微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

河北工业大学

硕士学位论文

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

姓名：孟庆宜

申请学位级别：硕士

专业：测试计量技术及仪器

指导教师：张思祥

20071201

河北工业大学硕士学位论文

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

摘要

随着科学技术的发展和基础医学研究的进步，人们对止血与血栓的发生发展认识越来越深刻，其检测手段也越来越先进。与此同时，分析仪器也日益向着微型化、集成化与便携化的趋势发展。其中，微分析系统是这一发展时期的典型代表，随着微流控芯片技术的发展，特别是检测灵敏度的日臻提高，用微流控芯片对微量物质的分析与检测日益受到重视。本课题研究的目的就是采用微流控芯片作为检测容器，在凝血检测中最大限度地把加试剂、反应、检测等分析功能集成为一体。

本课题在分析、总结了传统的检测原理及方法的基础上，设计了利用微流控芯片进行凝血四项检测的基本方法。首先我们利用步进电机设计了离心力驱动微流控芯片结构，该结构可在芯片旋转过程中完成血浆与试剂的混合、反应等操作。同时，运用能发射红光和蓝光的双光束二极管为恒定光源，光束透过芯片的检测区，在其另一面有硅光电池接收光信号。在与凝结剂均匀混合后，血浆由于发生一定的理化反应而凝结，光信号也会随之发生改变。硅光电池将光信号的变化转换成电信号的变化，经采集可显示整个凝结过程图像，经数据处理后计算，可得到需要的信息。

本课题根据检测原理重点对检测装置的机械部分进行了设计和改善，选择了微流控芯片来替代传统的玻璃试管作为检测容器，以改进用玻璃试管检测时所存在的问题，提高精度和可靠性；同时，对检测系统的硬件电路部分和基于LabVIEW 的检测系统操作软件进行了设计和完善，以提高系统的准确性，可靠性和稳定性；并且在研究和改进过程中完成了大量有效的实验。

采用微流控芯片作为检测容器与传统玻璃试管相比，试剂混合均匀，能去除透镜效应，且实验一致性好。该检测系统的研究成功将进一步促进我国医学检测技术的发展，同时，将加快微流控芯片的产业化，为分析仪器提供新的经济增长点。

关键词: 微流控芯片，凝血检测，虚拟仪器，离心力驱动

i

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

ii

RESAERCH OF CRUOR MEASURING SYSTEM

USING MICROFLUIDIC CHIP

ABSTRACT

With the development of science and the progress of medical research, people’s

understanding through thrombus and hemostasis is more and more profound, the request of examine method is also more and more advanced. At the same time, analytic instrument has had the current characteristics of micromation, integration and conveniency day after day. μTAS is the representation in this period. With the development of microfluidic technology, especially the advancement in detection, it is more and more important to analyse and detect micro-substance using microfluidic chips. Our research is to use microfluidic chip as detecting container, and the function of injecting the reagent, reacting and detecting are to be done all together.

On the basis of analyzing and summarizing the traditional examination principle and method, our work studies the basic method of cruor testing using microfluidic chip. Firstly, we design a frame called centrifugal force running microfluidic chip, which can finish the mixture and reaction of the plasm and reagent during the chip’s circumrotation. Then we take the red light or blue light as the constant photosource. The light beam goes through the detecting area, and on the other side of the chip there is a silicon photronic generator which will receive the luminous intensity signals. Because of the chemical reaction, the plasma congeals, so the luminous intensity changes. The silicon photoelectric generator transforms the luminous intensity signals to the electrical signals. After acquiring the electrical signal, the entire process of congeals may be demonstrated. And after the data processing and calculation, the requested information is acquired.

Our work mainly designed and improved the machine part of the system. We chose microfluidic chip to substitute the traditional cuvette as testing container, so as to correct the objection of cuvette, as well as improve the precision and reliability of the system. Meanwhile, we improved the hardware of the system and designed the software based on the LabVIEW platform servers, to improve the accuracy, reliability and stability of the system. During the designing and improving process, we have also done many effective experiments.

Compared with the traditional cuvette system, using microfluidic chip as testing container can wipe off lens effect, the plasm and the reagent mixed uniformly, and the experiments have good consistency. The success of this system will promote the medicine examination technology of our country. It can also quicken the microfluidic chip industrialization and provide analytic instrument new economic increase.

