究已经取得了很大进展研究细胞抗原表位的方法也得到了相应的发展和完善

近年国际上医学界对细胞抗原表位研究的较

多特别是对型流感病毒的细胞抗原表位已有较为深人的研究蛋白基因连续突变是导致抗原变异的主要原因现在确定的抗原表位有个但

是流行株至少有个表位发生变化因此根据各型抗原表位比较研究找出各型高度保守的细胞及细

胞表位并结合蛋白和蛋白的优势表位构建

多

表位重组疫苗将是流感疫苗的重大突破目前

国外已经有以型流感病毒蛋白的和细

胞识

别表位联和制成的合成肤疫苗可以保护鼠的致死性感染的报道闺而且随着噬菌体展示技术的发展研制模拟表位疫苗将是疫苗研究的一个新的途径

对动物病原的细胞表位的研究也有较多报道其中等等研制的口蹄疫表位疫苗免疫后可保护猪抵抗强毒攻击而对于禽类病原细胞表位的研究目前还很少尚未有表位疫苗的报

道对于禽病原的细胞抗原表位的研究仅限于应用单克隆抗体和点突变技术例如对于和蛋

白抗原表位的研究应用该技术已经确定了蛋白上的个细胞抗原表位它们在溶血活性膜融合和病毒感染中起着重要作用而蛋白有个中和性抗原表位可刺激产生中和抗体〔闷

目前用于研究制备细胞抗原表位的方法主要有

以下几种

细胞杭原表位的预浏

法

该方法是近年来建立起来的一种较先进的细胞抗原表位研究方法这是人们在总结抗原表位与已知氨基酸序列的蛋白质某些结构特征关系的基础上得出的蛋白质细胞抗原位点位置的经验规则该法适用于已知一级结构的蛋白质或多肤抗原的线性表位的预测自从上世纪年代和提出

用亲水性参数对抗原表位预测的方法以来困目前根据

这些参数综合预测细胞抗原表位的计算机软件

已经

问世现已被人们认可并具有较好预测效果的方法主要有亲水性方案可及性方案,〕抗原性方案,可塑性

劝方案,〕二级结构预测

方案‘〕及电荷分布方案

对上述各种参数的预测比较表明各种方案预测的正确率均不高一般将上述多种方案综合考虑尤以可及性

方案可塑性方案抗原性方案及二级结构预测为重要就是说作为细胞蛋白抗原的表位首先应易位于或移

动于蛋白质抗原表面有利于与抗体结合并具有一定

柔韧性有很多应用这些参数综合预测细胞的表位

的成功报道如应用计算机软件对人免疫缺陷病毒分离

株的保守区和可变区的抗原表位预测〕对人氨

孙建宏等细胞的抗原表位研究方法

基酸序列细胞抗原表位的预测〕以及对恶性疟原虫

疟殖子表面蛋白一的表位分析〕等

根据细胞表位综合预测结果可以人工合成表位肤段或利用分子生物学方法扩增预测表位的编码基因片段后用表达载体表达相应的表位纯化后获得目的肤再利用或等方法对其

进行鉴定

化学或生物学

方法

有两种方法一种是用化学法或酶“切割”抗原获

得多肤片段再利用单克隆抗体筛选能与其反应的片段从而确定蛋白质的抗原表位〕该法获得的表位是线性表位水解后采用凝胶过滤离子交换等方法将水解片段分开然后用或等方法来检测另一种是水解抗原抗体复合物这是一个直接的确定线性及构象性细胞抗原表位的方法又称为其理论依据为抗原一抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水解采

用化学“切割”法或酶法研究抗原表位过程比较复杂抗

原抗体结合的条件酶解的条件解离后的片段是否能有效分离解离的完全程度酶解片段的大小等对结果都会有影响肤探针扫描技术交叠合成多肤的方法

是应用肤合成技术合成连续重叠的一肤将这

些合成的肤与相应的抗体反应分析检测结果以确定

阳性反应片段这一技术要求有明确的抗原的一级结

构并且只能检测抗原线性表位该法曾得到广泛应用但是肤探针扫描技术和化学或生物学方法处理

抗

原获得多肤这两种方法都存在工作量大成本高等缺点因此使用的越来越少了应用噬菌体随机肤库研究蛋白质抗原表位

这是一种很有发展前途的研究蛋白质抗原表位的技术近年来的抗原表位研究成果是发现了模拟表位叩模拟表位的氨基酸顺序可能与大分子抗原表位的氨基酸顺序截然不同却可以引起相同特异性

