蛋白质表达
蛋白质表达的差异及其与疾病的关系
蛋白质表达的差异及其与疾病的关系蛋白质是生命体内最重要的分子之一，它们在细胞中发挥着各种重要的功能。
蛋白质的表达水平及其在不同个体之间的差异，对于疾病的发展和治疗具有重要意义。
本文将探讨蛋白质表达的差异及其与疾病之间的关系，并介绍一些相关的研究进展。
一、蛋白质表达的差异蛋白质表达的差异主要包括两个方面：个体间的差异和细胞内的差异。
1. 个体间的差异个体间的蛋白质表达差异往往与遗传因素密切相关。
人类基因组计划的研究发现，人体中约有20,000个基因，但形成的蛋白质却远远超过这个数字。
这说明在蛋白质的表达过程中，基因的转录和翻译过程存在差异，导致不同个体之间的蛋白质组成存在差异。
这些差异可能与个体的遗传背景、环境因素以及生活方式等有关。
2. 细胞内的差异细胞内的蛋白质表达差异主要体现在细胞类型和状态的差异上。
不同类型的细胞在功能、形态和基因表达上存在差异，因此它们产生的蛋白质也不同。
同时，细胞的状态也会影响蛋白质的表达水平。
例如，细胞在应激或病理状态下，会产生一些特定的蛋白质，这些蛋白质可能参与调节细胞的生理功能，或者作为早期诊断的标记物。
二、蛋白质表达差异与疾病的关系蛋白质表达的差异与疾病的发展和治疗密切相关。
许多疾病的发生和发展过程中，蛋白质的表达异常是重要的因素之一。
1. 疾病的发展过程中的蛋白质表达差异疾病的发展过程中，一些蛋白质的表达水平会发生改变。
这些蛋白质的异常表达可能与疾病的产生和发展有密切关系。
例如，癌症的发展通常伴随着一系列蛋白质的过度表达或缺失。
这些蛋白质可能参与细胞增殖、迁移和凋亡等重要的生命过程，从而促进癌细胞的生长和扩散。
2. 蛋白质表达差异的临床应用蛋白质表达差异的研究为疾病的早期诊断和治疗提供了新的思路。
许多疾病在早期阶段时，蛋白质的表达水平已经发生变化，这些变化可以作为生物标记物用于疾病的早期筛查和诊断。
例如，心肌梗死的早期诊断可通过检测血清中心肌特异性蛋白的表达水平来实现。
蛋白质表达通过哪些途径调节基因表达
蛋白质表达通过哪些途径调节基因表达蛋白质表达调节基因表达的途径蛋白质是所有生物体中最基本的大分子，它参与调节细胞的各个方面，包括基因表达、代谢过程、信号传导等。
本文将重点讨论蛋白质表达如何调节基因表达。
一、转录因子调节转录因子是一类能够结合DNA的蛋白质，它们能够在调控基因表达中发挥重要的作用。
例如，一般情况下，干细胞中特定基因的表达是被抑制的。
而在干细胞分化进程中，某些转录因子的表达会被触发，从而激活该基因的表达。
此外，其他类型的转录因子也能通过增强或者抑制RNA聚合酶的活性来调控基因的转录。
二、RNA后期调节许多蛋白质在转录后还需要进行后期处理才能产生功能性产物。
许多RNA分子需要在转录后被修饰、剪切或者编辑，这些后期调节同样可以调节产生的蛋白质的类型和数量。
例如，剪切在肝癌细胞中广泛存在，许多抑制剪切因子的小分子便成为了肝癌治疗中的研究热点。
三、蛋白质的翻译后调节在mRNA转录后，其所含编码信息将被转录成蛋白质。
在翻译过程中，一些易于识别和保存的结构序列将被插入到蛋白质的氨基酸序列中，这些序列也可以被调节。
例如，在转录后插入带有调控序列的肽链可以在处理后增加蛋白质的稳定性。
四、蛋白质后期调节蛋白质还可以在部分产生后继续进行修饰和调节。
这些后期修饰包括磷酸化、甲基化、泛素化等等，并能够直接影响蛋白质的活性。
例如，不正确的甲基化会引起疾病的发生，因此，寻找可用于特定甲基化类型的小分子抑制剂已经成为目前的研究热点。
总之，蛋白质表达是基因表达过程的一个关键环节，我们可以通过调节转录因子、RNA后期处理、翻译后调节和蛋白质后期改良等对这个过程进行精细的调节。
此外，尽管这些过程的调节不同，但它们都与广泛的疾病治疗相关，因此对于研究人员来说是非常有意义的。
蛋白质的表达纯化
06
蛋白质的表达与纯化的挑战与 展望
高表达量和高纯度蛋白质的获得
表达量
优化基因克隆、宿主菌选择和培养条件，以提高蛋白质的表达量。
操作条件
操作过程中需要注意pH值、离子强度等参数的调节，以适 应不同蛋白质的分离需求。
亲和色谱法
1 2
原理
亲和色谱法利用生物分子之间的特异性亲和力进 行分离，如抗原-抗体、酶-底物等。
常用亲和剂
常用的亲和剂包括酶的抑制剂、免疫球蛋白、生 物素等。
3
操作条件
操作过程中需要注意亲和剂的再生和循环使用， 以提高分离效率。
生物学活性检测
通过生物学实验检测蛋白质的生物学活性，如酶活性、配体结合能 力等。
04
蛋白质的表达与纯化的影响因 素
基因的拷贝数和启动子强度
基因拷贝数
基因的拷贝数越多，蛋白质的表 达量越高。但过高的拷贝数可能 导致细胞死亡或蛋白质表达抑制 。
启动子强度
启动子是RNA聚合酶识别和结合 位点，启动子强度决定了蛋白质 的表达水平。选择合适的启动子 是蛋白质表达的关键。
蛋白质的表达纯化
目 录
• 蛋白质表达系统 • 蛋白质纯化方法 • 蛋白质的表达与纯化流程 • 蛋白质的表达与纯化的影响因素 • 蛋白质的表达与纯化的应用 • 蛋白质的表达与纯化的挑战与展望
01
蛋白质表达系统
原核表达系统
01
02
03