KEY WORDS: microfluidic chip, cruor testing, LabVIEW, centrifugal force running

河北工业大学硕士学位论文

符号说明

PT －Prothrombin Time，凝血酶原时间。

APTT －Activated Partial Thromboplastin Time，凝血活酶时间。

FIB －Fibrinogen，纤维蛋白原。

TT －Thrombin Time，凝血酶时间。

PRP －Platelet-rich Plasma，富含血小板血浆。

PPP －Platelet-poor Plasma，贫含血小板血浆。

DIC —Dessiminated Intiavascular Coagulation，弥散性血管内凝血。

I/O －Input/Output，输入/输出。

A/D －Analog/Digital，模拟/数字。

μl —微升。

R －电路中电阻的通用符号。

C －电路中电容的通用符号。

f －频率，赫兹。

ρ－相关系数。

δ－重复性误差。

v

原创性声明

本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。

学位论文作者签名：日期：

关于学位论文版权使用授权的说明

本人完全了解河北工业大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。

（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）

学位论文作者签名：日期：

导师签名：日期：

河北工业大学硕士学位论文

第一章绪论

§1-1 课题提出的背景

随着科学技术的飞速发展和进步，人类在生命科学和生物技术领域的探索也掀开了新的篇章，相应地，检验医学的研究和深入面临着更高的要求和更大的挑战。面对21世纪科技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分析科学也正经历着深刻的变革，其中一个日益明显的发展趋势就是仪器设备的微型化、集成化与便携化。当前，分析仪器的发展正在出现一个以微型化为主要特征的、带有革命性的重要转折时期。其中，微分析系统是这一发展时期的典型代表，随着微流控芯片技术的发展，特别是检测灵敏度的日臻提高，用微流控芯片对微量物质的分析与检测日益受到重视。

与此同时，近十几年来，随着血栓性疾病与出血性疾病在人类疾病谱中地位的变化及防治研究的迅速进展，血栓与止血的实验诊断技术也不断有新的发展并在全国逐步普及。血栓性疾病，尤其是心、脑血管血栓性疾病，已成为我国人口病死原因的第一位，而且发病率有所增加，严重危害人类健康[1]。

血栓与止血相关的检验，是近年来临床血液学发展最快的领域。随着科学技术的发展和基础医学研究的进步，人们对止血与血栓的发生发展认识越来越深刻，其检测手段也越来越先进，其中一个显著的特点是凝血仪的迅速发展和在血栓与止血检测方面的广泛应用，使得血栓与止血的检测从传统的手工方法发展到全自动凝血仪，从单一的凝固法发展到免疫学方法、生物化学方法，止血与血栓的检测也因此而变得简便、准确、精确[2]。目前，凝血仪已广泛应用于临床实验室。

当代较先进的血液凝聚分析仪器，能同时应用不同的实验原理对大量的标本进行多项指标的检测；与此同时，仪器对标本和试剂的需求比手工方法几乎减少一半，极大地降低了检测成本[3]。大家已了解到现代止血与血栓检验范围正在日益拓展，除了对出血性疾病的筛选与确诊外，还用于对各种血栓性疾病与血栓前状态的检测与预测，血栓症的评价，DIC的实验诊断以及对各种抗凝治疗患者的用药指导和愈后估计[4]。总之，在血液病、糖尿病、高脂血症、心脑血管病、心胸外科治疗等领域的研究诊断与治疗方面，止血与血栓检查均具有重要作用。

目前，这一类检验的工作量很大，在发达国家估计已占血液学检验的1/3。在发展中国家，凝血仪的开发研究，具有极大的潜力和广泛的发展前景。

§1-2 凝血检测系统的研究现状

1-2-1 凝血检测的方法及原理

1. 生物学方法(Biology)

生物学方法(凝固法)即将凝血因子激活剂加入到待检血浆中，使血浆发生体外凝固，凝血仪连续记录血浆凝程中的一系列变化(如光、电、机械运动等)，并将这些变化信号转变成数据，用计算机收集、处理数据后得出检测结果[5]。这类方法发展最早，使用最广泛。目前，在凝血仪中使用的凝固法大致可

1

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

分成三类：电流法(也称钩方法)、粘度法(也称磁珠法)、光学法。

（1） 光学法

这是当前凝血仪中使用最多的一种检测方法。一束光通过样品杯会发生透射和散射。样品杯中的血浆在凝固过程中，纤维蛋白原逐渐转变成纤维蛋白，其理学性状也会发生改变，透射光和散射光的强度也会发生改变。凝血仪根据这种由于血液凝固而导致光强度的变化来判断凝固终点的方法称之为光学法。光学法又可分成两种：散射比浊法和透射比浊法。

① 散射比浊法：即根据待检样品在凝固过程中散射光的变化来确定凝固终点的检测方法。来自发

光二极管的光被样品所反射或散射，散射光又被一光电二极管接收，仪器将光强度转变成电信号，这些电信号再被传送到一个监测器进行处理。当然，发射光的二极管同接收光的光电二极管必须成一定角度。

② 透射比浊法：即根据待检样品在凝固过程中吸光度的变化来确定凝固终点的检测方法。透射比

浊法的原理同散射比浊法的原理基本相似。来自光源的光经平行光管后变成平行光，此平行光透过待检样品后照射到一光电传感器上变成电信号，经过放大再被传送到一个监测器上进行处理。

