用PCR扩增cDNA库中的特异序列
PCR基因扩增技术原理及特点
PCR基因扩增技术原理及特点基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重点革新。
PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA 双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对依据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。
此引物范围就在包含所欲扩增的DNA片段，一般需20—30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。
引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原材料按5到3方向将引物延长、自动合成新的DNA 链、使DNA重新复制成双链。
然后又开始第二次循环扩增。
引物在反应中不但起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。
新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。
如此重复上述DNA模板加热变性双链解开引物退火复性在DNA聚合酶作用下的引物延长的循环过程，使每次循环延长的模板又加添1倍，亦即扩增DNA产物加添1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。
PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。
E为PCR循环扩增效率。
设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。
可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。
PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵从酶促动力学原理。
靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的渐渐积累，当引物模板/DNA/聚合酶实现肯定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再加添，即显现所谓平台效应。
用PCR技术从cDNA文库中获取目的基因长片段.
◇实验方法学◇用PCR技术从cD NA文库中获取目的基因长片段3汪思应郑红程洁余科科许望翔1李俊23(安徽医科大学病理生理学教研室、2临床药理研究所,合肥230032摘要目的建立一种简便有效的获取cDNA大片段的实验技术。
方法应用PCR原理,设计特异引物结合文库载体引物对大鼠胎肝cDNA文库进行PCR扩增;用随机引物标记法标记已知小片段“目的基因”(300bp±作为探针,对PCR产物进行S orthern杂交以检验“目的基因”片段的正确性及长度;回收“目的基因”片段并连接入PGEM2T载体,转染J M109并扩增后,提取“目的基因”测序。
结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增产物有多条不同长度的段,S orthern杂交发现一段长度为115kb的cDNA片段为“目的基因”;测序结果与G eneBank进行Blaste分析,该基因为一株新的序列,已在G eneBank中登录注册(Rat Liver Regeneration2related Pro2 tein1,RLRP21AF236054。
结论应用PCR结合S orthern 杂交等手段可迅速从cDNA文库中获取长片段目的基因。
关键词基因;实验方法;PCR随着分子生物学研究的发展,人们已建立了多种方法来获取“目的基因”。
但传统的菌落杂交筛库技术操作繁琐、耗时长且可靠性不高[1];多种获取cDNA的试剂盒价格昂贵且有时需特殊仪器,因此我室利用简单的PCR技术从cDNA文3国家自然科学基金(39670366及安徽省自然科学基金(00044202 1军事医学科学院,北京1008503通讯作者库中获取“目的基因”大片段。
并用已知小片段目的基因作为探针来鉴定PCR产物以确保实验结果的正确。
现报道如下。
1材料与方法1.1材料Wistar大鼠购自军事医学科学院动物中心;大鼠胎肝cDNA文库购自Clonetech公司;探针标记试剂盒购自Promega公司;α232P(dCTP购自北京亚辉放射生物公司;PCR 试剂购自宝生物(大连公司。
小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定
小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定一、本文概述本文旨在探讨小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定。