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌 表达系统能够高效表达外 源基因，产生大量的重组 蛋白质。
蛋白质表达与神经系统的关系
蛋白质表达与神经系统的关系蛋白质表达是指基因信息转录和翻译成蛋白质的过程。
这个过程对神经系统的发育、功能维持以及疾病的发生都有着至关重要的影响。
一、蛋白质表达在神经系统发育中的作用神经系统发育需要大量的蛋白质合成和表达调控。
在神经系统发生和发育过程中，蛋白质表达的异常可能导致神经系统的异常，进而引起许多疾病。
例如，神经元的迁移和分化过程需要大量的蛋白质合成和表达调控。
神经元与其他细胞的相互作用、神经元的入侵性连接等过程都需要大量的蛋白质表达。
神经系统的异常合成与表达调节可能导致神经元缺失、轴突过度增长和缺少支持神经元的胶质细胞等情况的出现。
二、蛋白质表达在神经系统功能维持中的作用神经系统需要不断地合成和修复蛋白质，以维持其正常的功能。
例如，神经突触的形成、神经递质的合成与释放、神经元的代谢等过程都需要大量的蛋白质表达。
在神经系统中，神经元的活性和连接紧密相关。
神经突触的形成和维持需要大量的蛋白质合成和表达调控。
突触前后的蛋白质，如突触素和突触连接素等，起着重要的调控作用。
如果这些蛋白质表达异常，神经元的连接就会受到影响，从而导致神经功能异常。
三、蛋白质表达与神经系统疾病的关系蛋白质表达异常可导致神经系统疾病的发生。
例如，癫痫、帕金森氏症、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症等多种神经系统疾病都与蛋白质合成和表达异常有关。
近年来，大量的研究表明，神经系统疾病的发生与蛋白质异质性聚积和变性紧密相关。
一些神经系统退行性疾病，如帕金森氏症和阿尔茨海默病等，背后的病理学机制都与蛋白质聚集和变性有关。
这些病变的发生与细胞内重要蛋白质的异质性聚集引起的神经元的死亡有关。
总的来说，蛋白质表达与神经系统的关系是不可分割的。
这个关系密切相关于神经系统发育、功能维持及疾病的发生和发展。
因此，对于蛋白质合成和表达的调控，以及对神经系统蛋白质异构的理解，对于进一步掌握神经系统疾病的机制和有效治疗非常重要。
蛋白质表达的表观遗传学调控
蛋白质表达的表观遗传学调控一、引言在生物体内，蛋白质的表达是维持生命活动和遗传信息传递的关键过程之一。
然而，仅凭基因序列的信息无法完全解释蛋白质表达的复杂性。
近年来，越来越多的研究表明，表观遗传学调控在控制蛋白质表达中起着重要的作用。
本文将深入探讨蛋白质表达的表观遗传学调控机制及其在生物学中的意义。
二、表观遗传学的概念表观遗传学是指在没有改变DNA序列的情况下，通过调整基因表达状态来影响遗传物质在细胞及组织中的功能。
表观遗传学调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA等多个方面。
三、DNA甲基化调控蛋白质表达1. DNA甲基转移酶与DNA去甲基化酶DNA甲基化是最早被发现的一种表观遗传学修饰方式，它一般发生在CpG位点上。
DNA甲基转移酶通过将甲基基团添加到DNA分子上，可以引起基因沉默，从而影响蛋白质表达。
DNA去甲基化酶则具有将甲基基团从DNA分子上去除的作用，从而起到激活基因的作用。
2. 甲基化水平与蛋白质表达的关系DNA甲基化水平的改变往往会导致基因的表达模式发生改变。
高甲基化状态常常与基因沉默相关，而低甲基化状态则与基因的活化和表达相关。
因此，DNA甲基化调控蛋白质表达的机制在生物学研究中备受关注。
四、组蛋白修饰与蛋白质表达1. 组蛋白修饰的类型及功能组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、泛素化等多种方式。
这些修饰方式可以改变染色质的结构和超螺旋度，从而影响DNA的可及性。
不同的组蛋白修饰方式对基因的表达调控有所不同，它们可以激活或抑制基因表达。
2. 组蛋白修饰与蛋白质表达调控的互作关系组蛋白修饰可以通过改变染色质结构来影响转录因子与DNA的结合能力，从而调控蛋白质的表达。
此外，组蛋白修饰还可以与DNA甲基化相互作用，共同调控基因表达。
五、非编码RNA调控蛋白质表达1. miRNA与蛋白质表达的关系miRNA是一类由小RNA分子构成的非编码RNA，它可以通过与靶基因的mRNA结合，抑制该mRNA的翻译过程，从而降低蛋白质的表达水平。
蛋白质表达与植物抗逆性
蛋白质表达与植物抗逆性植物在面对各种环境胁迫和气候变化时，必须发展出可靠的适应和生存策略。
其中包括改变基因表达模式以应对不同情况。
蛋白质表达在这个过程中扮演着至关重要的角色。
本文将探讨蛋白质表达在植物抗逆性中的作用。
一、植物抗逆性与蛋白质表达的关系植物在应对各种环境压力时，需要调节其基因表达模式以适应变化的环境。
在这个过程中，蛋白质表达是非常关键的。
蛋白质在植物生长和发育过程中扮演着重要角色，并且在逆境胁迫下对植物的生存具有至关重要的作用。
一些研究表明，逆境胁迫会导致植物蛋白质表达的改变，以应对逆境胁迫的影响。
因此，了解植物蛋白质表达的调控机制和植物与逆境胁迫之间的关系非常重要。