（2） 电流法

即是将待测样品作为电路的一部分，由于纤维蛋白原无导电性而纤维蛋白具有导电性，可以利用凝血过程中电路电流的变化来判断纤维蛋白的形成。

（3） 粘度法(磁珠法)

即在待检样品加入小磁珠，利用变化的磁场使小铁珠产生运动，随着血浆的凝固，血浆粘度增加，小铁珠的运动强度逐渐减弱，仪器根据小铁珠运动强度的变化确定凝固终点[6，7]。

2. 生物化学法(bigchemistry)

生物化学法主要是通过测定发色物质的吸光度变化，以推算待测物的含量。其基本原理是：首先人工合成某种酶裂解物的化合物，且化合物与发色物质，如与对硝基苯胺(PNA)相连接。待检样品中含有活性酶(原)或经样品中加入过量酶激活剂，在检测过程中发色物质被解离下来，被检样品中出现颜色变化，它与被检物质含量呈数量关系。生物化学法以酶学方法为基础，可直接定量，所需样品量小，测定结果准确、重复性好，便于自动化和标准化。凝血仪日前使用发色物质检测的指标大致分为3种模式，即对酶、酶原和酶抑制物进行测定。

3. 免疫学方法(immunology)

免疫学方法是以被检测物质作为抗原，然后用免疫动物的方法制备相应的抗体，利用抗原体的特异性结合反应来对被检测物质进行定量。止血与血栓实验应用的免疫方法很多，包括免疫扩散法、免疫电泳、酶联免疫吸附实验和免疫比浊等。但自动凝血仪多采用免疫比浊法。免疫比浊既可以通过透射比浊，也可以通过散射比浊。虽然目前凝血仪使用免疫比浊法检测的实验室指标不多，但它作为一种新发展起来的方法，为其它实验室指标的自动化检测提供了一种新的途径。

4. 干化学技术(dry reagent technology)

这类分析方法主要用于床旁凝血分析。其原理是：用惰性顺磁铁氧化颗粒（paramagnetic iron oxide particles， PIOP）均匀分布并结合于可产生凝固或纤溶反应的干试剂中。PIOP 可在一固定垂直磁场作2

河北工业大学硕士学位论文

用下移动。当血标本通过毛细管作用进入反应层后，可溶解干试剂，并发生相应的凝固或纤溶反应，同时与试剂结合的PIOP在反应过程中通过其移动或摆动幅度的大小而提供。

纤维蛋白形成或溶解的动力学特征。PIOP 摆动所产生的光量变化通过光电检测器记录。然后通过信号放大、转换、计算而得到检测结果。

5. 超声分析(ultrasonic method)

这是一类利用超声波测定血浆体外凝固过程中血浆发生变化的半定量方法。在凝血分析过程中，以频率为2.0MHz 至2.7MHz 的石英晶体传感器作为信号的发射器和接受器。当血浆与相应试剂作用时，血浆凝固过程可使石英传感器的发射波产生相应的变化，通过接收、记录和分析这种变化而得到相应的结果。目前此方法使用较少[8]。

1-2-2 凝血仪的简介

凝血仪按自动化程度可分为半自动及全自动两种，前者主要检测一般的常规凝血项目，后者则有自动吸样、稀释样品、检测、结果储存、数据传输、结果打印、质量控制等功能，除对凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统的功能进行全面的检测外，尚能对抗凝、溶栓治疗进行实验室检测。

半自动凝血仪：目前市售的半自动凝血仪主要由样品、试剂预温槽、加样器和检测系统（光学、磁场）及微机所组成。全自动凝血仪的基本构成包括：样品传送及处理装置、试剂冷藏位、样品及试剂分配系统、检测系统、电子计算机、输出设备及附件等。

全自动凝血仪的特点是加样、预温、检测及报告结果全部自动化，如CA 6000、STA、MDA 180、Futura、MIA1600C等，这些仪器大致具有检测速度快、检测方法多样等特点，而且加样的自动化避免了人工操作的力度、方位等对实验结果的影响，但是全自动凝血仪开发成本昂贵。半自动的凝血仪加样需用手工，检测方法和检测速度都很有限，但其具有操作简便，价格便宜等特点，如CAl00、CArrYon Ⅳ、ST4、Fibrintimer等。有些半自动的凝血仪如Coachrome，既有凝固法，又有产色底物法分析，适用于中小型血栓与止血实验室。另外，还有一类使用全血的小型凝血仪，如TAS。将血液滴入检测卡的样品孔，血液即可沿着一定的管道系统流动，凝血仪监测血液的流动来判断凝固终点。这类仪器由于使用全血及检测卡，所以较适用于床边检测。