我们将详细介绍Zhangfei基因在小鼠体内的功能和作用，以及其在生物学研究中的重要性。
接着，我们将阐述过表达和shRNA干扰技术在基因功能研究中的应用，并解释为何选择慢病毒载体作为本研究的工具。
在构建过表达慢病毒载体方面，我们将采用基因克隆技术将小鼠Zhangfei基因插入慢病毒载体，以实现目的基因的高效表达。
同时，我们将对构建的过表达载体进行严格的鉴定，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。
在构建shRNA干扰慢病毒载体方面，我们将设计并合成针对小鼠Zhangfei基因的特异性shRNA序列，并将其插入慢病毒载体以干扰Zhangfei基因的表达。
我们将对构建的shRNA干扰载体进行同样的鉴定步骤，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。
我们将对构建的过表达和shRNA干扰慢病毒载体进行功能验证，以评估其在小鼠体内对Zhangfei基因表达的调控效果。
本研究的成果将为进一步揭示Zhangfei基因的功能和机制提供有力的工具，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
二、材料与方法2 载体：慢病毒载体pLV-IRES-Puro和pLV-shRNA2购自Clontech 公司。
3 酶和试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR 引物、PCR试剂等购自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS）和DMEM培养基购自Gibco公司；脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠Zhangfei基因的cDNA序列通过PCR从小鼠cDNA文库中扩增得到。
4 仪器：PCR仪、凝胶电泳仪、超净工作台、离心机、细胞培养箱、荧光显微镜、倒置显微镜等。
用cdna为模板扩pcr流程
用cdna为模板扩pcr流程英文回答：PCR (Polymerase Chain Reaction) is a widely used technique in molecular biology for amplifying DNA sequences. It allows researchers to obtain multiple copies of aspecific DNA fragment from a small amount of starting material. cDNA (complementary DNA) can be used as atemplate for PCR when the target DNA sequence is derived from mRNA.The first step in the cDNA-based PCR process is to synthesize cDNA from the mRNA template. This is achieved using reverse transcriptase, an enzyme that synthesizes a complementary DNA strand from an RNA template. Theresulting cDNA is then used as the template for PCR amplification.Next, a pair of primers specific to the target DNA sequence is designed. These primers are short, single-stranded DNA molecules that bind to the complementary sequences on each end of the target DNA fragment. One primer binds to the sense strand, while the other binds to the antisense strand of the cDNA template.The PCR reaction mixture contains the cDNA template, the primers, DNA polymerase, nucleotides, and buffer. The reaction mixture is subjected to a series of temperature cycles in a thermal cycler machine. Each cycle consists of three steps: denaturation, annealing, and extension.During the denaturation step, the reaction mixture is heated to a high temperature (typically 94-98°C) to separate