二、逆境胁迫对蛋白质表达的影响逆境胁迫会引起植物代谢的变化，包括改变蛋白质合成和降解、改变信号传导和抗氧化反应等。
逆境胁迫可以导致一系列蛋白质的表达与合成的变化，包括逆境蛋白的诱导、抗氧化酶的表达增强等。
另外，逆境胁迫还会引起一些保护性蛋白的表达和合成，如热休克蛋白、抗寒蛋白、抗旱蛋白等。
三、蛋白质表达的调控机制植物中的基因表达和蛋白质表达受到多种因素的调控。
在植物中，有一些机制可以在逆境胁迫下调控蛋白质表达。
其中，转录后调控是一种非常重要的调控机制。
转录后调控包括RNA剪接、RNA修饰、RNA稳定性的调节和转录后翻译调节等等。
另外，在植物中还存在一些转录因子家族来控制逆境胁迫下的蛋白质表达。
这些因子包括MYB、WRKY、AP2/EREBP、bZIP等等。
四、未来的研究方向尽管已经有了一些了解植物蛋白质表达和逆境胁迫之间的关系的研究，但是还有很多方面需要进一步研究。
例如，研究逆境胁迫如何影响植物蛋白质合成的速率和机制，以及如何在这种情况下调控蛋白质表达和转录后调控机制。
此外，还需要研究不同逆境胁迫对蛋白质表达的影响是如何相互比较的，以及如何在面对多种逆境胁迫时维护蛋白质的合成和表达。
综上所述，蛋白质表达是植物逆境胁迫适应和生存策略中的关键因素。
染色质开放和蛋白质表达之间的关系是什么
染色质开放和蛋白质表达之间的关系是什么染色质是由DNA、组蛋白和非编码RNA等组成的复杂的基因表达调控系统，其开放程度直接影响到蛋白质的转录和表达水平。
本文将探讨染色质开放和蛋白质表达之间的关系。
一、染色质结构与基因表达染色质可以分为紧密结构的异染色质和松散结构的顺式染色质两种。
异染色质包含高度紧密结合的DNA和蛋白质，不利于基因转录和表达，主要分布在染色体较为密集的区域。
相反，顺式染色质结构松散，利于基因转录和表达，主要分布在染色体较松散的区域。
除了整体结构的影响，染色质上的化学修饰也会影响基因表达。
例如，在染色质组装中，乙酰化、甲基化等修饰可以影响蛋白质与DNA的相互作用，调节染色质的结构和可达性，从而影响基因的转录和表达。
二、染色质开放与蛋白质转录的关系染色质打开是指通过某些机制使得本来紧密结合的染色质变得容易被蛋白质复合物所接近和结合，从而促进基因的转录和表达。
目前，研究者们已经发现多种染色质打开的机制，其中最为重要的机制是去乙酰化和DNA甲基化。
去乙酰化是指除去乙酰化修饰，使得染色质结构松散的过程。
该过程是由乙酰化酶和去乙酰化酶调控的，而这些酶的活性和沉默状态可受到内源性或外源性刺激的影响。
例如，当细胞处于低氧、低营养等应激条件下，细胞代谢状态发生改变，乙酰化酶活性下降，去乙酰化酶活性升高，从而促进染色质松弛。
DNA甲基化是另一种影响染色质可达性的机制。
DNA甲基化指DNA上嘌呤环C5位碳上的甲基化修饰，这种修饰在高度甲基化的片段会导致染色质紧密结合，从而抑制基因的转录和表达。
在真核生物中，现有的研究结果表明，DNA甲基化与转录的关系是复杂的，活跃的基因区域通常是低甲基化的，而对应着不活跃的基因区域则是高甲基化的。
三、蛋白质表达对染色质开放的调节蛋白质表达分为翻译和后翻译调节两个层面。
翻译调节包括多个细胞器和蛋白质分子的参与，在此不做过多赘述。
后翻译调节主要包括mRNA降解、翻译后修饰等等，可以通过改变染色质的状态来调节蛋白质表达水平。
蛋白质表达的常见问题及其解决办法
蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。
然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。
本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。
一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。
不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。
常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。
找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。
解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。
对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。
对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。
此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。
二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。
在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。
解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。
