蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和功能调控
蛋白质的修饰和功能调控蛋白质是生命体中最基本的分子组成部分之一，它们参与了细胞的几乎所有生物学过程。
然而，蛋白质单独的氨基酸序列并不能完全解释它们的多样功能。
蛋白质的修饰和功能调控起着非常重要的作用，通过化学修饰以及与其他分子的相互作用，蛋白质的功能可以被调节和扩展。
一、蛋白质修饰的类型及功能1. 磷酸化修饰磷酸化修饰是一种常见的蛋白质修饰方式，通过将磷酸基团共价地添加到蛋白质的特定氨基酸上，如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
这种修饰方式可以影响蛋白质的空间结构和电荷状态，从而改变其功能。
例如，磷酸化可以调节酶的活性，参与信号转导通路，调控细胞增殖和凋亡等过程。
2. 甲基化修饰甲基化修饰是一种将甲基基团共价地添加到蛋白质的氨基酸上的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的亲水性、电荷状态以及相互作用的能力，从而调节蛋白质的功能。
例如，甲基化修饰可以在染色质结构的调控中起到重要作用，调节基因的转录和表达。
3. 乙酰化修饰乙酰化修饰是一种将乙酰基团共价地添加到蛋白质的氨基酸上的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的结构和电荷状态，影响蛋白质的功能。
例如，乙酰化可以调节组蛋白的结构，影响染色质的结构和稳定性，从而调控基因的表达。
4. 糖基化修饰糖基化修饰是一种将糖基团共价地添加到蛋白质的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的结构、稳定性和溶解度，影响蛋白质的功能。
例如，糖基化修饰可以参与细胞黏附、信号转导和免疫应答等重要的生物学过程。
二、蛋白质修饰的调控机制1. 激酶和磷酸酶的作用蛋白质的磷酸化修饰通常是由激酶和磷酸酶调控的。
激酶可以添加磷酸基团到蛋白质上，而磷酸酶可以将磷酸基团去除。
这种激酶和磷酸酶之间的平衡调节，可以使蛋白质的磷酸化状态发生变化，从而影响其功能。
2. 转录调控因子的作用转录调控因子可以结合到蛋白质上，并改变蛋白质的修饰状态，从而调节蛋白质的功能。
通过与转录因子的相互作用，蛋白质可以参与基因的转录和表达调控。
蛋白质工程--3蛋白质的修饰和表达
2 蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定化主要是酶分子的固定
吸附法、交联法、包埋法、共价结合法 A）交联法 B）共价结合法 ➢载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度 和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团
➢反应必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中 进行
➢所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其他功能基团的 副反应尽可能少
3. 羧基的化学修饰 通过碳二亚胺法、混合酸酐法与蛋白质分子上的氨基形成
酰胺键
二硫键的化学修饰
二硫键的还原：必须使用超剂量的巯基乙 醇，同时用过羧甲基化处理
判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二 硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还 原双向SDS-PAGE电泳技术
2 蛋白质的位点专一性修饰
专一性： 试剂对被修饰基团的专一性 对蛋白质分子中被修饰部位的专一性
第三章 蛋白质的修饰和表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达
第一节 蛋白质的化学修饰
凡通过活性基团的引入或去除，而是蛋白质一级 结构发生改变的过程
影响因素： 1) 蛋白质功能基的反应活性 基团之间的氢键和静电作用 基团之间的空间阻力 2) 修饰剂的反应活性
1) 蛋白质修饰的交联方法和试剂
常用的方法通常有重氮化法、戊二醛法、过碘酸盐氧化 法、混合酸酐法及碳二亚胺法
A) 重氮化法: 重氮盐与蛋白质分子中的酪氨酸残基上的 邻位，即得到以偶氮键相连的结合物
B) 戊二醛法:戊二醛的两个醛基可以分别与两个相同或不 同分子上的伯氨基酸形成Schiff碱，将2分子以五碳链的 桥连接起来
1. 巯基的化学修饰
1）碘乙酸和碘乙酰胺 2）N-乙基马来酰亚胺：反应伴随光吸收的变化
蛋白质翻译后修饰包括磷酸化乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能
蛋白质翻译后修饰包括磷酸化乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能蛋白质是构成细胞的重要组成部分，它们在细胞内执行各种功能。