the double-stranded DNA into single strands. This allows the primers to bind to their complementary sequences on the cDNA template.In the annealing step, the reaction mixture is cooled to a lower temperature (typically 50-65°C) to allow the primers to bind to their target sequences on the cDNA template. The primers serve as starting points for DNA synthesis.In the extension step, the reaction mixture is heated to a modera te temperature (typically 72°C) to allow the DNA polymerase to synthesize new DNA strands. The DNA polymerase adds nucleotides to the primers, extending the DNA strands in the 5' to 3' direction.After each cycle, the number of DNA copies doubles, resulting in exponential amplification of the target DNA sequence. The PCR process typically consists of 25-35 cycles, which can generate millions to billions of copies of the target DNA fragment.Finally, the PCR products are analyzed using gel electrophoresis or other methods to confirm the presence and size of the amplified DNA fragments. The amplified DNA can then be further analyzed or used for downstream applications such as cloning, sequencing, or gene expression studies.中文回答：PCR（聚合酶链反应）是分子生物学中广泛使用的一种技术，用于扩增DNA序列。
cDNA序列和PCR方法
1.红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）序列CD8αcDNA序列GenBank登录号：NC_018908 序列长度：1702bp GTAAAGAACAATTGGTTGCTTTTGCCATCGGCGAGGAGAAAATGGAGCAAAAGTGGAGGAAGGTTC TGGTGTTTCTGGTGTTTTGTCAGCGTAAGTTTGCGTGGTCTTTAAGGTCGGGCCCGTTTGTTGCCCT TGGTGCCGCCGACTGTTGAAAACTCTTATCGCTCCTTTCAGAAACAACCCCTGGAGACAATCAGAAG GAAGACGTTGTGAAGGAGGGCGCCCAGGTGGACATTCATTGTCAACCCAGCCAGGCGGCATCCATGA CCGTCTGGTTTCGAGTGCGGGACAACTCTTGGATGGAATTCATCGGTTCTTTCAGCAACGGATTGAA GAAGACGGAAAACAACGTCAGCTCGGAGTTCACCCATGGGAAGATCAACAGAGACATCCTGACCCTG AAGTCGTTCCAACGACAAAAGGACAGCGGCCTGTACTGCTGCGCGTCGCTCTATAAGGGTAAAGAAC TCCGGTTCGGGCCGGTGACCCAGCTGCGTGGAGGTGAGTTCTCCGACTTTAGTCCGCCGACGCTAAA AGAGGAACGTCTGAACGGGCCCGGTCCTTCCTCTCCGCAGAAACGGTCGAGCAAAAACCCACGGTCG CTCAAACGACGCCGAGGCAACAACCAGTGACGACCGCGCCGGCGTGCACGTGCGACAGCAGCAAGGC CAGAGGTTAGTGTTTGGGATCAGCCTAGAGAGGAGCGACGCCGCGGCGGCACCGATGGCCACTAAAC CCGCTTTCTTCCAGGGGGAATCGGGACCCAGCTCTCCTGCGCGCCGCTGATTCTGGGCCCGCTGGCC GGCGGCTGCGGCCTTCTTCTCCTCCTCCTCATCGTCACCGCTTTGTACTGCAACAGTGAGTGCTGTTC