分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。
此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。
三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。
然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。
解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。
首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。
其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。
此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。
四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。
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• mRNA的生物合成 • 蛋白质生物合成 • 原核生物表达系统 • 真核生物表达系统 • 蛋白质的纯化方法
mRNA的生物合成 (转录)
• 目的基因 • RNA聚合酶 • 启动子 • 转录终止信号 • 转录因子等等
启动子
• 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异 结合的部位。 某个基因是否表达决定于特 定的启动子的起始转录。
宿主染色体DNA整合
• 如果将目的DNA直接引入宿主生物的染色体中， 就能克服质粒丢失的问题。目的基因整合到宿 主染色体时，染色体整合位置必须在所需的编 码以外，即，DNA序列必须插入到染色体中特 定的非必要位点，两个DNA分子之间只要发生 同源重组即可。为了将DNA整合到染色体中， 插入DNA一般至少需要与染色体DNA有50个核 苷酸相同的序列。
标签 • 一个转录终止信号 • 一个分泌信号肽（分泌型）
融合蛋白
融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连 接起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用： • 提高外源蛋白在表达系统中的稳定性 • 增加外源蛋白在表达系统中的表达量 • 增加目的蛋白的溶解性 • 作为抗原的标记蛋白 • 易于外源蛋白的纯化
• CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助 酶分子正确定向,以便DNA结合。
• CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合， 从而提高与其特定启动子结合的概率。
由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻 遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利 用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌 才能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强 诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可 供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分 利用乳糖。
z：β-半乳糖苷酶 y：通透酶 a：转乙酰基酶
乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负 性调控而实现的： • 大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于 阻遏状态。i基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋 白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶 与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。 • R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中 还有极低水平的β-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表 达）。
单颗粒病毒粒子
多角体
哺乳动物细胞表达系统
• 哺乳动物细胞表达系统最大的优点是能表达翻译 后修饰过的外源蛋白