然而，在合成蛋白质的过程中仅仅翻译出氨基酸链还不足以确保完成蛋白质的结构和功能。
事实上，蛋白质在翻译后还需要经历修饰的过程，其中包括磷酸化、乙酰化和泛素化等多种修饰方式。
这些修饰过程不仅可以调节蛋白质的表达水平，还能调控其功能。
一、磷酸化修饰磷酸化是指通过酶类将磷酸基团添加到蛋白质的特定氨基酸上，通常是赖氨酸、苏氨酸或酪氨酸。
磷酸化修饰在细胞信号传导、细胞周期调控和基因表达等生物过程中起着重要的作用。
磷酸化能够改变蛋白质的电荷分布，从而调节蛋白质的结构和功能。
例如，磷酸化可以导致蛋白质的构象变化，从而改变蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，磷酸化还可以介导蛋白质的定位和降解，以及参与细胞信号传导的级联反应等。
二、乙酰化修饰乙酰化是指在蛋白质上添加乙酰基团，通常是赖氨酸残基。
乙酰化修饰通过乙酰转移酶进行，在细胞代谢、细胞周期调控和染色质结构维持等生物过程中发挥着重要的作用。
乙酰化能够调节蛋白质的功能和稳定性。
通过乙酰化，蛋白质的电荷分布和空间结构发生改变，从而影响蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，乙酰化还能够调控蛋白质的定位和降解，参与细胞信号转导和基因表达的调控等重要生物过程。
三、泛素化修饰泛素化修饰是指在蛋白质上添加泛素分子，通常通过泛素连接酶（E3酶）介导完成。
泛素化修饰在细胞质调控、蛋白质降解和细胞凋亡等生物过程中发挥着重要的作用。
泛素化修饰能够标记蛋白质，使其被泛素酶体降解并确保细胞内的蛋白质质量控制。
此外，泛素化还可以调节蛋白质的定位和活性，影响其与其他分子的相互作用。
综上所述，蛋白质翻译后的修饰过程如磷酸化、乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质的表达水平和功能。
这些修饰对于细胞内各种生物过程的调控起着重要的作用。
蛋白质修饰分析报告
蛋白质修饰分析报告1. 引言蛋白质修饰是指对蛋白质的某些残基进行化学变化或结构改变的过程。
蛋白质修饰在细胞中起着重要的调控作用，可以影响蛋白质的功能、定位和相互作用等。
本报告旨在对蛋白质修饰进行分析，探讨其潜在的生物学意义。
2. 蛋白质修饰的分类蛋白质修饰可以分为多种类型，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等。
下面对其中几种常见的修饰进行简要介绍：2.1 磷酸化修饰磷酸化修饰是指通过酶催化将磷酸基团添加到蛋白质中的氨基酸残基上。
磷酸化修饰可以改变蛋白质的电荷性质，从而影响其结构和功能。
此外，磷酸化还可以作为信号传导的一种方式，参与细胞内的多种生理过程。
2.2 甲基化修饰甲基化修饰是指在蛋白质中的氨基酸残基上添加甲基基团。
甲基化修饰可以改变蛋白质的亲疏水性质，影响其与其他分子的相互作用。
此外，甲基化修饰还可以调控基因表达、细胞分化和发育等过程。
2.3 乙酰化修饰乙酰化修饰是指在蛋白质中的赖氨酸残基上添加乙酰基团。
乙酰化修饰可以改变蛋白质的电荷分布，影响其与其他分子的结合。
此外，乙酰化修饰还可以调控细胞代谢、DNA修复和基因表达等生物学过程。
2.4 泛素化修饰泛素化修饰是指在蛋白质的赖氨酸残基上添加小分子泛素。
泛素化修饰可以标记蛋白质，使其被降解或参与其他细胞过程。
泛素化修饰在细胞质解中起着重要的调控作用，参与调控蛋白质稳定性和细胞周期。
3. 蛋白质修饰的分析方法3.1 质谱分析质谱分析是目前最常用的蛋白质修饰分析方法之一。
质谱分析可以通过测量蛋白质修饰后的质量差异来鉴定和定量修饰。
常用的质谱分析方法包括质谱质量计（MS）和质谱质谱仪（MS/MS）。
3.2 免疫印迹分析免疫印迹分析是一种通过特异性抗体与目标修饰蛋白质结合来检测和定量修饰的方法。
免疫印迹分析可以用于检测多种修饰，包括磷酸化、甲基化、乙酰化等。
3.3 组学分析组学分析是一种通过高通量技术来研究蛋白质修饰的方法。
常用的组学分析方法包括蛋白质芯片技术、质谱成像和染色质免疫沉淀等。
蛋白质合成、修饰及分泌
03
蛋白质分泌
囊泡运
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囊泡运输是指蛋白质在细胞内 合成后，通过一系列的囊泡转 运过程，将其从内质网等合成 场所转运至高尔基体进行加工 和修饰，再通过胞吐作用分泌 到细胞外。
囊泡运输是指蛋白质在细胞内 合成后，通过一系列的囊泡转 运过程，将其从内质网等合成 场所转运至高尔基体进行加工 和修饰，再通过胞吐作用分泌 到细胞外。
蛋白质合成、修饰及分泌
目
CONTENCT
录
• 蛋白质合成 • 蛋白质修饰 • 蛋白质分泌 • 蛋白质合成、修饰及分泌的相互关
系
01
蛋白质合成
氨基酸的合成
氨基酸是蛋白质的基本组成单 位，通过生物合成或从食物中 摄取来获得。