TGGGCTCACGCCAACGTTTTCACCCTCTCCATAACTAAAAATGTGTTTCCTGCTGCAGGAGTAAGAA CCCGGAGATGCCCGCACCATTACAAAAGAAAGTAAGACGGTTTTATTTTGCTTTATCTTTTTGGGCT TCAGGAAAATCATTTTATTTGAAATTAGTTTTAATTTTTAAATGATAAATTAAAAACTAATCACATT GTTGCCTAAATTTGTAACCGATTGTCTTTTAATTGTTGTTCTGTAAGGCCAATTATGATCTTAAGGA AATTTTATAGAAAATTTAGTAAATTTCAAATTAAATTTAACTCCAAATGAAGTTTCTTCTCTAATCT TTAAAAATTAAATGCCGTCATTGGTACAAGCTACAATTAGCTGTAACTAGTATTAATATTCTTATTGT TAACAGAAAATGTCTTTAATTTTAATGTCTTCAAATATAACAAATCTGTGGATTTTTACGCTCCGTC TCTCGGTTGCAGACCTCGGGGGAAGCCTCCTGGAAACAAATGACAACCGTCGGAGAAGTTATGTCGA AATGGTGCCGTTTCTACAGTTATTTTCTTTGATCTCAAGTCTGGTTTCATCTCGTTCACGGGTTCAC AAATTTACAGGAGGACTGATGTCGCAATATTTTTAAGTTCAACTAAATCAATGTTGACGCCACTTCA AATGTAAGTAATATAGTTTGTGTGTAGTTGTGATGCCTATTTTTGTTTACATGAGCCACATTCATGGT TGCTAATTTGCATCTATTTAACAACTGAATGAGGCTTTTAAACATTACCTTTAATTACAATAAATGA ATTAAAGCCTGTAGATGCAGCTTCACD8βcDNA序列GenBank登录号：NC_018908 序列长度：2809bp TCTGCAGCAGACAGACAGCAGGAAAAGAAAGTATCAGCAGCGTCCGCCAGACACCGTTCATGGCTCG CACAGGCGCCGGCACCACAATGATCCTGCTGACCCTGGCGTGGACCCTGCTGACGGCATCGCAGGCG TCAGGTGAGGGGGTCAAGTTGGCTTTATCGTGGCTAGCCCAGATTATCGTCGGTGTCTTGACTCAGA TGGGACGGAGGCGTCAACTGTGCGCTGATGCGTTCTGTCCTGTTTGATCTGTTCTGTCTAAGATGTT TAATGGAGGTTTTTTTTGTCAGTTTGTACTGAAGTTTAAATATTTCTTTCATGTGTGATCAAAGAAA AATGTAAACGCTTGTGTTGACTGACAAGTGCCGCTTGATAGTCTGGAGCTGATTTCTCCGAATGTTT GTAAAAATAGCCCCAAAAGCAGAAAGTGACTGGCCTGAGACCAGCGTGAACGCGTCTAATCCAGATT AAGGGAGAATGCTAGTAAATGACACGAGAACAAATGTGCTCGTTTCCGTTTTCTGGTGGATCGACGA AGGATCAGTAATGTGAATCCACGTTTCGAAAATTTTTTGATCGTATCTCCAAGAAGAGAATCACAGT TTTAAGCGATTACAAAAACTGTGAATTCTGATGTTAAATAAAGTCGCCTGATCGGCGTCAAATTACG ATTTCTTCATAGTTTGACCACCCAACACGTTTGCCGTTGCTCCATCTTTCCGTCGTACCTTCCTCTGC CTCGGCGCAGCGGTTGATGCCTCTTCGGGCCTCTTCAGAGGCCATCAAAGCATCAAAGCGAATCTCG GCGAATCTTGGCACACATCAATGGCCGGTGCGCACTGGCCATTGATGTGTTGGAGCTCGAGCTTTCA CAGATCCTGAAGGGATCGTCGGACACGTTTCGTGCCGCCGCCGACCCCCGAGGCTCAACATTCGGGT CTCAATGACCTTTTGGAATCATCTCTCTGTTCCCACAGATCCGAACGTCATCCTGTCTCAAGAAATGCTAGCAGCTCTTTACCCCAAGCTCCTCAGCAACGGCACCGTCCCCTGTGACTGCCGGAACGTCCAATG CGACTCCGTCTACTGGTTCCGCACCGTCCTCGCTACCAGCCAAGTGCAGTACCTGGGCCGGCTGAACA ACGCTAACATTGCCAACCACGGGGTCGGCGTGAACAAAGCACGGTTCTTATTTAAAAGGAAGACCAA GACGTCGTTTATGCTGAACATCATCAAGGTGACGGAGGAGGACACGGGGATTTACTCGTGCGTCCTG ACGGACAGGAAGAACACAGAAGTGTGGAAGTCTGGGATCCTTCTGCTGCCGGGAGGTTTGTAGGGA