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pcr的基本原理及操作流程
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PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理PCR简介聚合酶链式反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外扩增目标DNA 序列。
它通过不断的循环反应，迅速大量复制目标DNA，从而能够快速获取足够的起始模板用于后续的实验。
PCR具有高效、敏感、特异性强等优点，在基因工程、医学诊断和犯罪鉴定等领域得到广泛应用。
PCR步骤和方法PCR主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
这三个步骤通过循环反应，反复进行以达到目标DNA扩增的目的。
1.变性（Denaturation）：在高温条件下（通常为94-98°C），双链DNA被迅速分离成两条单链DNA。
这被认为是PCR反应的起始步骤，使得目标DNA的两个互补链分开，为后续的PCR步骤提供单链DNA模板。
2.退火（Annealing）：降温至50-65°C的退火温度，引入特异性引物（primers），使其与目标DNA序列上的两个互补区域发生配对。
引物是短寡核苷酸序列，用于定位目标序列的起始和终止位置。
3.延伸（Extension）：在60-75°C条件下，DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等）以引物为起点，沿模板链的互补链合成新的DNA链。
延伸速率通常为60-100 bp/分钟。
以上三个步骤完成后，产生的DNA分子会成为下一轮PCR反应的起始模板。
每个PCR循环通常需要几十秒到几分钟的时间。
PCR的方法可以进一步分为常规PCR、荧光定量PCR（qPCR）和逆转录PCR（RT-PCR）等。
PCR实验过程以下是PCR在实验室内的基本步骤：1.提取DNA：从待检测的样品（如血液、组织等）中提取目标DNA。
这一步需要遵循相应的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2.准备反应体系：将PCR反应所需的各种试剂按比例加入反应管中。
通常，反应体系包括目标DNA、引物、核苷酸、DNA聚合酶、缓冲液和Mg2+等。
3.PCR反应：将反应管置于PCR仪中，按照设定的PCR程序进行反应。
PCR详细讲解
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
引物设计的基本原则
2、避开易形成二级结构的模板序列区域。
基本原理
PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促动力学原 理，开始的循环内扩增产物呈指数积累，产物与
模板呈线性关系。半定量 RT-PCR 技术正是利用产
物与模板量的这一线性关系，通过扩增产物来对
比总RNA中目的基因的表达。
基本流程
注意的问题
RNA的提取
• 做RT前必需测RNA浓度，常用500ng或1ug。
逆转录引物：
（1）随机六聚核苷酸引物
仅长6个核苷酸，每个核苷酸位点上随 机加入4中不同的脱氧核苷酸，因此是46中 不同引物的集合体。 所有RNA分子均可以充当模板，合成的 cDNA中有96%来自rRNA。
逆转录引物：
（2）Oligo（dT） 仅由dTTP构成，长度一般为1824个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾， 因此仅mRNA可被逆转录。
• PCR（Polymerase Chain Reaction)技术即
聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。 • 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发 明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外 DNA 分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
简述pcr原理及操作流程
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聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术。
PCR的原理和操作过程
原则旳PCR反应体系
10X 扩增缓冲液： 5μl
模板DNA:
0.1~2μg
引物：
各0.2~1μmol/L
4种dNTP: 各200μmol/L
Mg2+:
1.5mmol/L
Taq DNA聚合酶： 2.5U
ddH2O 总体积：
补齐 50μl
能够按照百分比放大或者缩小体系，不同旳PCR反应需要优 化
2. 能从100万个细胞中检出一种靶细胞
3. 病毒检测旳敏捷度可达3个RFU 4. 细菌检测旳最小检出率为3个细菌
1. 简便、迅速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完毕扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
2. 对标本旳纯度要求低
1. 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织旳粗提DNA
第二节 PCR旳试验环节
按照试验方案进行即可
1.加样 将上述总体积为50чl旳反应体系加入一无菌
0.5ml离心管中
2离心 将加入旳反应物混合均匀后稍离心，加入一
滴矿物油覆盖于反应混合物上
3扩增 在PCR仪上设置PCR反应参数（详细数据根
据引物和扩增片段旳大小而定）：94℃下加热4分钟左右 ；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟 ，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充 分
PCR原理和基本操作过程
临床146生化试验小组
第一节 PCR技术原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reation,PCR)是一种DNA体外核 酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量旳目旳基因或某DNA片段扩增 至十万乃至百万倍，从极微量旳标本中扩增出足量旳DNA供分析研究和检 测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、迅速、简便、反复性好、易 自动化等突出优点。
PCR技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
聚合酶链式反应（PCR）原理DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的‚半保留复制链‛，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）（9）荧光定量实时PCR技术PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
pcr扩增的原理和步骤以及常见问题
P C R实验原理及步骤PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。
实验方法原理①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR反应体系10×扩增缓冲液10 ul4种dNTP混合物各200 umol/L引物各10～100 pmol模板DNA 0.1～2 ugTaq DNA聚合酶 2.5 uMg2+ 1.5 mmol/L加双或三蒸水至 100 ul模板制备（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。
也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。
法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。
多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。
难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。
所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
PCR反应条件控制1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。
2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
pcr的原理和主要应用
PCR的原理和主要应用1. PCR的原理PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它可以在体外迅速扩增目标DNA序列。
PCR的原理基于DNA聚合酶在体外复制DNA的能力，通过循环反应，可以从一小段DNA模板扩增出大量目标DNA片段。