1-2-3 当前凝血仪的性能特点

1．检测速度快、检测项目齐全：目前广泛使用的全自动凝血仪的检测速度多在50-300 次(测试)／h，最快的可选700 次(测试)／h；检测的项目除常规的凝血筛选实验外，可进行单个凝血、抗凝、纤溶系统因子的检测，也可以进行抗凝及溶栓疗法的监测。

2．活性与抗原性同时检测：目前有的全自动凝血仪除了利用血浆凝固法和发色底物法进行有关因子活性检测外，尚可利用免疫比浊的原理进行这些因子的抗原含量测定。

3．检测通道、同时检测的项目：性能优越的凝血仪多有4个检测通道，同时检测的项目可以多达l0个。

4．标本及试剂位：全自动凝血仪一般有超过50个标本位，有的还设有急诊位可以使紧急标本优先检测。条形码的运用使仪器对标本及所需检测项目进行快速识别。性能优越的凝血仪设有多达20个l5℃的试剂位，可以满足多个检测同时进行的需求。由于配备了盖帽贯穿式进样机，有的仪器检测时可以不打开样品管，从而使检测的自动化程度又有提高。

3

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

4 5．结果的储存、传递：计算机技术的应用使仪器可以进行大量检测数据的储存(10000个)，通过特

定的接口可以使检验结果迅速传递到各临床科室。

1-2-4 当前凝血仪存在的问题

通过对凝血仪的调查研究，我们发现凝血仪中存在着一些问题：

1.手工和半自动测量仪器的测量一部分是手工操作，人工配置试剂，过程复杂，操作繁琐，精度不高，

随机误差大，工作效率不高[9]。

2.另一部分自动仪器的测量方法（比如磁珠法）和以前的比浊法来说，其抗干扰能力不是很强，测量

精度不是很高，灵敏度也不是很高[10]。

3.测量仪器的测量结果不能标准化且可比性差。

4.当前使用比浊法原理测量的仪器，多数抗干扰能力不足或者抗干扰能力与其价格很不相匹配[11]。

5.现在的测量仪器大部分都使用单色光源，不能满足不同检测项目需要不同波长光源的要求，因此它

们所能测试项目比较少，不能满足医院多方面的要求。

6.反应容器没有加入搅拌，试剂混合不均匀，因而测量结果也较不准确。

7.当前使用的软件开发系统复杂难懂，数据的存储量很少，同时由于软件固化在硬件仪器中，因此仪

器的功能不易修改，升级非常繁琐。

§1-3 微流控芯片的原理与应用

微流控分析芯片(microfluidic analysis chip)技术是20世纪90年代由瑞士的Widmer和Manz提出的，它是通过微细加工技术在约为几平方厘米的芯片上构建储液池、微反应室、微管道、微检测元件等微功能元器件，从而构成具有微流路控制的分析系统[12]。所以，也称为微全分析系统(micro total analysis system)；芯片上的实验室(lab-on-a-chip)等[13]。微流控芯片具有微型化、集成化、便携化、自动化、低成本和低损耗等诸多优点，这些优点也确保了其在众多领域的广阔的应用前景，譬如，生物医学、高通量药物合成筛选、农作物的优选优育、环境监测与保护、卫生检疫、司法鉴定研究等众多领域[14]。其中，生物医学是当前微流控芯片的主要应用领域，如用于临床检验的微流控芯片在我国拥有最广泛的市场。

与传统检测方法相比，微流控芯片可以在一块芯片上同时对多个病人进行多种疾病的检测；无需机体直接参与免疫应答反应，能实现早期诊断；能检测病源微生物种类，甚至微生物的亚型等。而且待测试样用量小，灵敏度和可靠性极高，检测成本低，自动化程度高。这些特点使得医务人员能够在短时间内，掌握大量的疾病诊断信息，从而帮助医生在短时间内找到正确的治疗措施。

该项技术发展迅速，应用领域不断扩展，已经引起国内外学术界和研究机构的高度重视。目前全球基于微流控技术产品的年利润以20%的年增长率迅速突破了150亿欧元[15]。近几年来，随着基础与应用基础研究的深入，微流控芯片的产业化进程显著加速。1999年后一些商品化微流控分析设备相继问世。许多发达国家，如美国、德国、荷兰、瑞典、丹麦等，均有新兴的公司积极进入了这一领域的开发研究，抢占市场[16]。我国在微流控分析方面的研究虽然起步较国外晚了4~5年，但在多个相关的学科领域都具有足够的积累与优势。我国具有世界上最大的微流控芯片市场，用中国的微流控芯片产业占领

