实验四RT-PCR
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
实验四 PCR扩增目的基因
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)
• PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶 反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 • 体外程序化的DNA合成技术。 devised by Kary Mullis in 1983
Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
3. Mg2+：
Mg2+ 浓度对 Taq DNA 聚合酶影响很大，它可影响酶 的活性和真实性，影响引物退火和解链温度 , 影响产物 的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范 围为0.5-2mmol/L。在PCR反应混合物中，应尽量减少 有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等 可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ in the range of 100-300 bp long.
PCR扩增
PCR特点及应用
特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可 靠，快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。
PCR应用
• • • • • • • 基因组DNA分析 genomic assay 克隆基因或基因片断 Cloning of genes or gene fragments 遗传病的诊断 Genetic diagnosis 亲子鉴定 Paternity testing 反转录PCR Reverse transcription (RT)-PCR 犯罪现场的法医分析 Forensic analysis at scene of crime 传染病的分析 Assays for the presence of infectious agents • 遗传病的产前诊断 Prenatal diagnosis of genetic diseases • 体外突变与DNA工程 In vitro mutagenesis and engineering of DNA • 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence variations
RT-PCR的步骤
RT-PCR的步骤引言逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，用于从RNA样本中扩增特定的DNA片段。
该技术可以检测和定量特定基因的表达水平，并在疾病诊断、药物研究等领域发挥重要作用。
本文将介绍RT-PCR的步骤及其基本原理。
步骤1. 提取RNA在进行RT-PCR之前，首先需要从细胞或组织中提取RNA。
常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、硅胶酸盐柱法等。
通过这些方法，可以将总RNA或特定种类的RNA从样本中纯化出来，为后续的实验步骤提供RNA样本。
2. 逆转录（RT）逆转录是将RNA转录为相应的cDNA（互补DNA）的过程。
逆转录反应中使用逆转录酶，该酶具有转录RNA为cDNA的能力。
在逆转录反应中，逆转录酶合成一个与RNA模板互补的cDNA链。
常见的逆转录酶包括M-MLV逆转录酶和SuperScript逆转录酶等。
3. PCR扩增PCR扩增是通过引物（寡核苷酸序列）将需要扩增的目标DNA片段进行反复循环扩增的过程。
在PCR反应中，每轮反应包括三个步骤：解链、引物结合和延伸。
通过不断循环这三个步骤，DNA片段将被指数级扩增。
4. 凝胶电泳PCR扩增后，我们需要将扩增产物进行凝胶电泳，以确认是否扩增成功，并确定目标DNA片段的大小。
在凝胶电泳中，将PCR产物加载到琼脂糖凝胶孔中，并施加电场，1使DNA片段在凝胶中迁移。
通过与已知大小的DNA分子量标准进行比较，可以确定PCR扩增产物的大小。
结论RT-PCR技术已经成为分子生物学领域中不可或缺的工具。
通过逆转录和PCR扩增，可以快速、准确地扩增RNA样本中感兴趣的DNA片段，为疾病诊断和基因表达研究提供了重要的技术支持。
了解RT-PCR的步骤和基本原理，有助于更好地应用该技术进行实验和数据解读。
2。
rtpcr的原理实验步骤及应用
RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。
本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。
原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。
RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。
在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。
2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。
3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。
4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。
5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。
通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。
实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。
提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。
2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。
需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。
按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。
反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
1． 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机六聚体引物这一丌特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体 系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物不其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性 方面均要小。 3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物， 若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由不 mRNA 3’端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。 三、 试剂准备 1．RMA 提取试剂 2．第一链 cDNA 合成试剂盒 3．dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 4．Taq DNA 聚合酶 四、操作步骤 1. 总 RNA 的提取：见相关内容。 2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同， 但 操 作 步 骤 丌 一 。 现 以 GIBICOL 公 司 提 供 的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
