凯氏定氮法 (1)
最新的AOAC凯氏氮测定公认标准方法(2001) (1)
最新的AOAC 凯氏氮测定公认标准方法（2001）的要点和说明――AOAC 公认标准方法988.05、984.13、976.06和990.02由于凯氏定氮法经过100多年的发展，各种相关标准很多，且有些方法对其公认的参比性提出挑战，认为凯氏定氮法存在缺陷，不能测定所有的氮（如氧化态氮和杂环氮化合物）且精度不是最好等，作为参比标准方法有点混乱。
在2001年，AOAC 经过了验证，最后确定了以模块式加热消化、蒸汽蒸馏、硼酸吸收、盐酸滴定、指示剂指示颜色终点法的凯氏定氮方法学作为定氮技术参比试验条件，在欧美的14个权威实验室（FOSS 的凯氏定氮仪技术规范完全符合选定标准，因此成为唯一指定的可选试验仪器，FOSS 公司的实验室也是其中的一个）开展了凯氏定氮法的升级完善认证试验，形成新版（2001年）的AOAC 最新定氮标准，使当今的实验室有了一个包含全自动凯氏分析的现代分析技术的规范新标准，以获得符合GLP （好的实验室规范）执行标准和合格鉴定方法要求的数据质量。
**所有AOAC 公布的标准都经过协作验证试验，并且所有对应的验证试验报告都同时另刊发表，公开供需要者查询。
AOAC 公布的方法也因其严谨的科学性和公开且明确的科学态度而得到全世界的公认，获得最权威的参比方法的美誉。
新的凯氏定氮法标准要点：1.使用模块式整体加热方式消化样品。
推荐使用带强制排废功能的设备； 2.使用硫酸铜/硫酸钾混合催化剂和浓硫酸消化样品； 3.使用水蒸汽蒸馏碱化的消化液。
推荐使用FOSS 的SAfE 蒸馏功能； 4.使用硼酸吸收蒸馏出来的氨； 5.使用稀的强酸滴定。
推荐使用盐酸； 6.使用嗅甲酚绿/甲基红混合酸碱指示剂确定滴定终点； 7. 除已知确切的样品类型如小麦（5.70）外，所有（粗）蛋白质含量计算都使用6.25的转换系数；8. 指定FOSS 的KJELTEC®凯氏定氮仪系列及其样品磨可以作为测定仪器。
新的凯氏定氮法方法学简要说明：模块式整体加热方式的优点：加热模块储热，使消化时温度保持稳定，波动小；整体式的加热模块，使样品消化条件一致化，有利于减少误差；配合FOSS 的消化技术，可以最大限度的提高消化效率和减少化学试剂消耗； 推荐使用强制排废，更有利于稳定的消化和安全操作。
凯氏定氮法
凯氏定氮法中文名称：凯氏定氮法英文名称：Kjeldahl determination定义：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
凯氏氮的测定方法
凯氏氮的测定方法（1）、原理当样品与浓硫酸和硫酸钾的混合物（沸点315~370℃）在催化剂硫酸铜或硫酸汞存在时，一起加热，其中的有机氮和氨态氮转化为硫酸铵。
然后加入NaOH溶液使之成碱性，蒸镏使氨释放出来并以硼酸吸收，然后用硫酸滴定硼酸铵。
此法测得的总氮包括了有机氮和原来即以氨态存在的氮，但不包括硝酸盐或亚硝酸盐形式存在的氮，有机氮中的某些化合物如含氮的杂环化合物、吡啶、叠氮化合物、偶氮化合物、硝基和亚硝基化合物等也未包括在内。
以此法测定的总氮称之为凯氏（Kjeldagl）氮，即TKN。
测定同一水样中氨态氮含量后，总凯氏氮和氨态氮的差值即为有机氮。
（2）、药品与仪器①、浓硫酸，密度1.84g/cm3；②、50% NａOH溶液；③、10% CｕSO4溶液；④、4%硼酸溶液；⑤、无水硫酸钾或无水硫酸钠；⑥、0.020mol/L(1/2H2SO4标准溶液：吸取分析纯浓硫酸2.80ml，溶于1000ml蒸镏水中，得到约0.10mol/L(1/2H2SO4)溶液，用碳酸钠标定。
然后从中吸取200ml，用蒸镏水稀释至1000ml 备用。
⑦、混合指示剂：取0.05g甲基红和0.10g溴甲酚绿溶于100ml乙醇中；⑧、1%酚酞的乙醇溶液；⑨、4%Na2S。
9H2O溶液；⑩、蒸镏水：将普通蒸镏水酸化后加入KMnO4进行蒸镏，并重复蒸镏一次，以使其中不含有任何铵盐或氨。