生物合成氨基酸主要通过转氨 基作用、脱羧基作用和氨基转 移作用等途径来完成。
不同的生物合成氨基酸的方式 不同，例如植物和微生物可以 通过光合作用将二氧化碳转化 为有机物，而动物则必须从食 物中摄取氨基酸。
核糖体合成
02
01
03
核糖体是细胞内合成蛋白质的场所，由大、小两个亚 基组成。
核糖体合成蛋白质的过程包括氨基酸的活化、肽链合 成的起始、肽链的延长和终止等步骤。
在核糖体合成过程中，mRNA作为模板指导氨基酸按 照特定的顺序排列，形成具有一定功能的蛋白质。
胞吐作用的异常可以导 致多种疾病的发生，如 神经退行性疾病、免疫 系统疾病等。
04
蛋白质合成、修饰及分泌的相互关系
合成与修饰的关系
合成是修饰的前提
蛋白质合成首先需要氨基酸按照特定 的序列连接成多肽链，然后经过翻译 后修饰，如磷酸化、乙酰化等，才能 形成具有生物活性的蛋白质。
什么是蛋白质表达如何进行蛋白质表达
什么是蛋白质表达如何进行蛋白质表达蛋白质是生物体内重要的分子，参与了许多生命活动。
蛋白质表达则是指基因信息通过转录和翻译过程，转化为蛋白质的过程。
本文将详细介绍蛋白质表达的定义、基本过程以及常用的蛋白质表达方法。
一、蛋白质表达的定义蛋白质表达是指基因编码的蛋白质合成的过程，它涉及到两个关键步骤：转录和翻译。
转录是将DNA模板上的基因序列转录成mRNA的过程，而翻译则是将mRNA的信息转化为具有特定功能的氨基酸序列。
蛋白质表达是生物学中一个极为重要的过程，它决定了细胞的功能、个体的特征以及整个生物体的生理和生化过程。
了解蛋白质表达的机制对于我们理解生物的内部机制以及研究疾病治疗具有重要意义。
二、蛋白质表达的基本过程蛋白质表达的基本过程包括转录和翻译两个阶段，下面将详细介绍这两个步骤。
1. 转录转录是指将DNA模板上的基因序列转录成mRNA的过程。
在细胞核内，DNA双链解开，RNA聚合酶与DNA模板特定区域结合形成转录起始复合物。
然后，RNA聚合酶沿模板链将新的RNA链合成，其中基因信息由DNA转录成mRNA。
转录可分为三个阶段：起始、延伸和终止。
起始阶段包括转录起始复合物的形成，聚合酶开始链合成。
延伸阶段是RNA链的延伸过程，该过程直到遇到特定的终止序列才停止。
终止阶段包括终止复合物形成和RNA链的释放。
转录生成的mRNA将带有一段非翻译区（5'末端和3'末端），这些非翻译区在成熟的mRNA中起调节功能。
2. 翻译翻译是将转录形成的mRNA的信息转化为氨基酸序列的过程。
翻译发生在细胞的核糖体内。
核糖体是由rRNA和蛋白质组成的细胞器，它可以识别mRNA上的密码子，并将其翻译成相应的氨基酸。
翻译的步骤包括起始、延伸和终止。
起始阶段是核糖体与mRNA上的起始密码子结合，并帮助tRNA带有初始氨基酸进入核糖体A位的过程。
延伸阶段是通过核糖体移动到mRNA的下一个密码子位置，并将带有特定氨基酸的tRNA聚集进核糖体A位，使氨基酸逐渐连接成多肽链。
蛋白质的修饰和表达
定向进化的应用
目标酶
所需功能
方法
结果
实施菌种
卡那霉素核苷基 转移酶
枯草杆菌蛋白酶
β-内酰胺酶 对硝基苯酯酶
胸苷激酶 β-半乳糖苷酶 砷酸脱毒途径
热稳定性
作用于有机溶 剂
作用于新底物
有机溶剂中的 底物特异性和
活性 第五特异性 基
因理疗 底物特异性
砷酸抗性
定位诱变+选择 易错PCR+选择
DNA改组+选择 易错PCR+重组
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反响条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件
• 2、pH值得变化：决定了具有潜在反响能力 的基团所处的可反响和不可反响的离子状 态。
• 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，
但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
•
• 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个 人造〔或化学修饰〕的多肽相缔合
Amps
Tetr
Tetr
Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，到达有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
5’ 3’
5’
3’ 3’
• 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反响可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。
• α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
蛋白修饰方式
蛋白修饰方式
蛋白质修饰是指在蛋白质合成后，通过化学反应或酶催化等方式对蛋白质的结构进行改变或功能进行调节的过程。
常见的蛋白质修饰方式包括：