• 哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培 养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长
• 常用的细胞系有：非洲绿猴肾细胞（COS）、小 仓鼠肾细胞（BHK）、人的胚胎肾细胞（HEK239）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）
由于P1ac是弱启动子，实际上的基因工程 应用中，通过1ac启动子-10区核苷酸突变 产生的1acUV5启动子经常用于质粒表达 载体中，这种启动子比野生型1ac启动子 更强。
• pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子 （T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。
• T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充 分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋 白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处 于沉默而不转录。
T7 lac 启 动 子 的 调 控
• 另一个为目的基因提供稳 定性保证的方法是在拥有 兼容的氯霉素抗性、编码 表达少量T7溶菌酶的宿主 菌（pLysS和pLysE）中 表达。 T7溶菌酶是一种 双功能蛋白：它能够切割 大肠杆菌细胞壁肽聚糖层， 也可与T7RNA聚合酶结 合，阻止转录。
pLysS 和 pLysE
• 表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解 • 细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热
大肠杆菌表达体系的转录调控
大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达
调控的单元，操纵元包括相关结构基因及其上游的
调控序列。
乳糖操纵元（lac operon）：
I
CAP P O
调控序列
z
y
a
结构基因
P：启动子 O：操纵子 I：调节基因
菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成 少，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄 糖可供利用时，cAMP含量就升高，cAMP 与cAMP的受体蛋白 CRP （cAMP receptor protein）结合变为CAP，并以二聚体的方 式与特定的DNA序列结合。
在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具 有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于 CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的序列特 征。因此RNA聚合酶难以与其结合。CAP能提高RNA 聚合酶与启动子结合常数：
蛋 白 的 糖 基 化
蛋白质的分泌
不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋 白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出 细胞。分泌性蛋白都有一段信号肽，即在蛋白 质合成过程中N端有一15~36个氨基酸残基的 肽段－－信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达 并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切 除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分 泌要简单得多。
真核生物表达系统
• 昆虫细胞表达系统 • 哺乳动物细胞表达系统 • 酵母菌表达系统
昆虫细胞表达系统
• 昆虫表达系统是利用培养的昆虫细胞或幼虫，通过 杆状病毒载体来表达哺乳动物细胞蛋白
• 允许插入较大的外源基因 • 可以胞内表达，也可以进行分泌性表达 • 能进行蛋白质翻译后加工:糖基化、磷酸化等等 • 杆状病毒具有宿主专一性，对其他动物是安全的 • 缺点：每表达一次蛋白都要制备新的病毒，蛋白质
距翻译起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3— -11bp）。 SD序列与16s rRNA3’末端碱基AUUCCUCC互补，控 制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密 码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译 效果。