本试验所用蒸镏水均应经过这样的处理；⑩、浮石：在蒸镏水中煮沸后干燥备用；⑩、600瓦可调温电炉两台；⑩、凯氏烧瓶及凯氏蒸镏装置（3）、操作步骤①消化：准确量取一定体积（以含氮0.5~10mg为宜）的废水水样置于凯氏烧瓶，加入10ml浓硫酸、5克硫酸钾或硫酸钠、1ml硫酸铜溶液，并放入几块沸石，将凯氏烧瓶以45度的角度固定于通风橱内加热煮沸，烧瓶内将产生白烟。
继续煮沸，烧瓶中颜色逐渐变黑，直至溶液完全透明无色或浅绿色。
再继续煮沸20分钟。
②蒸镏：将凯氏烧瓶冷却，以约150ml蒸镏水冲洗烧瓶壁，加入2.5ml硫化钠溶液和3~5滴酚酞，然后缓慢沿壁加入50mlNaOH溶液尽量使其不与烧瓶内液体混合。
凯氏定氮法蒸馏吸收
凯氏定氮法蒸馏吸收凯氏定氮法是一种常用的分析化学方法，用于测定样品中的氮含量。
其主要步骤包括：样品消解、蒸馏吸收、滴定计算等。
在这些步骤中，蒸馏吸收是非常关键的一步。
1、蒸馏吸收的原理蒸馏吸收是通过蒸馏和吸收两个步骤来分离和测定样品中的氮。
其原理是基于氨的揮发性和同时整理的特点。
具体来说，样品中的氮经过适当的处理后，以形式亚氨基和氨的形式存在，并和碱液反应生成氨气。
随着加热，氨气揮发到空气中，被蒸馏出来。
然后，在蒸馏过程中，将氨气通过一系列吸收筒，使氨气与硼酸溶液发生中和反应，生成硼酸氨盐。
因此，通过比较前后吸收液的硼酸滴定值，即可计算出样品中的氮含量。
（1）将经过消解的样品加入凯氏试剂。
凯氏试剂是一种由硫酸、汞齐和氢氧化钾组成的混合试剂，用于氮的定量分析。
在加入凯氏试剂之前，需要将样品中的氮转化为硫酸亚氨盐形式。
（2）在装有样品和凯氏试剂的烧瓶中，加入足量的蒸馏水。
（3）将烧瓶加热，并将烧杯放置在试管架上。
加热温度一般需要控制在110℃-120℃之间。
（4）在烧瓶中收集蒸馏的氨气。
通常需要用冷水冷却收集瓶，以避免氨气再次揮发。
（5）将氨气吸收在硼酸溶液中。
在硼酸溶液中，氨气与硼酸反应生成硼酸氨盐。
一般会使用三个吸收瓶，分别对应三个收集瓶的分段蒸馏结果。
（6）对每个收集瓶的硼酸溶液进行滴定，得到各自的硼酸滴定值。
（7）用硼酸滴定值计算出有机物中的氮含量。
在进行计算时，需要减去空白试剂对硼酸的滴定值，并将结果转化为氮含量的质量浓度。
3、蒸馏吸收的注意事项（1）操作过程中，需要严格控制加热温度。
如果温度过高，可能会导致硼酸氨盐在吸收瓶中发生水解反应，使计量不准确。
（2）在蒸馏过程中，收集瓶必须密封良好。
否则，会出现气体逸出的情况，导致氮含量测定不准确。
（3）硼酸溶液不能超过吸收瓶的一半高度。
同时，在滴定前需要用盐酸或氢氧化钠对溶液进行调节，使其 pH值控制在8-9之间。
（4）在蒸馏吸收前，需要校准试剂或使用标准样品进行检验，以保证测定结果的准确性。
凯氏定氮法计算公式
凯氏定氮法计算公式
1 凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种重要的用于测定全氮量的分析方法，也被称为
硝酸盐氰化反应。
它是早期硝酸盐氰化反应的重要组成部分，全氮量
的测定。
它有广泛的应用，例如环境水样、饮用水、有机废物、粪便、土壤和肥料等。
2 计算公式
凯氏定氮法的公式是：
N％=FIN/[(VW×BE％)×100]×100
其中，N％是指样品中N2的百分含量；FIN是指紫外吸收法测得的紫外光吸收值；VW是指样品容积；BE％是指碘当量测量中所用的碘折
光率。
3 实验步骤
凯氏定氮法实验的主要步骤是：
①皿试：将10ml的碘氰乙酸溶液加入碟形分析皿中，吸气8min，再加入3ml硝酸钠溶液，搅匀；
②读取紫外光吸收值：用1079nm波长的紫外光源照射，用紫外分
析仪读取相应的紫外光吸收值；
③计算前：用计算公式计算所得紫外光吸收值，并根据计算结果给出定氮的百分比。
4 注意事项
使用凯氏定氮法测定全氮量时应注意以下几点：
- 所选择的样品标本应在分析之前进行提纯和准备，以确保准确的测定结果；
- 样品中的悬浮物和溶解物必须进行滤过处理，以清除它们；
- 紫外分析仪中所采用的紫外光源波长要选择适当的大小，以保证测量精度；
- 紫外光吸收值的计算需要参考碘当量值，以便准确计算样品中所含全氮含量；
- 试剂、设备等实验工具也要正确使用，才能取得准确的容积值和紫外光吸收值，从而算得准确的定氮值。