PCR的原理主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。
1.1 变性PCR反应开始时，将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开，得到两条单链DNA。
1.2 引物结合将PCR反应体系降温至目标DNA片段的引物结合温度，引物能够特异性地与目标DNA的两端结合。
引物是由两个无定序核苷酸组成，一个与目标DNA的一条链上的末端互补，另一个与另一条链上的末端互补。
1.3 延伸加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），温度升高至DNA聚合酶的最适温度，DNA聚合酶沿着DNA模板逐渐合成新的DNA链。
此步骤的温度通常在72℃左右。
经过多次循环，可以扩增出大量目标DNA片段。
2. PCR的主要应用PCR技术在生物学研究和临床诊断中有广泛的应用。
以下是PCR的主要应用。
2.1 基因克隆PCR可以扩增出目标基因的DNA片段，并通过连接酶和质粒进行连接，从而实现基因的克隆。
基因克隆是研究基因功能和制备重组蛋白等重要实验手段。
2.2 基因检测PCR技术可以用来检测特定基因的存在与否。
通过设计特异性引物，可以选择性地扩增目标基因的DNA片段。
这种检测方法广泛应用于遗传病的检测、疾病相关基因的筛查等。
2.3 遗传多态性分析PCR技术可以用来分析基因座的遗传多态性。
通过选择特异性引物，可以扩增出基因座上的多种等位基因，通过分析扩增产物的长度或序列，可以确定个体在某个基因座上的基因型。
2.4 表达定量PCR技术可以用来分析基因在不同组织或条件下的表达量。
通过选择特异性引物，可以扩增出目标基因的DNA片段，通过比较扩增产物的数量，可以推断出基因在不同条件下的表达量。
2.5 病原体检测PCR技术在疾病的快速诊断中发挥了重要作用。
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RTPCRTPCR - RT-PCR简介反转录·聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-P CR）是将RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA 产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。
只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Olig o（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。
在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。
cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。
在一步法RT-PCR中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和PCR在一直观众顺次进行。
1、反转录酶的选择两种方法1、Money 鼠白血病病毒反转录酶有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37°。
2、AMV反转录酶有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适温度为42°。
2、合成cDNA引物的选择用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
一步法RT-PCR引物的选择：1. 随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。
适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA 的反转录反应。
主要用于单一模板的RT-PCR反应。
两步法2. Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。
（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。
）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
3. 基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。
RTPCR - 影响因素RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。
1、建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。
2、对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。
较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。
3、大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。
但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。
反向PCR反向PCR反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。
PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。
反转录PCR反转录PCR又称为逆转录PCR，，是指扩增mRNA的一种实验技术。
先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。
RT-PCR反应原理反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。
其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。
反转录PCR - 一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在M n2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Po ly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
1. 总RNA的提取。
2. cDNA第一链的合成（Reverse Transcription）：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达1 1μl。
在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer 2μl25mM MgCl2 2μl10mM dNTPmix 1μl0.1M DTT 2μl轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
3．PCR：（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl上游引物（10pM） 2μl下游引物（10pM） 2μldNTP(2mM) 4μl10×PCR buffer 5μlTaq 酶（2u/μl） 1μl（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。
轻轻混匀，离心。
（3）设定PCR程序。
在适当的温度参数下扩增28-32个循环。
为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。
常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。
其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PC R反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。
故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5．防止DNA的污染：（1）采用DNA酶处理RNA样品。
（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。
第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。
第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。
因此，巢式PCR的扩增非常特异。
巢式PCR - 定义巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。
第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。
第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。
因此，巢式PCR的扩增非常特异。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DN A聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。