河北工业大学硕士学位论文

这一市场、提高微流控芯片新的经济增长点是我国科学家责无旁贷的使命。为了保证这一目标的实现既需要扎实的基础与应用基础研究，又需要不断开发新的微流控芯片产品。

§1-4 本论文的主要研究内容

本论文的研究工作主要包括以下几个方面：

一、对凝血检测的各种方法及相应的原理进行研究，对凝血检测系统的总体方案进行分析和研究。

二、根据检测原理对检测装置的机械部分进行了研究和改进，选择了微流控芯片来替代传统的玻璃试管作为检测容器，以改进用玻璃试管检测时所存在的问题，提高精度和可靠性。

三、对检测系统的硬件部分分析与改进，提高系统的可靠性和稳定性。

四、研究操作软件设计方案，完成软件设计，实现软件操作的方便，快捷和智能。优化参数检测算法设计，提高数据处理的精度与可靠性。

五、完成大量有效的实验。进行实验分析，验证系统性能。

实验结果表明采用微流控芯片作为检测容器与传统玻璃试管相比，试剂混合均匀，能去除透镜效应，且实验一致性好。整套检测系统具有操作简单、易于生产、非接触检测、不受自然光干扰影响、精度高、准确性高、具有很强的信号智能化分析处理功能等优点。软件设计上采用了虚拟仪器，它的优点是使用灵活，可视性强，性价比高，易于功能升级。

本课题旨在采用微流控芯片作为检测容器，最大限度地把加试剂、反应、检测等分析功能集成为一体。该检测系统的研究成功将进一步促进我国医学检测技术的发展，同时，将加快微流控芯片的产业化，为分析仪器提供新的经济增长点。

5

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

第二章凝血检测系统总体方案设计

§2-1 检测系统的基本工作原理

本检测系统检测的项目主要为凝血四项检测，包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)等的检测。这些检测项目需要利用两种不同波长的光源进行检测，同时利用圆盘形的微流控芯片作为检测容器，如图2.1所示，首先，在靠近芯片圆心的贮液池R1中加入凝结剂，芯片外周的贮液池R2中加入血浆，那么在芯片旋转时凝结剂在离心力的作用下被甩向芯片外周，最终与R2中的血浆混合。由此，该结构可在芯片旋转过程中完成试样试剂混合、反应等操作。同时，运用能发射红光和蓝光的双光束二极管为恒定光源，光束透过R2，在其下表面有硅光电池接收光信号。在与凝结剂均匀混合后，血浆由于发生一定的理化反应而凝结，光信号也会随之发生改变。硅光电池将光信号的变化转换成电信号的变化，经采集可显示整个凝结过程电信号，经数据处理后计算，可得到需要的信息。如凝固时间、凝固过程曲线、按指定数学方法计算后的曲线等。

图2.1采集部分装置示意图

Fig. 2.1 Demonstration of the data acquireing part

该种方法的最大特点是：无损纤维，不受自然光干涉影响，可捕捉凝固过程的细微变化，精度高，准确性较好。

§2-2 检测项目与检测方法

本课题将完成凝血四项检测，即凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶时间（TT）的检测。凝血四项检测对人体凝血系统分析及临床止血，凝血障碍性疾病的诊断，治疗和检测等具有重要意义。尤其对播散性血管内凝血（DIC）的抢救和溶栓治疗有重要的价值。各检测项目的检测原理如下：

6

河北工业大学硕士学位论文

1. 凝血酶原时间（PT）

临床意义：用于判断白血病，特别是早幼粒细胞白血病，肝病，DIC，原发性纤溶，口服抗凝剂，口服避孕药，维生素K缺乏，循环抗凝物，血栓性疾病，静脉炎等[17]。

检测方法：选择波长为405nm 的蓝光。在100μl 血浆(PPP)中加入PT 试剂200μl (经过37℃预温)，在均匀混合的过程中，根据透光度曲线的突然下降找切变点，即为固态凝固的切变点。同时测出开始混合点到切变点的时间，百分浓度PTA 和国际正常化比值INR（时间参考范围是11s～14s，PTA 参考范围是80～120%，PTR 参考范围是1±0.15，INR 参考范围是0.8～1.5）。

2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）

临床意义：用于判断血友病，甲、乙、丙肝病，阻塞性黄疸，新生儿溶血症，肠道灭菌综合症，吸收不良综合症，口服抗凝剂，急性心肌梗塞，肺梗塞，脑血管病变，糖尿病伴血管病变，妊高症和肾病综合症等[18]。

检测方法：选择波长为660nm 的红光。在微流控芯片中加入贫含血小板血浆(PPP)100μl，加入ATPP 试剂100μl，以上混合物均匀后，在37℃温度条件下，准备预温180s，加入已37℃预温的CaCl2溶液，立即启动测试。根据透光度曲线的突然下降找切变点，即为固态凝固的切变点。测出血浆凝固所需时间和APTT 时间比值ATR（参考范围是26～40s，APTT 时间比值（ATR）=待测血浆APTT 值/正常参考APTT 值，参考范围是0.8～1.2）。