总之，凯氏定氮法虽然简单易行，但在测定全氮量时也应特别注意以上这些问题，以保证实验结果的准确性和有效性。
凯氏定氮法
2.4 注意事项
（1） 所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加
指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性。 （2） 若样品含脂肪或糖较多时，应注意 发生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外， 并注意适当控制热源强度。 （3） 若样品消化液不易澄清透明，可加 入300g/L2~3ml 过氧化氢后再加热。
消化反应方程式如下： 2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4 ＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2 COOH＋ ＋16H2O 浓硫酸具有脱水性: 浓硫酸具有脱水性:使有机物脱水后被炭化为碳、氢、 氮。 硫酸又具有氧化性: 硫酸又具有氧化性:将有机物炭化后的碳化为二氧化 碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4
③ 滴定 滴定：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标 准溶液滴定至微红色为终点。
(V1 − V0 ) × c × 0.014 × F (5) 结果计算： W = ×100% V2 m× 100
式中W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g。
② 蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O OH＋
测氮原理
（一）全氮的测定（凯氏定氮法）实验原理：样品用浓硫酸消化，硫酸在高温下分解为SO2、H2O和[O],所形成的[O]具有高度的氧化能力，在高温时能够氧化有机质形成CO2。
糖类等不含氮的有机质被硫酸分解成CO2 和H2O。
蛋白质在硫酸的作用下分解成氨基酸，氨基酸与硫酸作用形成NH3，CO2，SO2和H2O。
氨在酸性下与硫酸结合，形成硫酸铵。
为了加速消化过程的进行，可在硫酸内加入硫酸钾和硫酸铜的混合粉。
消化后的硫酸铵在加入过量的浓NaOH（40%）时，作用生成NH3，将NH3蒸馏出来，收集在一定得硼酸中，然后用标准酸（HCI）滴定，由用去的标准酸可以计算出氮的含量。
仪器设备：研钵，凯氏定氮仪，凯氏烧瓶（50ml），样品粉碎机，消煮炉，分析天平，通风橱，容量瓶（50ml），移液管（25ml，10ml，5ml，1ml），半微量滴定管，粗天平，小漏斗等。
试剂配制方法:1、浓硫酸（比重1.84） 2、硫酸钾与硫酸铜合粉的比例10：1 3、0.01的盐酸溶液：先配制约0.1N的盐酸溶液，标定其准确当量浓度，然后吸取10ml于100ml的容量瓶中，加水定容至100ml。
4、1%的硼酸溶液：1g硼酸溶于100ml不含CO2的蒸馏水当中（煮沸通常用的蒸馏水一直到原体积的1/4-1/5,就可得不含CO2的蒸馏水）。
5、40%的NaOH溶液。
6、混合指示剂：a.甲基红酒精溶液（称取0.1g甲基红于研钵中，先加1ml 95%酒精研磨后，再加74ml 95%j酒精中）。
零用时，将a、b两液按2：1比例混合即成，此指示剂在PH5.5时溶液无色，小于或大于5.5时，溶液则呈紫红色或绿色。
实验结果计算 N%=（V1-V2）*N*14*50*100%/W(1-M%)*V公式中：V1————指定样品所用的HCI的毫升数V2——为滴定空白所用的HCI毫升数N-----HCI的当量浓度14----每毫克当量N的重量（mg）W-----试样风干重（mg）50----定容的容量瓶毫升数M%----水分百分率（测定称样的同时称一份测水分） V-----从消化液中取出供蒸馏的溶液毫升数。
凯氏定氮法