GGCTGAAGCAAGTCGACCTGTTTGATAGGCGGCAGTGTTAAAGAGTTCACGAAACGCTCCGTAGAAT GCTTTAAACTCGAGGCGTGAGCTTCCGAATCGCTTTATTCTCATCATAATGCTGCTTCAAAAGTATG AAATACTTTAAAAGCTACCGCGCCTTATCAAATAGTTTTTAGGTTTCTCCCCTTTTCATCACATTTCA AATGCAAATATATATATATATAATATATATATATTTTATCCTTCTACAATTGTTAAACTACTTATAATTC AGTATTACCATTGTTGATTCTATTGCATATAAAGGAGAATCATCCCAAACCCTTCGCTGCTGAACACA AGATAAAGCGGCGGAAAATCGGGCAGAAGTGACGAACGCGGAGGAAAATTACAAAACTTCAACCTC TATTTTTCTTTCAATTACAATTTCAGACTTTTGAAGACAAGTCAGAACTCTACCGACCCCTTTTAAA ACACGATTTTGTGCGTAGTTTAGACATATAAACTGCCTATTTTGATATCTGAGGGGTAATAGCTAATG CAGCTAAATGATAAATGCTGTATATTTGTAGCGAGAGTTTGTTCCTGGAGATGAGGGTCATTTATGC CATCCTCTCCGTCCTGTTTCTCCCAGTGATCCCACCAACCTTACCTCCAACCACCACAACCAAAGCGC CCATCAAGTCCATCTGTCGCTGCTCATCTCGGGGTAAATGTATATAAATGTATGTAAATGTATAATAA ATGTATATATTCAAAGTGGTGTTTACCATCATATCATTCCAGCAAATGGATGCAGCTCCCTGGTTCTG TGGCCTTTGGTGGGAATTTTGGCAGCTTTAGCTTTGACGCTCATCTGCACGCTGTACTACTTCAGCC GTGAGTAGAGGTCCAGTTACCGATCCCTCAGGTTAAATCTGTTAATATTTGATCTGATCCGTTCTCGC TTGCAGGGCTGCCTAAAAAATGTCGACACCGTTTTGTGAAGTAAGTAGAGAAATCAATATTTCCGAA TTCTTGAGGTCGTCCTGACGTGTGAAGGGAGTCTTTGTTTTCCGTCCCTTTTAGAAAAAGGCTGCTG ACCTAAAGCTTGTCCAGCTGTGTGGTGCAGTGTTAAATTCACGCTAGTCTCCATGGACCCGATTGGC CCCGAAGATCTACGGAACTTGGCTGAGATGATGCAACTCATCAGTAAAGCAAACCCGTTCCATAACG TGTCCTGATGCTCTGACTGGCGCGCCCAGTTCTCAGCTGAGATCTAATTTATTTTCTCATTTGTTGTG TTTTATACGCCACTATGCAGATGACGCCATGTTCTATTCCTCTTTAGTTTTATCGTATTGAGATTTTT TTTATCTTAGCTGAAGCCAGATCAGTTTATTATCCATCTCTCTCTGTTATTTGTTCCATTTTCAAGAA ACAAAATGTCTGGTGTGTACATCTGTCAAATAAAATATTTCTTACAAG2.PCR操作技术涉及的操作方法a)加样b)PCR反应：配制反应体系及PCR程序设定c)PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测：配胶，用透明胶封凝胶板，待琼脂糖凝胶冷却至50摄氏度后，加入Goldview染料，混匀，倒胶。
链特异性转录组建库流程
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基因工程试题
基因工程试题一、选择题（每题1分，共15分）1、下列有关基因的叙述，错误的是【A 】A 蛋白质是基因表达的唯一产物B 基因是DNA 链上具有编码功能的片段C 基因也可以是RNAD 基因突变不一定导致其表达产物改变结构2、基因工程的单元操作顺序是【B 】A 增，转，检，切，接 C 接，转，增，检，切 3、生物工程的上游技术是【A 】A 基因工程及分离工程 C 基因工程及酶工程 4、下列各组专业术语中，含义最为接近的是 【C 】6、T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA 片段连接在一起， 其底物的关键基团是【D 】A 2' -OH 和 5' -PB 2' -OH 和 3' -PC 3' -OH 和 2' -PD 5' -OH 和 3' -P7、下列有关连接反应的叙述，错误的是【A 】A 连接反应的最佳温度为37 ℃B 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%C 连接反应缓冲体系的ATP 浓度不能高于1mMD 连接酶通常应过量2-5倍8、原生质体转化方法不大适用于【A 】A 大肠杆菌B 枯草杆菌C 