mRNA5`-------UAAGGAGGU-----AUG 16S rRNA3` -------AUUCCUCCA-------
遗传密码与tRNA
除了极个别情况,遗 传密码在所有的有 机体内是相同的,但 是不同的有机体内 不同密码子的使用 程度不同。而这种 不同是由于tRNA在 不同的机体内的丰 度不同。
大肠杆菌
人
蛋白质前体的加工
• N端fMet或Met的切除 • 二硫键的形成 • 特定氨基酸的修饰 • 切除新生肽链中非功能片段 • 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 • 糖基化，磷酸化等等
哺乳动物细胞表达系统的表达载体
酵母菌表达系统
酵母菌表达外源基因的优势： • 全基因组已测序，表达调控机理比较清楚，遗传操作简
便 • 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 • 能将外源基因表达产物分泌至培养基中（分泌型） • 不含有特异性的病毒、不产生内毒素，ＦＤＡ认定为安
全的基因工程受体系统（Generally recognized as Safe
大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3`-端的互补性
AUG前后的核酸序列
真核生物无SD序列，但是有一个Kozak序列， 这个序列影响真核mRNA的起始翻译。这个序列 -3位的A最重要，而且在+4位最好是嘌呤，G是 最优的碱基。
-6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 G C C AC C AUGG
调节型强启动子
在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质 表达系统最基本的条件:
• 不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA。
• 强启动子使外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有 害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞 的必要的生理功能。
• 带有表达目的基因的质粒，在几次细胞分裂后会丢失。 • 解决的办法：引入强启动子并控制目的基因在宿主细胞
• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子 控制、λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。
• 在pET表达载体的T7启动子的下游有一个lac操纵 子序列，这个载体还有一个带有常规启动子以及
编码lac阻遏蛋白的序列（lac I）。T7启动子、lac 操纵子和lacI位置交错。
• pET表达载体在λDE3溶原状态下的大肠杆菌中， lac阻遏蛋白可以作用于大肠杆菌染色体上，抑 制宿主菌转录T7RNA聚合酶，也作用于T7启动 子下游的lac操纵子，以阻断任何T7RNA聚合酶 导致的目的基因转录。(保证表达质粒在宿主菌 中的稳定)
• 异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactoside IPTG），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏 蛋白特异性结合使阻遏蛋白R构象变化，诱导lac操 纵元的开放，但本身不受β-半乳糖苷酶的催化分解 而十分稳定。
CAP(cAMP activated protein)的正调控 • cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细
菌和相应的载体可供选择应用 • 易于进行遗传操作和高效表达 • 操作安全，致病能力低 • 生长迅速，培养代谢易于控制，成本相对低等等
大肠杆菌表达体系的缺点
• 缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达 真核生物的蛋白
• 缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构, 常形成不溶性包涵体 (inclusion body)
生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时 间。
蛋白质的生物合成（翻译）
• mRNA起始翻译受下列因素影响 mRNA的核糖体结合位点 AUG前后的核酸序列
• 遗传密码与tRNA • 蛋白质前体的加工 • 蛋白质的分泌
mRNA的核糖体结合位点
SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5`末端非翻译的前导区内，其起点
一些信号肽的一级结构
蛋 白 的 分 泌 （ 一 ）
蛋白的分泌（二）
革 兰 氏 阳 性 菌 蛋 白 的 分 泌
革 兰 氏 阴 性 菌 蛋 白 的 分 泌