凯氏定氮法测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量索氏提取法原理：样品经干燥后，借助索氏提取器用溶剂反复萃取，使样品中的脂肪进入溶剂中。
回收溶剂后所得残留物——粗脂肪、醚浸出物、游离态脂肪仪器：索氏提取器(冷凝管、提取筒、烧瓶)滤纸筒、恒温水浴等。
试剂：脂肪提取剂(无水乙醚、石油醚)、无水硫酸钠、海砂等。
方法适用范围：含脂较高，与组织成分结合的脂类较少的食品。
计算：式中：m2——脂肪烧瓶和脂肪的质量，g m1——脂肪烧瓶的质量，g m ——样品的质量，g(样品应是烘干样，以干基计)利用溶剂回流和虹吸原理，使固体物质每一次都能为纯的溶剂所萃取，所以萃取效率较高。
萃取前应先将固体物质研磨细，以增加液体浸溶的面积。
然后将固体物质放在滤纸套内，放置于萃取室中。
如图安装仪器。
当溶剂加热沸腾后，蒸汽通过导气管上升，被冷凝为液体滴入提取器中。
当液面超过虹吸管最高处时，即发生虹吸现象，溶液回流入烧瓶，因此可萃取出溶于溶剂的部分物质。
就这样利用溶剂回流和虹吸作用，使固体中的可溶物富集到烧瓶内。
凯氏定氮法
凯氏定氮实验一．实验背景柯达尔定氮法又称为凯氏定氮法。
凯氏定氮法是一种测总的有机氮的方法，可用于所有的动植物食品的分析，在国内外的应用都较为普遍，迄今被作为法定的标准检验方法。
测定的原理是：样品中的含氮有机化合物，经浓硫酸加热硝化，有机质被破坏，之中的C和H变成CO2和H2O逸出，而NH3则与H2SO4结合生成(NH4)2SO4或者NH4HSO4留在溶液中。
将溶液中的NH3碱化，游离，然后蒸出。
放出的NH3用硼酸吸收，以混合指示剂指示终点。
用H2SO4或HCL标准溶液滴定上述溶液，呈淡紫红色为终点，这样可计算出总氮量，进而计算出蛋白质的含量。
二．实验仪器和药品Hcl标准溶液、H3BO3饱和溶液、浓 H2SO4、40%NaOH溶液、 K2SO4（固体）CuSO4（固体）、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，未知样、煮解瓶。
烧瓶、升降台、锥形瓶、定氮装置三．实验步骤（1）煮解。
在煮解瓶总加入K2SO4-CuSO4(1:3)约15㎎，浓硫酸2ml：在加入未知样，在煮解瓶上加分液漏斗后在通风橱中加热煮解样品，等反应物变成淡蓝绿或几乎无色时，继续煮解30min，冷却后加入3ml蒸馏水，继续冷却。
（2）蒸馏。
在烧瓶中加入2/3的蒸馏水，沸石，2滴浓硫酸后加热。
等水沸腾后让水蒸气流遍整套装置5-10min。
用蒸馏水润洗仪器两遍。
（3）在锥形瓶中加入10ml饱和硼酸溶液，4滴混合指示剂。
在冷凝管中通冷水，末端浸入液面以下，自蒸馏瓶上端漏斗中加入煮解液，用蒸馏水淋洗煮解瓶两遍，并将煮解液全部移入蒸馏瓶中。
（4）自漏斗中加入10ml40%NaOH溶液，关闭漏斗，并用蒸馏水液封。
（5）收集约30ml蒸馏液时，测一样冷凝管末端的pH,如果是中性，则降低锥形瓶，转入下一步滴定。
（6）用0.0025mol/l 标准盐酸，用10ml微量滴定管滴定收集的蒸馏液。
终点时溶液由蓝色变为灰色。
（7）用完全相同的手续与试剂用量进行两次空白试验。
凯氏定氮法测定蛋白质原理及操作
一、概述蛋白质是生命活动中不可或缺的重要物质，其含量的测定在生物化学研究和食品加工领域具有重要意义。
针对蛋白质含量的测定方法有许多种，其中凯氏定氮法是一种经典且常用的测定方法，本文将就凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作进行详细介绍。
二、凯氏定氮法原理1. 基本原理凯氏定氮法是通过测定样品中氨基氮的含量来间接测定蛋白质含量的方法。
蛋白质是由氨基酸构成的，而氨基酸中含有氮元素，故可以通过测定样品中氮元素的含量来推算出样品中蛋白质的含量。
2. 操作步骤（1）样品的预处理：将待测样品进行适当的预处理，通常是将样品中的有机物燃烧成气体，从而将其中的氮元素转化为氮气。
（2）氮气的收集：收集样品燃烧产生的氮气，通常是通过化学吸收剂的吸收来将氮气纯化。
（3）氮气的测定：将纯化后的氮气进行定量测定，得出氮气的含量。