3. 纤维蛋白原（FIB）

临床意义：用于判断急性炎症，血栓前状态，血栓栓塞病，术后，妊高症，风湿热，恶性肿瘤，多发性骨髓瘤，糖尿病，糖尿病酸中毒，尿毒症，DIC，动脉硬化，结缔组织病，休克，化疗后，先天性低（无）FIB 症，重症肝炎，肝硬化，原、继发性纤溶，异常FIB 血症，重度贫血等[19]。

检测方法：选择波长为405nm 的蓝光，在37℃恒温时，在微流控芯片中加入贫含血小板血浆(PPP)200μl，加入FIB 试剂100μl，根据透光度曲线的突然下降找切变点，即为固态凝固的切变点。同时测出开始混合点到切变点的时间，需要输入定标曲线。FIB 浓度分别取1200，600，300，150，75g/l，定出浓度时间曲线（进行单位转换g/l 到mg/dl），FIB 浓度参考范围是2～4g/l，200～400mg/dl。

4. 凝血酶时间（TT）

临床意义：用于判断肝病，肾病，原发性纤溶，DIC，异常球蛋白血症或免疫球蛋白增多症等疾病[20]。

检测方法：选择波长为660nm 的红光，在37℃恒温时，在微流控芯片中加入贫含血小板血浆(PPP)200μl，加入TT 试剂100μl，根据透光度曲线的突然下降找切变点，即为固态凝固的切变点。同时测出开始混合点到切变点的时间（时间的参考范围是14～16s，TTR 的参考范围是0.8～1.2）。

§2-3 系统方案设计

为了满足检测系统的经济性、可靠性和实用性要求，我们从系统设计的机械结构、控制方法以及软件开发工具等各个方面进行了考虑，经过分析比较，最终确定了满足要求的检测系统。

7

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

2-3-1 机械结构

为了保证系统受到的干扰小，实验条件稳定，采集的数据重复性好，避免偶然误差，我们对传统的使用试管作为检测容器的机械结构进行了改进。由于使用试管存在着诸如透镜效应会造成检测误差、标准容器之间存在透光率误差、液面高度难以确定以及反应容器搅拌力度影响等缺陷，因而我们尝试着使用一种新的检测容器来替代试管。

微流控分析芯片是通过微细加工技术在约为几平方厘米的芯片上构建储液池、微反应室、微管道、微检测元件等微功能元器件构成具有微流路控制的分析系统。它具有以下优点：

（1）微流控分析系统具有极高的效率；许多微流控芯片可在数秒至数十秒时间内自动完成测定、分离或其他更复杂的操作。分析和分离速度常高于相对应的宏观分析方法一至二个数量级。其高分析或处理速度既来源于微米级通道中的高导热和传质速率（均与通道直径平方成反比），也直接来源于结构尺寸的缩小。

（2）微流控分析的试样与试剂消耗已降低到数微升水平，并随着技术水平的提高，还有可能进一步减少。这既降低了分析费用和贵重生物试样的消耗，也减少了环境的污染。

（3）用微加工技术制作的微流控芯片部件的微小尺寸使多个部件与功能有可能集成在数平方厘米的芯片面积上。在此基础上易制成功能齐全的便携式仪器，用于各类现场分析。

（4）微流控芯片的微小尺寸使材料消耗甚微。当实现批量生产后芯片成本可望大幅度降低，而有利于普及[21]。

鉴于以上分析，微流控芯片具有待测试样用量小，灵敏度和可靠性极高，检测成本低，自动化程度高等特点，我们决定采用微流控芯片作为检测容器。

2-3-2 控制系统

本控制系统的特点是：系统对执行机构的控制比较简单，对数据的处理比较繁琐，对信号的采集速度要求不是很高。根据控制系统的这些特点并结合系统设计的功能要求，我们提出了以下几种改造方案：1.采用单片机控制

单片机系统结构简单、采集速度快、价格低、体积小，但数据处理比较弱，界面不友好，同时抗干扰能力较差，而且采用一台单片机无法实现检测多种项目的功能要求，若用多台单片机进行控制，则检测系统的可靠性不高[22]。

2.采用上位机和下位机联合控制

该控制方式要求下位机负责采集检测信号，对被检测项目的各项参数进行修改，对各个检测通道状态进行监控。上位机与下位机控制器相互通讯，工控机作为上位机主要承担系统管理任务，例如各种数据和信号的检测，存储，分析，计算处理；查看检测各种事件，记录，证书查阅及打印等，而系统的一切控制任务的实现，动作的执行，控制模式的输出，都由下位机来执行，这种控制方式可靠性好，但成本较高。