酵母菌D 链霉菌9、下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是【A 】A Cosmid >X-DNA > PlasmidB 九-DNA > Cosmid > PlasmidC Plasmid >X -DNA > CosmidD Cosmid > Plasmid >X-DNA10、若某质粒带有lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培 养基中加入【D 】A 半乳糖B 异丙基巯基-B-半乳糖苷（IPTG ）C 蔗糖D 5-溴-4-氯-3-吲哚基邛-D-半乳糖苷（X-gal ） 11、下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的 是【C 】 A 大肠杆菌一繁殖迅速 B 枯草杆菌一分泌机制健全 C 链霉菌一遗传稳定 D 酵母菌一表达产物具有真核性12、分子杂交的化学原理是形成【D 】A 共价键B 离子键C 疏水键D 氢键 B 切，接，转，增，检 D 切，接，增，转，检B 基因工程及发酵工程 D 基因工程及细胞工程A 终止子与终止密码子 C DNA 退火与DNA 复性5、根据酶切活性对盐浓度的要求，B 基因表达与基因转译D 重组子与转化子 限制性核酸内切酶可分成【B 】 C 4大类 D 5大类13、某一重组DNA （6.2 kb ）的载体部分有两个SmaI酶切位点。
real-time rt-pcr的原理
real-time rt-pcr的原理
实时反转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）的原理基于实时荧光定量PCR技术，结合了逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个技术。
首先，通过逆转录将RNA转录成cDNA。
这个过程由逆转录酶和引物完成，
引物与目标RNA序列的特异性序列互补。
当引物与目标RNA序列结合时，逆转录酶开始参与反应，通过循环变化的温度条件，使RNA序列转录成互补的DNA（cDNA）。
然后，这个cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系中含有荧光探针和
引物，引物与cDNA的特异性序列互补。
当引物与cDNA序列结合时，通过循环变化的温度条件，使DNA片段扩增。
在PCR扩增过程中，荧光信号发生器被激活，荧光信号开始释放。
荧光信号的释放与DNA片段的扩增相关联，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA片段的扩增情况。
通过比较荧光信号的强度与标准曲线，可以确定初始样品中目标RNA的量。
总之，实时反转录聚合酶链式反应是一种高灵敏度、高特异性的RNA检测技术，广泛应用于基因表达分析、病毒检测和基因突变研究等领域。
基因cdna全长序列验证实验报告
基因cdna全长序列验证实验报告英文回答：In this experiment, we aimed to validate the full-length sequence of a gene cDNA. Gene cDNA sequences are important for understanding gene function and expression. To validate the full-length sequence, we employed several experimental techniques.Firstly, we performed reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to amplify the cDNA sequence. RT-PCR allows us to convert the RNA template into complementary DNA (cDNA) and amplify specific regions of interest. We used gene-specific primers designed based on the known gene sequence to ensure amplification of the correct cDNA fragment.After amplification, we purified the PCR products and performed gel electrophoresis to visualize the cDNA fragments. Gel electrophoresis separates DNA fragmentsbased on their size, allowing us to verify the presence of the expected cDNA fragment. We compared the size of the amplified fragment with the expected size