实验室血清学常用检测方法

常用血清学检测方法介绍

一、酶联免疫吸附试验诊断技术

目前，该项技术已在兽医学上得到广泛得应用，大多数动物传染病都已经研制成ELISA检测方法。

1、酶联免疫吸附试验得原理

ＥLISA得基础就是抗原或抗体得固相化及抗原或抗体得酶标记。结合在固相载体表面得抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记得抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶得活性。在测定时,受检标本（测定其中得抗体或抗原）与固相载体表面得抗原或抗体起反应.用洗涤得方法使固相载体上形成得抗原抗体复合物与液体中得其她物质分开。再加入酶标记得抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上得酶量与标本中受检物质得量呈一定得比例.加入酶反应得底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物得量与标本中受检物质得量直接相关,故可根据呈色得深浅进行定性或定量分析.由于酶得催化效率很高,间接地放大了免疫反应得结果，使测定方法达到很高得敏感度.

2、ＥLISA得类型

根据试剂得来源与标本得情况以及检测得具体条件，可设计出各种不同类型得检测方法。用于动物疫病检测得ＥLＩＳＡ主要有以下几种类型:

①、双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法就是检测抗原最常用得方法.在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上得大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如猪瘟病毒检测ＥLISA、禽流感病毒抗原捕获ＥLIＳA，就就是根据这种原理设计得.

②、双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被与制备酶结合物，以检测相应得抗体。与间接法测抗体得不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。乙肝ＨBｓ得检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原得制备,需要根据抗原结构得不同,寻找合适得标记方法.

此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于于间接法。此外，该方法不受被检动物种属差异得限制.

③、间接法测抗体

间接法就是检测抗体常用得方法。其原理为利用酶标记得抗体(抗免疫球蛋白抗体),检测与固相抗原结合得受检抗体（见图1)。操作步骤如下：（1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合得抗原及杂质。

（2)加稀释得受检血清，保温反应。血清中得特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物.经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体，血清中得其她成份在洗涤过程中被洗去。

（３）加酶标抗抗体可用酶标抗人Iｇ以检测总抗体，但一般多用酶标抗人ＩｇG检测IｇG抗体。固相免疫复合物中得抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上得酶量与标本中受检抗体得量正相关。

(4)加底物显色

本法主要用于对病原体抗体得检测而进行传染病得诊断。间接法得优点就是变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体得方法.

间接法在动物疫病抗体检测中应用广泛,例如禽流感得间接EＬIＳA,用禽流感病毒NP蛋白包被成抗原板,待检血清中得抗体与之结合,再加酶标二抗反应,可以检测所有Ａ型禽流感病毒抗体.

④、竞争法测抗体

当抗原材料中得干扰物质不易除去，或不易得到足够得纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中得抗体与一定量得酶标抗体竞争固相抗原。标本中抗体量越多,结合在固相上得酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。

⑤、竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法得两个以上得位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式.其原理就是标本中得抗原与固相抗原共同竞争一定量得酶标抗体。标本中抗原量含量愈多,结合到固相上得酶标抗体愈少，最后得显色也愈浅。小分子激素、药物等ＥＬISA测定多用此法.

例如，猪瘦肉精得检测,多用瘦肉精抗原包被反应板，让样品中得瘦肉精抗原与板上得抗原共同竞争酶标单克隆抗体.

目前,已有商品化、标准化得试剂盒，可检测猪瘟、猪伪狂犬、猪蓝耳病、

猪乙型脑炎、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪弓形虫、猪喘气病等各种抗体。（二）琼脂扩散试验

1、基本概念

沉淀反应：就是利用可溶性抗原与抗体结合，形成肉眼可见得沉淀得一类血清学免疫反应 .抗原可以就是多糖、蛋白质、类脂等。如细菌内毒素、外毒素、菌体裂解物，病毒悬液、病毒得可溶性抗原、血清、组织浸出液等。沉淀试验包括絮状沉淀试验、琼脂扩散试验、免疫电泳。

琼脂扩散试验:就是一种运用沉淀反应原理进行兽医诊断检测得一种常规实验方法.

