光谱分析技术

偏离Lambert Beer定律的因素 Lambert（三）偏离Lambert-Beer定律的因素 应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学 应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学 Lambert 和化学两方面的因素。 和化学两方面的因素。
光学因素： 1．光学因素： 要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽， 要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其 误差越大。 误差越大。 化学因素： 2．化学因素： 浓度、pH、 浓度、pH、溶剂和温度等因素可影 响化学平衡。 响化学平衡。
A = KLC
Lambert-Beer定律适用于可见光 紫外光、 定律适用于可见光、 （Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红 外光和均匀非散射的液体。） 外光和均匀非散射的液体。）
式中A为吸光度； 为比例常数，称为吸光系数； 式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径； 层厚度，称为光径；C为溶液浓度
活性氧及抗氧化系统指标测定
一、过氧化氢含量的测定 与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物— 原理】 【原理】H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物 钛复合物黄色沉淀，可被H 溶解后， 钛复合物黄色沉淀，可被 ２SO4溶解后，在415nm波 波 长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H 长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与 2O2浓 度呈线性关系。 度呈线性关系。 【试剂】 试剂】 丙酮试剂： 分析纯H 100µmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯 2O2 57µl， 分析纯 ， 溶于100ml，再稀释 硫酸； （ 溶于 ，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V） 倍 硫酸 ） 硫酸钛；丙酮；浓氨水。 硫酸钛；丙酮；浓氨水。
0.1 0.2 0.2
2M 硫酸
3000r/min 离心10min，弃去上清夜， 留沉淀 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
待沉淀完全溶解后，将其小心转入 容量瓶中， 待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中， 容量瓶中 并用蒸馏水少量多次冲洗离心管， 并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后 定容至10ml刻度，415nm波长下比色。 刻度， 波长下比色。 定容至 刻度 波长下比色 2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织 样品提取和测定： 称取新鲜植物组织 称取新鲜植物组织2~5g 样品提取和测定 含量多少而定），按材料与提取剂1∶ 的 ），按材料与提取剂 （视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂 ∶1的 比例加入4℃ 比例加入 ℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀 浆后，转入离心管3000 r/min下离心 下离心10min，弃去 浆后，转入离心管 下离心 ， 残渣，上清液即为样品提取液。 用移液管吸取样 残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样 品提取液1ml，按上表加入 硫酸钛和浓氨水，待 硫酸钛和浓氨水， 品提取液 ，按上表加入5%硫酸钛和浓氨水 沉淀形成后3000rpm/min离心 离心10min，弃去上清液。 沉淀形成后 离心 ，弃去上清液。 沉淀用丙酮反复洗涤3～ 次 直到去除植物色素。 沉淀用丙酮反复洗涤 ～5次，直到去除植物色素。 (3)向洗涤后的沉淀中加入 向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸 硫酸5ml，待完全溶 向洗涤后的沉淀中加入 硫酸 ， 解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。 解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 Cu 为标本管浓度和吸光度 管浓度和吸光度。用标准品法定量时， 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近。 和标本管浓度相近。
3．其它分析方法
包括差示法、多组份混合物分析和利用 包括差示法、多组份混合物分析和利用 摩尔吸光系数分析等方法 分析等方法。 摩尔吸光系数分析等方法。
发射光谱分析技术： 发射光谱分析技术： 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法， 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，
散射光谱分析技术
一、分光光度技术的基本原理
（一）吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况： 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分 光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。 光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射 光强度为I 透射光强度为I 之比称为透光度，即 光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度 即：
光谱分析技术
分光光度技术的基本原理 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法