based on the known gene sequence.To further validate the full-length sequence, we performed Sanger sequencing. Sanger sequencing is a widely used method for determining the nucleotide sequence of DNA fragments. We sent the purified cDNA fragment to a sequencing facility, and they performed the sequencing reaction. The resulting sequence data was then analyzed to confirm the accuracy and completeness of the cDNA sequence.Additionally, we compared the obtained cDNA sequence with the reference genome sequence to ensure its alignment and identify any potential variations or mutations. This step is crucial to ensure the accuracy of the cDNA sequence and its relevance to the gene of interest.中文回答：在这个实验中，我们旨在验证基因cDNA的全长序列。
化学与分子生物学复习题库与答案
化学与分子生物学复习题库与答案1、下列关于酶的磷酸化叙述错误的是()。
A、磷酸化和去磷酸化都是酶促反应B、磷酸化和去磷酸化可伴有亚基的聚合和解聚C、磷酸化只能使酶变为有活性的形式D、磷酸化反应消耗ATP答案：C:在酶的共价修饰过程中,酶发生无活性(或低活性)与有活性(或高活性)两种形式的互变,磷酸化是共价修饰的一种,可以使酶无活性,也可以使酶有活性。
如磷酸化可使糖原磷酸化酶活性增高,但使糖原合酶活性降低。
2、嘌呤与嘧啶两类核苷酸合成中都需要的酶是()。
A、CTP合成酶B、TMP合成酶C、PRPP合成酶D、氨基甲酰磷酸合成酶答案：C:磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶)是两类核苷酸合成时都需要的。
3、氮杂丝氨酸干扰核苷酸合成是因为它的结构类似于()。
A、丝氨酸B、甘氨酸C、天冬氨酸D、天冬酰胺E、谷氨酰胺答案：E:氮杂丝氨酸属于氨基酸类似物,它的结构与谷氨酰胺相似。
谷氨酰胺是嘌呤核苷酸合成的原料之一,氮杂丝氨酸可干扰谷氨酰胺参与嘌呤核苷酸的合成反应。
4、生物体内氨基酸脱氨基作用的主要方式是()。
A、氧化脱氨基B、还原脱氨基C、直接脱氨基D、转氨基E、联合脱氨基答案：E:脱氨基作用是指氨基酸在酶的催化下脱去氨基生成α-酮酸的过程,是氨基酸在体内分解的主要方式。
参与人体蛋白质合成的氨基酸共有20种,它们的结构不同,脱氨基的方式也不同,主要有氧化脱氨、转氨、联合脱氨和非氧化脱氨等,其中联合脱氨基最为重要。
5、管家基因参与的基因表达方式为()。
A、非特异性表达B、阻遏性表达C、组成性表达D、诱导性表达E、不表达答案：C:管家基因指有些基因在生物个体的几乎所有细胞都持续表达,不易受环境条件的影响。
它们的表达称为组成性表达,又称基本表达。
6、DNA复制之初,参与从超螺旋结构解开双股链的酶或因子是()。
A、解链酶B、拓扑异构酶ⅠC、DNA结合蛋白D、引发前体E、拓扑异构酶Ⅱ答案：A:解链酶的功能是打开DNA的双股链;拓扑异构酶与打开DNA的超螺旋有关。
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PCR技术（十七）：用PCR扩增cDNA库中的特异序列
最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或DNA探针筛选出感兴趣的基因。
虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛选CDNA库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋白质序列结构的资料。
聚合酶链的反应（PCR）方法可使一种特异DNA扩增几百万倍，并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。
最近，TAQDNA聚合酶的使用极大地简化了PCR方法。
该酶在75℃左右有很宽的最适温度区，在小于95℃以下重复保温仍能存活，更重要的是，该酶活性高，无外切酶活性，因此理论上不用通过建立和筛选基因库的所用步骤就能从序列编码的基因作模板以探索一种简单．快速的基因分离方法。
下面我们将描述在鉴定南美蝙蝠唾液腺外分泌蛋白中使用的方法和过程。
Dr.S.Gardell(MSDRL，WestPoint，PA)纯化了从南美蝙蝠唾液腺中分离的一种外分泌蛋白，因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLe uMet)是开始本实验的关键。