（4）蛋白质含量的计算：根据氮气的含量，通过一定的计算公式来推算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法操作注意事项1. 样品的选择选择代表性好的样品进行测定，避免样品中含有其他干扰物质，影响测定结果的准确性。
2. 仪器的使用严格按照仪器的操作说明进行操作，保证测定过程的准确性和精确度。
3. 数据的处理对测定得到的数据进行严格的处理，计算过程中不应出现错误，以确保蛋白质含量的测定结果准确可靠。
四、凯氏定氮法测定蛋白质的优缺点1. 优点（1）测定范围广：凯氏定氮法可以适用于各种类型的样品，包括食品、饲料、生物组织等。
（2）测定结果可靠：经过严格的样品预处理和操作步骤，测定结果具有较高的准确性和精确度。
2. 缺点（1）操作繁琐：凯氏定氮法的操作步骤相对繁琐，需要较长的操作时间。
（2）不适用于含氮杂质的样品：如果样品中含有其他氮元素化合物的干扰物质，则可能影响凯氏定氮法的测定结果。
五、结语凯氏定氮法作为一种经典且常用的蛋白质测定方法，其原理和操作步骤相对简单明了，但需要严格遵守操作规范，以确保测定结果的准确性和可靠性。
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4．标准滴定溶液 a) 硫酸滴定溶液（0.05mol/L）：量取 硫酸3mL，缓缓注入适量水中，冷却至室 温，加水稀释至1000 mL容量瓶，摇匀， 用无水碳酸钠标定。 b)硫酸滴定溶液（0.005mol/L）：精密 量取硫酸滴定液（0.05mol/L）100mL ，置1000mL量瓶中，加水稀释至刻度， 摇匀。
凯氏定氮法
王立娜
凯氏定氮法
｛
钨酸沉淀法
三氟乙酸沉淀法
钨酸沉淀法
通过测定供试品的总氮含量以及 经钨酸沉淀去除蛋白质的供试品 滤液中的非蛋白质氮含量，计算 出蛋白质的含量。
供试品溶液的制备
（1）总氮测定溶液的制备 精密量取供试品1mL，用生理氯化 钠溶液准确稀释至每1mL含氮量约 1mg （2）非蛋白氮测定溶液的制备 精密称取供试品2mL，加水14mL 、10%钨酸钠溶液2mL、硫酸溶液 2mL，摇匀，静置30min过滤，取 滤液测定。
（三）溶液配制
1． 消化剂：称取硫酸铜（CuSO4.5H2O） 10g、硫酸钾100g、置乳钵内，共同研细， 混匀。 2．混合指示液：0.2%溴甲酚绿乙醇溶液5份 与0.1%甲基红乙醇溶液2份混合配成。 3、2%硼酸吸收液：称取硼酸20g，加水溶 解并稀释至1000mL，加混合指示液10mL， 混匀。
硫酸铜： 1.催化剂 加速反应 2.碱性反应指示剂 有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色 ，可以作为指示剂。
2. 蒸馏 40%氢氧化钠 碱性条件下，使硫酸铵释放出氨气。 一是加入氢氧化钠溶液要过量； 二是要防止样液中氨气逸出。
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 +2H2O
（四）具体操作过程
精密量取一定体积的供试品（约相当于含氮量 1.0~2.0g），置凯氏定氮瓶中，加消化剂0.3g，硫酸1mL 消化至澄明，呈蓝绿色，继续消化约60min。 量取2%硼酸吸收液10mL置100mL锥形瓶内，将凯氏 蒸馏器冷凝管末端浸人碾酸吸收液内，将消化好的供试 品移人凯氏蒸馏器内，用水洗定氮瓶3-4次，将洗液移 人蒸馏器内.再加入50%氢氧化钠溶液5mL，然后进行蒸 熘，待接收液总体积约35-50mL，将冷凝管末端移出液 面，使蒸汽继续冲洗约1分钟，用水淋洗尖端后停止蒸 馏，接收液用硫酸滴定液（0.005mol/L）进行滴定，至 溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验 校正。
6. 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中 性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色 。如果没有溴甲酚绿，可单独使用 0.1%甲基红 上的氨在最初1~2分钟内蒸出，初蒸速 度不宜太快，以免氨蒸出后未能及时被 吸收而逸出。