２、基本原理

琼脂扩散试验就是利用抗原抗体能在琼脂凝胶中自由扩散，并在琼脂中结合,在一定比例处凝聚形成沉淀线,从而对抗原或抗体进行得测定、比较、鉴定与检测。该方法具有简便易行得特点，不需使用大量昂贵仪器设备，易于操作而被广泛采用。琼脂扩散试验分为四种类型：单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散。其中应用最广得就是双向单扩散与双向双扩散，双向单扩散主要用于对抗原抗体得定量测定，双向双扩散主要用于对抗原得比较，以及抗原抗体得检测。

双向双扩散简称双扩散,即抗原抗体在琼脂中相互扩散，各自产生一个扩大得环,两环相遇时,在比例适当处,产生一条致密得白色沉淀线.这条沉淀线同时能阻止相同得抗原、抗体成分得继续扩散。

根据所用试剂及检测对象得不同，双扩散又分为两类，一类利用已知抗原检测抗体，即血清流行病学调查,如禽流感、蓝舌病、口蹄疫、牛白血病、马传贫、非洲马瘟、禽霍乱等，另一类就是利用己知抗体检测抗原，如马立克羽髓抗原得检测。

（三）凝集试验

凝集试验就是颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）或表面载有抗原得颗粒状物质(如聚苯乙烯胶乳、红细胞、碳素颗粒等)，与相应抗体在电解质存在下,结合出现肉眼可见得凝集(agｇluｔｉnation)现象得试验。

凝集试验就是一个定性得检测方法，即根据凝集现象得出现与否判定结果阳性或阴性；也可以进行半定量检测,即将标本作一系列对倍稀释后进行反应，以出现阳性反应得最高稀释度作为滴度.由于凝集反应方法简便，敏感度高，迄今已成为通用得免疫学试验,广泛应用于临床检验。

凝集反应可分为直接凝集反应与间接凝集反应两大类。间接凝集试验中得间接血凝试验与乳胶凝集试验应用最为广泛。

1、直接凝集反应

细菌、螺旋体与红细胞等颗粒抗原,在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应（dirｅct agｇｌutinaｔion)。凝集反应中得抗原称为凝集原（aｇgｌuｔinogen），抗体称为凝集素（aｇｇlutinin）。直接凝集试验可分为玻片法、平板法、试管法及微量凝集法等。

2、间接凝集反应

将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小得颗粒性载体得表面,然后与相应抗体(或抗原）作用，在适宜得电解质存在得条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应(inｄiｒecta ｇglｕtｉnation)或被动凝集反应(pａssivｅaｇglｕtinatｉｏn）。这种反应适用于各种抗体与可溶性抗原得检测，其敏感度高于沉淀反应,因此被广泛应用于临床检验。

在间接凝集反应中,可用作载体得颗粒种类很多，常用得有动物或人红细胞、细菌与多种惰性颗粒如聚苯乙烯胶乳（poｌystyｒeneｌａｔeｘ)、活性炭、皂土（ｂenｔoniｔｅ)、脂质体等,根据所用载体不同，间接凝集试验又可称为间接血凝试验、胶乳凝集试验、炭凝集试验、皂土凝集试验、脂质体凝集试验等。

间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、无需特殊得实验设备等特点，而且能用于抗原或抗体得测定，因此在临床检验中广为应用。下面重点介绍最常用得间接血凝试验与胶乳凝集试验.

①间接血凝试验

以红细胞作为可溶性抗原得载体来检测抗体,称为间接血凝试验（ＩHA),也称被动血凝试验(ＰHＡ）。如将抗体吸附(致敏）在红细胞上用于检测抗原，则成为反向间接血凝试验。

该方法具有许多优点:如敏感性高,特异性强，重复性与稳定性好，操作简便，反应迅速，即可以定性又可以半定量,而且试剂价格低廉，不需要特殊复杂得仪