3.采用PC机并配备多功能数据采集卡进行控制

这种控制方式可以多个检测通道共用一套控制系统，该控制方式以PC机作为上位机，多功能数据采集卡和简单的控制电路作为下位机。系统通过多功能数据采集卡和电路控制板之间的交互信息，实现对执行机构的控制和输入信号的采集，由PC机对采集的信号进行存储、分析并计算处理，输出结果。8

河北工业大学硕士学位论文

该控制系统有友好的界面，操作与监视较为方便，而且成本比较低，可靠性比较高[23]。

通过上述三种方案的分析比较，考虑到系统经济性的要求，我们决定采用方案3。

2-3-3 数据采集卡

在采用PC机配备多功能数据采集卡进行控制时，数据采集卡作为软件与硬件的连接部分，起着十分重要的作用，因此在选择数据采集卡测量模拟信号时，必须考虑下列因素：输入模式（单端输入或者差分输入）、分辨率、信号输入范围、采样频率、精度和噪声等[24]。

单端输入以一个共同接地点为参考点，它的信号源与采集端之间的距离较短，并且所有输入信号有一个共同的接地端。如果不能满足上述条件，则需要使用差分输入，在差分输入方式下，每个输入可以有不同的接地参考点，并且由于消除了共模噪声的误差，所以差分输入的精度较高。这里我们设计的电路信号源与采集端的距离较近，为了使得电路简单，我们采用单端输入。

分辨率是模/数转换所使用的数字位数，分辨率越高输入信号的细分程度就越高，能够识别的信号变化量就越小。

信号的输入范围和分辨率决定了输入信号可识别的最小模拟变化量，此最小模拟变化量对应于数字量的最小位上的0、1变化，通常叫做能换宽度（Code Width）。例如，一个十二位的数据采集卡，输入范围为0到10v，增益为1，则可检测到2.4mV的电压变化，而当输入范围为-10到10v（共20v）时，可检测到电压变化为4.8mV。这里我们信号的输入范围由调理电路控制到最小，0到5V，增益为1，因此可检测到1.2mV的电压变化，完全符合我们的检测要求。

采样率决定了数模变换的速率。其采样速率要满足采样定理，即采样速率是被采样信号变化速率的2倍以上。

综合以上考虑，本课题使用的采集卡为PCL-711B，PCL-711B 的特征是：有25KHz的8路单端输入，转换时间为25微秒，1路双缓冲12位模拟量输出通道，稳定时间为30微秒，16路数字量输入通道，16路数字量输出通道。模拟量输入输出的分辨率均为12位。PCL-711B[25]是一款低成本的板卡，适合一般性应用。本系统的输入输出通道分为模拟量输入通道、数字量输入通道、模拟量输出通道、数字量输出通道。

2-3-4 软件开发工具

对于一套控制系统，除了要求硬件支持外，还必须有功能强大的软件开发工具。基于PC机基础上的开发工具种类较多，PC机支持的控制软件有VB、VC以及组态软件LabVIEW等。VC、VB是微软开发的可视化语言，它们是面向对象的、功能强大的软件开发工具，具有数据结构表达能力强、复杂算法的程序相对容易开发、运行速度快等优点，但它的开发周期比较长； LabVIEW和VB、VC一样是一种编程工具，不过它是一种带有图形控制流结构的数据流模式，这种方式确保了程序中的函数节点只有在获得它的全部数据后才能够被执行。也就是说，在这种数据流程序的理念中，程序的执行是数据驱动的，它不受操作系统、计算机等因素的影响。LabVIEW中被连接的函数节点之间的数据流控制着程序的执行次序，而不像文本程序受行顺序执行的约束。也就是说LabVIEW编程，是“组合”图形和线条，而非“写”程序文本，因而程序容易开发，同时开发周期相对较短。LabVIEW具有编程代码效率差，运行速度较慢的缺点，但它同时也具有强大的数据采集功能[26]。

由于本系统在检测过程中，需要实时对温度传感器和检测通道的输出信号进行采集，同时系统硬件

9

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

已保证了采集速度，对软件运行速度要求不是很高，故而我们选择了具有强大数据采集功能的LabVIEW 开发平台。

2-3-5检测精度的影响因素

经过相关知识的积累，现把可能影响到检测精度的因素和设计经验总结如下。

1. 检测容器的影响

本课题的检测系统通过反复调试已经具有了很高的精度和灵敏度。盛放试样的芯片薄厚，芯片上是否有污渍，手印或划痕对检测结果都有影响。所以，为了避免偶然因素的影响，在实验前要挑选没有划痕，质地均匀的微流控芯片，并避免直接用手接触。