1. 磷酸化（Phosphorylation）：通过添加磷酸基团，改变蛋白质的电荷分布和结构，从而调节蛋白质的活性、互作和定位等。
2. 乙酰化（Acetylation）：在蛋白质N-末端或赖氨酸残基上加入乙酰基，影响蛋白质的稳定性、亚细胞定位和相互作用等。
3. 甲基化（Methylation）：通过在蛋白质上引入甲基基团，调节蛋白质的结构和功能，涉及到细胞分化、基因表达和转录调控等过程。
4. 糖基化（Glycosylation）：在蛋白质上加入糖基，影响蛋白质的稳定性、溶解性和识别性，参与细胞信号传导、免疫应答等生物学过程。
5. 泛素化（Ubiquitination）：通过连接泛素分子到蛋白质上，调节蛋白质的稳定性和降解，参与细胞周期、DNA修复和免疫应答等过程。
这些是常见的蛋白质修饰方式，不同的修饰方式可以对蛋白质的结构和功能产生不同的影响，进而调节细胞内的生物学过程。
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二、基因的融合
• 概念：不同的基因或者基因片段序列构成一 个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后， 获得由不同功能蛋白拼合在一起的新型多功 能蛋白。
• 原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，接上带有终止密码子的第二个蛋白或者 多肽基因，实现两个基因的融合表达
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基因融合的策略
1、方法
➢将融合基因通过合适的酶切位点直接剪切到适当
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化学修饰影响条件
1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个 必要条件；
2、pH值变化：决定了具有潜在反应能力的基团所 处的可反应和不可反应的离子状态；
3、温度：影响活性巯基的微环境 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机
溶剂可使蛋白质变性。
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二、蛋白质的位点专一性修饰
特点：试剂对被修饰基团、修饰部位具有专一性
类型
特点
应用
亲和标记 专一性标记酶活性部位 分离细胞表面受体
不可逆
光亲和标记 专一性标记酶活性部位 发现疾病相关的靶位点
不可逆
鉴别蛋白质
光反应基团
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三、蛋白质的聚乙二醇修饰
• PEG特点：亲水、不带电荷
• 结合机制：共价结合，形成屏障保护抗原，阻止免 疫反应和酶的水解
• 修饰方式：活化-OH（剧烈条件）
表真达核载表体达(体ex系pr：es酵si母on、v昆ec虫tor、) 哺乳动物 为使插入的外源DNA序列可转录和翻 译成多肽链而特意设计的载体称为表达 载体。
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蛋白质的化学交联
12
蛋白质的化学交联
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蛋白质分子固定示意图
14
15
第二节 蛋白质的分子生物学改造
• 基因突变 定点突变 定向进化
• 基因融合
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质粒
外源DNA
限制性内切酶
限制性内切酶 一、目的基因的获得
退火
目的基因
受体细胞二、重组
转化
五、外源基因在受体细胞内表重组达质粒
四带重筛、组选筛体的选细三和胞、鉴重定组接体受转了表达入重受组体目体的细的产胞细物胞17
侧链上的特定功能团发生化学反应 修饰类型：巯基、氨基、羧基、二硫键
3
（一）巯基的修饰
特点：亲核 最容易发生反应的侧链基团
修饰试剂 烷基化试剂 （碘乙酸、碘乙酰胺） N-乙基马来酰亚胺
DTNB
反应类型 羧甲基化
光吸收 二硫键、 有颜色的TNB
4
（二、氨基的化学修饰）
特点：亲和反应活性高 赖氨酸的ε –氨基
的信号肽之后；
➢在目的基因的两端分别加上不同的亲和标签；
➢将目标基因插入到信号肽序列和插入序列之间
2、影响基因融合的因素：
➢融合蛋白接头的设计和选择 ➢构建融合蛋白的常用技术
问题？
3、 主要应用
➢利用其生物学功能 ➢利用其与受体结合的特异性，构建导向药物
30
第三节 重组蛋白质的表达
克隆载体(cloning vector) 为依使据插其入宿的主外细源胞D的NA不序同列可被分扩为增: 而特 原意核设表计达的体载系：体大称肠为杆克菌隆载体。
修饰试剂
反应类型
TNBS
黄色复合物（420nm）
烷基化试剂