详细 实验方法
逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料
组织或细胞样品 试剂、试剂盒
实验篇之RT-PCR
实验篇之RT-PCR逆转录实验作为是常见的分子生物学实验之一，虽然看上去步骤简单，但当你实际操作时就会发现各种问题扑面而来，相信各位小伙伴都有被一个简单的逆转录实验搞得头晕眼花的时候，今天就由小编给大家介绍一下逆转录实验中的注意事项和常见问题，希望大家学以致用哦！图1 逆转录过程逆转录（reverse transcription）是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：1. 引物：逆转录引物主要有3种，包括Oligo（dT）、Random Primers 和基因特异性引物（GSP）。
其中Oligo（dT）具有12-20个 T 碱基，并且与真核生物 mRNA 的3’Poly A 尾配对，可合成全长的cDNA，但仅扩增有polyA 尾的mRNA ，对模板质量要求高，较适合克隆实验。
而 Random Primers 具有6-9个碱基，可随机识别模板并结合，适合复杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续qPCR 实验。
基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。
所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。
2. 逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNaseH 活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3，在高反应温度时可消除mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。
另一种来源于鼠白血病病毒（M-MLV），是单肽链的，有RNA 聚合酶活性和相对较弱的RNaseH 活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的 RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。
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RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版 为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两 种 ， 即 鸟 类 成 髓 细 胞 性 白 细 胞 病 毒 （ avian myeloblastosis virus,AMV ） 反 转 录 酶 和 莫 罗 尼 鼠 类 白 血 病 病 毒 （ moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。
2.5uL 0.5uL 0.5uL 0.5uL
ddH2O 上述反应液 TaqE
18.5uL 2uL 0.5uL
短暂离心，混匀体系中组份。
8
四、实验步骤
3、18SrRNA扩增：
在PCR仪中设置反应程序：
94℃反应5min 94℃ 30S 54℃ 30S 72℃ 30S 72℃ 10min 4℃ 5min
11
五、实验结果与分析
1 2 3 4 5 67M
500bp 250bp
12 34
注：1-7 PCR模板是小麦RNA
注：1-2 PCR模板是小麦RNA 3-4 PCR模板是烟草RNA
12
5
四、实验步骤
1、去除基因组DNA反应 在0.2mL无RNA酶的PCR管中加入以下试剂：
10×gDNA Eraser Buffer
1uL
gDNA Eraser
1uL
RNA
8uL
短暂离心，混匀体系中组份。
四、实验步骤
2、逆转录反应
向步骤1反应液中加入以下试剂：
三、仪器和试剂
1、仪器： PCR仪、高速冷冻离心机、微波炉、稳压电源、水
平电泳槽、凝胶成像系统。
2、材料与试剂： HiFiScript快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒 18SrRNA扩增引物序列为(5'–3')： L：CTTCTTAGAGGGACTATGGC R：TACGGAAACCTTGTTACGAC
30次
9
四、实验步骤
4、PCR产物电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，加入20mL 1×TAE缓
冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖 充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶 板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃， 以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中， 加样孔靠近阴极的一端。
10
四、实验步骤
4、PCR产物电泳检测 （3）上样电泳：将5μLRNA样品溶液和5μL上样缓冲液混匀 后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判 断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 （4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧 毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中5min左右，进入暗室， 使用凝胶成像系统照胶并拍照。
实验四 RT-PCR
1
一、实验目的
了解植物18SrRNA的特点，学会使用PCR进 行反转录获得cDNA技术，学习和掌握RT-PCR 的实验技术和实验原理。
2
二、实验原理
RT-PCR为反转录RCR（reverse transcription PCR）的缩 写，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RTPCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板 通过PCR进行DNA扩增。
HiFiScript
1uL
Primer Mix
1uL
5×RT Buffer
4uL
RNase-Free Water
4uL
短暂离心，混匀体系中组份。
42℃反应30min，85℃反应5min。
短暂离心，置于冰上冷却。
7
四、实验步骤
3、18SrRNA扩增：
在新的0.2mL PCR管中加入以下试剂：
Buffer dNTPs 引物L 引物R
由 一条 RNA 单链 转录 为互 补 DNA(cDNA) 称作 “逆 转 录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后， DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚 合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模 板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。
二、实验原理