为检验不用传统筛选方法即能克隆该蛋白基因的假说，我们采取了如下策略:
a).在Lambdagt22中建立一个在蝙蝠唾液腺中所有转录子的cDN A库，并在边侧加上SP6、T6聚合酶启动子，这样可以直接用两种启动子序列之一作引物进行扩增和测序。
b).合成四组引物，组合起来代表已知的部分蛋白序列的全部有效密码子组合(1024种衍生列)。
C).这些引物与适当的T7或SP6聚合酶序列引物组合成对，以总cDNA 库作模板，进行PCR扩增。
所得到PCR产物应该代表编码该蛋白的部分cDNA。
对这些PCR产物直接测序应能得到足的序列信息以合成同源引物，进一步进行PCR扩增，产生的DNA片段结合起来可给出编码该蛋白的cDNA的完整序列。
直接用2%琼脂糖凝胶分析PCR产物，组混合引物[引物1:5'(CT) TXGG(ACGT)TG(CT) GA (CT)(CT)TXATG3'，。
每组混合引物产生约450bp和550bp的两个产物。
用Wong等所述的方法进行凝胶纯化和测序该PCR的主要产物450bp带。
混合引物产生清蜥可读的序列(约200个核苷酸)，虽然可有256种引物组人合(简并度)。
在这个序列信息的基础上，合成另两组引物[引物Ⅱ(正向)]分别与SP6或T 7聚合酶序列引物配对，按前面所述进行PCR扩增，引物Ⅱ/SP6和引物Ⅲ/T7分别产生270bp和420bp片段，测定这两个片段序列，与最初得到的DNA片段结合来，得到一个467bp编码序列。
该cDNA(2 70BP+420 bp)的多余序列为200bp的PolyA尾序。
PCR策略
(A)n、(C)n、(G)n、(T)N:同聚物序列SP6，T7:SP6和T7聚合酶启动子，分别构建入Lambdagt载体。
B.琼脂糖凝胶分析PCR产物。
PCR在总体积100μl，含50mMKCL、10mMTris，pH8.3，1.5mMM
gCl2，0.01%明胶，200μM每种dNTP，2.5uTup聚合酶，150ng噬菌体库模板DNA，50ng(0.1nmoles)每种引物的体系中进行。
程序如下:初始模板变性94℃，8分钟;之后为94℃2分种，60℃3分种，30个循环。
PCR反应产物用氯仿抽提以除运送放物油，从100μl中取5μl样品加到2%琼脂糖凝胶上。
溴化乙啶染色。
GGATGACCACCCACAGCAGCTGCCTAACCATGAAGCTGGT GACCATCCTCATGCTGACC
GCCCTCCCCCTGTACTGETATGCGGGGCTTGGELGEGATCT TATGGACAATGTGGTCAAR
TTGACCATCGATTCTAATGTGGACGTGAATACATACATCG ATAACCTGAAAGAGTTCCTA
CCAGGTGAAGAAACTCAAGAGGCCTTCAAATTCATGAAG GAATGCTTTETCGATCAGAGC
GAAGAAACTCTGGAGAAGATCAAAGTTCTGCAGCAATCG ATATACAGTAGCGTTTGGTGT
GCTCGGGACACTAACTTCACATGACCACAGAGATTGTCCA CAGACCAACTGTCCATTGG
TAGAAGCCECAGCTGAGCTTTCCTTCTTCATCCTTCGATCT ACAAATGCAAGACAATTGT
AAACCTGACATACGTTTGEATTTCAATAAAGCATCCTGCA AAACCAAAAA
核苷酸序列及预测的氨基酸序列。
从制备性琼脂糖凝胶中分离P CR产物，并按厂商说明书(Bio101)用Geneclean纯化。
按厂商说明书(美国Biochemical序列酶)，用32P5'末端标记引物和修饰过的T7聚合酶(测序酶)测序。
每个反应含100ng(0.4pmoles )模板DNA和20 ng(4pmoles)5'32P末端标记的引物，每反应为2卓106cpm。
划线部分为起始本实验的多序列。
计算机分析表明该cDNA含有一个可读框，编码110个氨基酸，起始的18个氨基酸推测为信号肽，还发现用于起始这种蝙蝠唾液蛋白实验的七个氨基酸在蛋白的N-末端(图2，划线部分)。
检索NBRF数据库揭示该蛋白与鼠前列腺类固醇结合蛋白C3链前体有39%的同源性，最重要的同源性是成熟蛋白中所有三个半胱氨酸残基的位置。
我们已经证明聚合酶链反应可以用于从复杂分子库如cDNA库扩增特异的DNA序列。
在本实验中专门设计的Lambd gt22载体，通过用含有适当内切酶位点和聚合酶启动子序列的5'端、3'端引物接头定向克隆cDNA分子。
从克隆的PCR产物制备序列特异的探针，用传统方法筛选基因库，我们估计分离cDNA的丰度为每10，000
个噬菌体重组子中有1个克隆。
用一组代表简并度为256的寡聚核苷酸引物能进行特异扩增的事实进一步表明了该方法的灵敏度，而且如图1B所示，所有四个引物混合物产生相同PCR 产物，表明具
有更大简并度的寡聚核苷酸引物库也能进行特异扩增，PCR可以容忍1个碱基对的错配。
PCR方法、混合引物和PCR产物直接测序结合起来，可极大地减少建立cDNA库的时间，扩大该方法的用途。