的强免疫反应应用噬菌体随机肤库获得的表位就是模拟表位该法是利用基因克隆技术将合成的一组寡核昔酸混合物小肤基因混合物克隆至线性噬菌体基因组中

使之以融合蛋白的形式在噬菌体的外壳蛋白的氨基端表达从噬菌体随机肤库筛选抗原表位的基本原理是生物淘洗一般经过轮的筛选并且

每次增加筛选强度这样就可以获得与单抗结合较紧密的噬菌体克隆通过序列分析就可知道噬菌体克隆所携带的外源肤序列从而得知该单抗所针对的抗原表位这种噬菌体表位文库构建的成功与否噬菌体克隆的数目是一个决定因素以随机六聚体氨基酸为例亿种左右的序列编码大约万种

的氨基酸序列因此要使所有可能的氨基酸序列都包含在文库中至少需要亿个独立的克隆才行考虑

到密码子的简并性一般一亿个独立克隆的表位文库就能顺利地进行下一步的筛选其最大优点是

可以

获得构象型表位该方法的不足是首先目前所建的

肤库只能达到构建大片段的肤库很困难其次有些肤由于过于疏水或者由于影响外膜蛋白的折叠而不能在噬菌体外正确表达等〕应用该方法获

得的囊尾勤模拟表位可产生对囊尾勤的保护性抗体,杜

勇等人〕应用特异性血清淘洗和正常血清吸附筛选

到了一个的模拟表位其具有良好的免疫原性

此外还有一些如复合物的射线衍射和

核磁共振分析等方法,在细胞抗原表位研究中也有所应用在研究抗原表位中的个别氨基酸在表位中的作

用一般采用定点突变技术

细胞表位

细胞表位就是抗原蛋白中经抗原提呈细胞

处理由分子提呈给淋巴细胞受体的多肤片段可分为类分子抗原表位即细胞抗原表位和类分子抗原表位即细胞抗原表位确定细胞表位对

于研究细胞免疫的机理过程及研制亚单位多肤疫苗和基因疫苗具有重要的意义但是细胞不象细胞可以直接识别抗原表面上的表位而只能识别结合

到

和分子上的肤因此对于细胞表位

的研究多是从分子人手目前对于人的细胞

表位研究较多如人的免疫缺陷病毒西尼尔病

毒和分支杆菌等的细胞表位而且已经有关

于将多个同源或异源的细胞表位串联诱生了细胞

免疫应答或将细胞表位和细胞表位组合在相应动物模型中诱发体液免疫应答细胞免疫应答和辅助细胞的免疫应答的表位基因表位合成肤的报

道〔而对于禽类病原的细胞表位的研究由于缺少预测的工具和必要的检测试剂相应的细胞表位的检测方法也不很成熟因此还没有这方面研究的报道研究细胞表位

的方法

目前研究细胞表位的方法主要有

合成重叠肤法即在合成重叠的肤后通过细胞功能试验确定可以被细胞识别的肤段即细胞表位尽管应用该方法成功鉴定了几个细胞表位但是这种方法有其局限性不但工作量大费用高而且由于合成的重叠肤一般是个氨基酸长个氨

基酸重叠因此重叠区之间的表位就可能被忽略了所

以不能够鉴定出目的蛋白上所有的细胞表位

细胞表位预测法即根据细胞表位的特

征先预测表位再合成肤段以细胞功能试验

等进

行鉴定目前已经有细胞表位预测的计算机软件在类分子抗原表位预测方面有很多种预测方

法这些方法可以概括为种类型①根据模型预测根据用已构建的模型已成功的预测了一些病原体的抗原表位山〕但并不是所有预测的抗原表位

都能与类分子结合等〕研究与抗原肤的作用发现用以往文献报道的方法

预测抗原表位仅有的肤能与结合如果除了考虑锚点即肤上受限制对抗原肤和的结合至关重要的位点之外还应考虑其它位置氨基