光谱分析技术原理： 光谱分析技术原理：
利用各种化学物质都具有发射、 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱 谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。 谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类： 光谱分析技术分类：
2、粗酶液的制备：取样品，加入5倍于样 、粗酶液的制备：取样品，加入 倍于样 品量的50 磷酸缓冲液[含 品量的 mmol/L pH7.8磷酸缓冲液 含 磷酸缓冲液 0.1mmol/L EDTA; 0.3%(w/v)TritonX100; 4%(w/v) PVP], 研磨后以纱布过滤， 研磨后以纱布过滤， 并以10000g离心 min, 上清液为粗提液。 离心20 上清液为粗提液。 并以 离心
三、分光光度技术的定量方法 1.标准曲线法 1.标准曲线法
方法： 方法：
根据Lambert-Beer定律， 根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范 Lambert 定律 围内与吸光度成正比关系。 围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准 品溶液（浓度应包含高、 低浓度范围）， ），按标 品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标 本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度， 本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度， 以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标， 以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对 应各点连成一条通过原点的直线， 应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标 准曲线。待测溶液测定吸光度后， 准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可 查出其相应的浓度。 查出其相应的浓度。
O2·-产生速率的测定： 产生速率的测定： 产生速率的测定 0.5 ml粗酶液中加入 粗酶液中加入0.5 ml 50 mM 磷酸 粗酶液中加入 缓冲液（ ），1 盐酸羟胺， 缓冲液（pH7.8）， ml 1mM盐酸羟胺， ）， 盐酸羟胺 摇匀， 摇匀，于25℃保温 min，然后再加入 ℃保温30 ，然后再加入1 ml 17 mM 对氨基苯磺酸和1 ml 7 mM α对氨基苯磺酸和1 萘胺，混匀， 测定530 萘胺，混匀，于25℃保温 min测定 ℃保温20 测定 nm处的 值。 处的OD值 处的
亚硝酸根标准曲线的制备
1、配置1ml系列浓度的 、配置 系列浓度的NaNO2溶液， 溶液， 系列浓度的 分别加如1ml水，1 ml 17 mM 对氨 分别加如 水 基苯磺酸和1 萘胺， 基苯磺酸和 ml 7 mM α-萘胺， 萘胺 1mM盐酸羟胺，摇匀，于25℃保温 盐酸羟胺， 盐酸羟胺 摇匀， ℃ 20 min，然后测定 处的OD ，然后测定530 nm处的 处的 值。
Lambert-Beer定律 定律， 据Lambert-Beer定律，当液层厚度为 cm，浓度单位为mol/L mol/L时 吸光系数K cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为 摩尔吸光系数(ε) (ε)。 的意义是： 摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层 厚度为1cm 物质浓度为1mol/L 1cm， 1mol/L时在特定波 厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波 长下的吸光度值。 是物质的特征性常数。 长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。
T = I/I0
T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度 100为T%称为百分透光度。 称为百分透光度 即：
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
Lambert-Beer定律 （二）Lambert-Beer定律
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。 表达式为： 表达式为：
丙二醛（ 丙二醛（MDA）含量的测定： ）含量的测定： MDA在高温下，能够与硫代巴比妥酸 （TBA） 在高温下， 在高温下 ） 反应，生成红棕色的三甲川， 反应，生成红棕色的三甲川，其最大吸收 波长在532 nm，但测定植物组织中的 波长在 ，但测定植物组织中的MDA时， 时 易受可溶性糖的干扰。 易受可溶性糖的干扰。 称取1g根，加入10%TCA 2 ml和少量石英砂， 和少量石英砂， 称取 根 加入 和少量石英砂 研磨至匀浆，再加8 进一步研磨， 研磨至匀浆，再加 ml TCA进一步研磨，匀浆 进一步研磨 4000×g离心 min，上清液为样品液。显色 离心10 × 离心 ，上清液为样品液。 反应和测定： 样品液， 反应和测定：取2 ml样品液，加入 ml 0.6% 样品液 加入2 TBA溶液，摇匀后置沸水浴中反应 min，冰 溶液， 溶液 摇匀后置沸水浴中反应15 ， 浴中迅速冷却后4000×g离心 离心10min，取上清 浴中迅速冷却后 × 离心 ， 液测定532、600和440 nm波 液测定 、 和 波
2．比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 同时测定标准管和标本的吸光度， 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为： 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
Cu=(Au×Cs)/As
1.制作标准曲线：取10ml离心管 支，顺序编号， 制作标准曲线： 离心管7支 顺序编号， 制作标准曲线 离心管 并按下表加入试剂。 并按下表加入试剂。