（卤代乙酸、芳基卤、芳族磺酸）
磷酸吡哆醛
光吸收
5
（三）羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性质使蛋白质 分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很 有限，产物一般是酯类或酰胺类。
• 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团， 最广泛，可在较温和的条件进行
• 偶连基团：氨基、巯基、羧基
• 优点：延长半衰期、较小毒性、血药浓度波动小、
酶降解作用降低……
?
• 应用： 天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶
PEG 修饰脂质体包被的阿霉素
10
四、蛋白质的化学交联和化学偶联
• 交联：含有双功能基团的化学试剂与蛋白 质分子间形成网状交联。
• 偶联：蛋白质分子偶联到一个化学惰性的 水不溶性的载体上。
第三章 蛋白质的修饰和表达
第一节 第二节 第三节
蛋白质修饰的化学途径 蛋白质改造的分子生物学途径 重组蛋白质的表达
1
第一节 蛋白质的化学修饰
一、蛋白质侧链基团的化学修饰 二、蛋白质位点的专一性修饰 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 四、蛋白质的化学交联和化学偶联
2
一、蛋白质侧链基团的化学修饰
修饰部位：蛋白质的侧链基团 修饰机制：选择性的试剂或者亲和标记试剂与
1、制造突变体
方法：易错PCR、DNA改组技术
易错PCR原理： 改变正常PCR反应体系 中某些组分的数量或者 质量，随组技术原理： 靶基因酶切产生随机DNA 片段，以3’-末端的片端为 引物和模板，随机互补结 合并延伸。 优点：突变率高、
6
（四）二硫键的化学修饰
• 修饰方法：还原 • 修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是
链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE 电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形 成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形 成二硫键。
外源DNA
酶切割
限制性内切酶
限制性内切酶
受体细胞
新突变质粒
转化
蛋白基因
退火
目的基因
核苷酸片段
重组质粒
筛选
表达
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盒
同时获得酶多切个割 突变体
式
蛋白基因
突
变
新突变质粒
核苷酸片段
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（二）定向进化（directed evolution）
• 范围：特定的蛋白质 • 条件：大量突变体、合适的筛选系统
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（一）定点突变
• 定义：改变一个或两个碱基 • 特点：突变率高、简单易行、重复性好 • 方法：重叠延伸PCR技术、快速定点突变 • 应用：纤维蛋白酶原活化剂，降低血浆清
除率，延长血浆半衰期
18
1、重叠延伸PCR技术
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重 叠 延 伸
PCR 介 导 的 定 点 突 变20
2、快速定点突变
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质粒
适用不同物种
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2、筛选
方法：表型观察选择、高通量筛选 （1）噬菌体表面展示技术 概念：外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合存于噬菌体表面的技术 特点：基因型和表型统一在同一病毒颗粒内
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噬 菌 体 展 示 技 术 的 基 本 原 理
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（2）核糖体展示技术 原理：
该技术是基于一种稳定的抗体-核糖体-mRNA复合物的构象基 础。抗体蛋白与它的编码序列物理连接。抗体基因转录，产生 许多mRNA分子，每一个代表着不同抗体基因。mRNA分子与 细菌的核糖体孵育，然后mRNA翻译成蛋白质。每个复合体展 示一种不同的抗体，当经过一个含有靶标抗原的亲和柱子后， 一些能结合上去的复合体不会被洗去，该展示技术完全在体外 完成，并且不需要克隆就能完成大规模抗体库的构建。