基于量子点标记抗核抗体检测及在Hep-2细胞中的免疫荧光成像

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虞伟ｈ，李晓军１．张宇２，罗冰１，房国祥１，白彩琴１．武建国１，顾宁２（１．南京军区南京总医院解放军临床检验医学研究所．南京２１０００２；２．东南大学江苏省生物材料与器件重点实验室，南京２１００９６）

［摘要】目的：对基于量子点（ＱＩＭ５５）标记抗核抗体（ＡＮＡ）间接免疫荧光（ＩＩＦＡ）检测与细胞成像效果进行

评价。方法：以ＨＥｐ－２细胞为实验基质片。ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子点标记二抗。采用ＩＩＦＡ对ＡＮＡ进行检测，记录不同ＡＮＡ阳性血清产生的免疫夔光模式，单特异性ＡＮＡ同时用免疫印迹法确认，并与ＦＩＴＣ标记检测结果进行对比分析。结果：Ｑ０６５５标记荧光优先与细胞策内抗原－抗体反应．对阎期细胞核仁、着丝点与核均质型的染色相对较弱．但在分霉【期细胞中，与ＦＩＴＣ荧光标记所测核颗粒型与核均质型ＡＮＡ蛄果趋近一致。在２３倒ＡＮＡ阳性样本中ＱＤ标记共发现有１５侧呈现胞浆内红色颗粒荧光．其中１２例被证实分别舍有抗核糖体Ｐ蛋白、ＡＭＡ—Ｍ２或抗Ｊｃ－１等自身抗体．另有３倒胞策呈阳性的靶抗原性质不明．而ＦＩＴＣ标记倪检测出９例呈现胞裳内颗粒绿色荧光。基于相同的实验条件．ＦＩＴＣ标记检出有１０倒呈明显棱仁阳性．而ＱＤ标记住检出５倒，且仅有部分比例的细胞核仁呈阳性反应。将ＱＤ６５５与Ｆ兀℃标记物联合应用．驯目基质片细胞所处周期不同而致ＡＮＡ阳性荧光掺八比倒存在一定差异．使得细胞核荧光染色存在不均一性．分别见有不同程度的亮黄色、红黄色、黄绿色和绿色荧光染色。结论：ＱＤ６５５标记ＡＮＡ间接免疫荧光检测是可行的，井具有方法敏感和实验结果稳定的优点。与ＦＩＴＣ标记联合应用将有助于区分和展示不同细胞周期桉内靶抗原分布厦可结合抗原－抗体复合物量的盖异，井可有效时ＡＮＡ水平作出合理评估。【关键词】量子点；抗核抗体；间接免痘荧光实验；硫氰酸荧光素

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［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｖａｈａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｅｌｌｉｍａ西ｎｇｏｆａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒａｎｔｌｂ０（１ｉｅｓ（ＡＮＡ）ｔｅｓｔｅｄｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏⅡｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ（ＩＩＦＡ）ｂａｓｅｄＯｎｑｕａｎｔｕｍｄｏｔＢ（ＱＤ８）ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＵｓｉｎｇＨＥｐ－２ｃｅｌｌｓ∞ｅｘｐｅｆｉ－

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１２２：基金项目］中国博士后科学基金特别赍助项目（２００８０１３７５）・通讯联系人，虞伟，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｗ葩ｌｌ＠１２６—全军生物医药博士后论坛学术论文集ｐｈ，ｍ．ｂｕｔｗｅａｋｌｙｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｉｎｌｃｌｐｂｅｓｅ－ｃｅｌｌｎｕｃｌｅｉ．ｎｕｃｌｅａｒｅｅｎｔｒｏｍｅｒｅａｎｄｎｕｃｌｅａｒｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐａｔｔｅｒｎｍｌａｔｉ＊ｌｙ．Ｙｅｔ，ＡＮＡｒｅｓｕｌｔｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｎｕｄｅａｒｇｒａｎｕｌａｒａｎｄｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐｌ‰ｗｈｉｃｈｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙＱＤ６５５ａｎｄＦｉｒｅｃｏｎ—

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抗核抗体（ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｂｏｄｙ，ＡＮＡ）是一组针对真核细胞各种细胞核成分自身抗体的总称，目前已发现并被命名的有高达上百种之多，该抗体可见于多种结缔组织病患者中”ｑ。。随着研究的不断深入，现代ＡＮＡ概念又有了扩展并被赋予新的内涵，其靶抗原分布已不再仅局限于细胞核，而是包括针对细胞内所有抗原，如细胞浆、细胞骨架及细胞分裂周期等相关的核酸及核蛋白成分“４川。间接免疫荧光实验（ＩＩＦＡ）作为细胞内抗原定位及ＡＮＡ筛查的“金标准”，临床实验室已将其广泛

应用于自身免疫性疾病的辅助诊断中”ｑＪ。由于传统有机染料（如ＦＩＴＣ等）存在发光时间短、荧光容易淬灭及灵敏度相对较低等缺陷，无法对被标记物进行长期追踪及观察被标记物功能信息的动力学过程．因而在应用方面有其本身的局限性。量子点（ｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｓ，ＱＤ）因具有良好的光电性能、尺寸效应（通过调整ＱＤｓ自身尺寸即可得到不同颜色的发射荧光）和抗光漂白等特点，在一定程度上解决了上述存在的问题，并可能取代传统染料而成为新一代荧光标记物”¨”。。为客观评价量子点标记在ＡＮＡ检测与细胞成像中的应用效果，建立科学的实验与操作流程，本文选择以Ｈｅｐ－２细胞为实验基质片。用ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子点（ＱＤ６５５）耦联羊抗人ＩｇＧ的Ｆ（ａｂ’）：片段作为标记抗体，对其实验反应条件进行了系统观察和优化，同时与基于ＦＩＴＣ标记抗体ＡＮＡ检测结果进行了对比分析和讨论。

１对象与方法１．１待测血清２３份不同程度的ＡＮＡ阻性血清均取自我院临床确诊的各类自身免疫病患者，其中系统性硬化症（ＰＳＳ）２例，原发性胆汁性肝硬化（ＰＢＣ）３例，干燥综合征（ＳＳ）１例，多发性肌炎／皮肌炎（ＰＭ／ＤＭ）１例，符合美国风湿病学会１９８２年诊断标准的系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）患者１６例”“。ＡＮＡ阴性血清柏份，均取自我院健康体检者。抗线粒体抗体（ＡＭＡ）阳性参考血清购自德国欧蒙公司。１．２主要试剂与仪器ＩＩＦＡ法ＡＮＡ检测试剂（舍Ｈｅｐ－２细胞及Ｆｒｒｃ标记羊抗人ＩｇＧ等）和免疫印迹技术（ＩＢＴ）检测ＡＮＡ抗体谱试剂盒，均购自德国欧蒙公司，量子点标记抗体［ＱＤ—ＧＡＨＩｇＯ－Ｆ（ａｂ’）：】购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，按・１２３・