8.在蒸馏时还应注意硼酸的吸收温度。硼 酸是极弱的酸，只起吸收氨的作用，但 要注意硼酸吸收液温度不应超过40℃， 否则氨的吸收减弱导致结果偏低。
（五）计算公式
1、钨酸沉淀法：
2、三氟乙酸沉淀法
注意事项
1. 取样量 ：取样量的多少主要取决于试样的 类型及待测元素含量的高低。为了减小称量 时的误差，试样或基准物质的质量必须在 0.2g以上。 2. 蒸馏加浓碱NaOH，加的量为H2SO4量的4倍 半微量分析：例如10ml样品，10ml NaOH， 10ml2%硼酸 3. 硼酸保持过量。
4. 不要将样品粘在瓶颈上，炭化粘在壁上消 化不彻底．消化过程中要逐渐升温，当低温 加温至出现带有硫酸的白色气体后，才可升 温使溶液沸腾，但避免剧烈沸腾。 5.当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使 溶液呈淡黑色；当氢氧化钠量不足时就无黑 色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色，加入的氢 氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防 止氨的流失。
测定法
精确量取适宜体积的供试品（每 1mL含蛋白质4-10mg）于适宜的 尖底离心管中，加等体积的12%三 氟乙酸混匀，静置30min后，以每 分钟4000转离心，弃上清液，用约 3mL水分数次将沉淀洗入凯氏定氮 瓶中，照氮测定法测定供试品中总 氮含量，同时做空白对照。
凯氏定氮法
一、原 理
含氮有机物经硫酸消化后，生成硫酸 铵，硫酸铵被氢氧化钠分解释放出氨 ，后者借水蒸气被蒸馏入硼酸溶液中 生成硼酸铵，最后用强酸滴定，依据 强酸消耗量可计算出供试品的氮含量 。
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH4OH NH3+H3BO3=NH4H2BO3
3. 再用0.005mol/L的H2SO4标准溶液滴定，根据H2SO4消 耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得 蛋白质的含量。
二、实验过程
氮测定法包括三个过程： 消化 蒸馏 滴定
（一）反应过程
1.有机物中的氮在强热和CuSO4， K2SO4 , 浓H2SO4 作用下，
消化生成（NH4）2SO4
NH2 CHCOOH+2 H2SO4= SO2 + H2O + 2CO2 + NH3
2NH3+H2SO4= (NH4)2SO4
3. 吸收与滴定 硼酸H3BO3： 半微量定氮通常用硼酸溶液吸收氨的作用 。硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示 剂变色反应。
NH3+H3BO3=NH4H2BO3
标准溶液： 硫酸： H2SO4 硼酸溶液吸收后，再用标准硫酸直接滴定， 根据消耗体积得出氮的含量。
2NH4H2BO3 + H2SO4 =H3BO3 + (NH4)2SO4
2NH4H2BO3 + H2SO4 =2H3BO3 + (NH4)2SO4
（二）各种试剂的作用 1. 消化：
硫酸： 1. 脱水。使有机物炭化，生成C， 2. 氧化。 H2SO4将C、 H氧化为CO2和H2O蒸汽逸 出，本身还原为SO2，而氨基则分解成氨气，则 与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中
NH2 CHCOOH+2 H2SO4= SO2 + H2O + 2CO2 + NH3 2NH3+H2SO4= (NH4)2SO4
测定法
（1）精密量取总氮测定溶液1mL， 置凯氏定氮瓶中，照氮测定法测定 供试品中总氮含量，同时做空白对 照。 （2）精密称取非蛋白氮测定溶液 5mL，置凯氏定氮瓶中，照氮测定 法测定供试品中非蛋白氮含量。
三氟乙酸沉淀法
本方法是将供试品经三氟乙酸沉 淀，通过测定该沉淀中的蛋白氮 含量，计算出蛋白质的含量。