标准容器的透光率误差是由国外计量单位通过与更高精度的标准容器比对，并对其进行修正后得出的，其误差小于1‰，在进行系统精度评定时，应对该项误差进行考虑。

2. 检测仪器温度变化的影响

由于检测项目及试剂的生物特性要求检测仪器恒温在37℃左右，温度太高或太低都会影响试剂活性，从而影响反应结果，并且这种影响非常大。因此在检测过程中需要对工作容器和被检试剂进行实时的温度测量，保证两者的温度在37℃左右一个很小的范围。

§2-4 本章小结

本章是论文的理论基体部分，主要工作是讨论微流控芯片用于凝血四项检测的实验原理和方案设计。本章主要介绍了三部分内容：

1、简单介绍了检测系统的基本工作原理。

2、对系统的检测项目做了详细介绍，通过介绍明确了检测项目的临床意义和详细的检测方法。

3、结合系统的检测要求，提出了一套检测方案：以微流控芯片作为检测容器，以PC机为核心，在软件上采用基于Windows环境下的LabVIEW开发平台；在硬件上通过多功能数据采集卡和控制电路板实现了对执行机构的控制，同时对输出的不同信号进行数据采集。文中还对多功能数据采集卡的选取进行了详细的介绍，并对影响系统检测精度的因素进行了分析。

10

河北工业大学硕士学位论文

第三章检测装置的机械结构设计

§3-1 传统检测方法的改进

3-1-1 传统检测方法的缺陷

传统的检测方法如图3.1所示，使用双光束发光二极管作为恒定光源，光束通过装有血浆的试管，在试管另一端有硅光电池接受光信号。然后在血浆内加入凝结剂，同时为保证凝结剂与血浆混合均匀，通过电机的带动使试管内搅拌子在一定时间内转动。血浆由于发生一定的理化反应而凝结，光信号也会随之发生改变。硅光电池将光信号的变化转换成电信号的变化，经采集后送到计算机，

得到需要的信息。

图3.1 传统检测装置示意图

Fig. 3.1 Traditional detecting set diagram

但经过大量的实验总结，我们发现以上方法存在着如下缺陷：

1. 透镜效应

在使用试管作为检测容器时，我们发现，通过试管的光束的光强比在不放置试管时直接透射到硅光电池上的光强要强，这与我们预期的理论分析结果是不相符的。后经我们分析得出，以上现象主要是因为试管的透镜效应所致，即由于试管壁为曲面，在光路中本身相当于一个凸透镜，所以在光束透过试管时发生折射，使光线汇聚，导致光强信号增强。实验时我们还发现，在试管中加入水后，会增强试管的透镜效应。这种现象对检测结果将会产生随机的、不可预见的影响。

2. 容器误差

试管由于壁厚不相同，或者透光率的不同，由于手印，划痕等的影响，会对实验结果产生影响。表3.1 中有一组数据，是有手印的装水的试管的检测结果，根据数据能够清楚的看到试管各面透光率各不相同。

该表的数据是同一个玻璃试管，在同一测量通道中旋转不同角度得到的归一化后的检测数值。由表可以看出试管本身的性质对光路是有影响的，在试管位置0°时透光率最小，在试管位置180°时透光率最大。该数据的重复性小于2％，由数据可知，容器对实验结果的影响是很大的。

而在实际检测中，由于每次实验时使用的是不同的试管，并且如果是采用多路采集，在一次实验中

11

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

也要使用多个不同的试管，那么由于试管间材质的变化所造成的容器误差是不可忽略的。

表3.1 试管检测的试验数据

Table 6.1 Experiment datum about cuvette

试验次数 试管位置0度 试管位置90度 试管位置180度 试管位置270度

1 1.804 1.821 1.840 1.836

2 1.808 1.824 1.835 1.832

3 1.807 1.826 1.842 1.829

4 1.804 1.828 1.840 1.831

3. 液面高度

在使用试管作为检测容器时，如果设计的液面太高，则需要的试剂量就很大，这样一来，对试剂是个很大的浪费，为了节约成本，实现仪器的经济性，需要尽量降低液面，但是太低又可能使反应不够充分，或者光路无法成功捕捉。因此，确定液面高度是检测中一个比较困难的问题。

4.搅拌影响

在使用试管作为检测容器时，在反应容器中需要加入搅拌，以使反应试剂均匀，使反应完全。搅拌电机与试样瓶的距离不能太远，否则电机带动搅拌子的力度不够；也不能太近，否则使反应结束后形成的固态物质被打散，而许多检测项目原理是根据形成的固态物质多少来找到凝固终点的，这样会影响实验结果，或者使搅拌子转动力度太大而打到试管被卡住，有时会由于力度太大而在试剂中打出气泡，严重影响实验结果。但是又不能去掉搅拌，这样会使反应不充分均匀。

此外，由于电机的搅拌在实验过程中一直存在，由于化学反应的过程和原理不同，有些检测项目不受影响，但是对于有些检测项目，存在影响凝固的可能性，由于电机的持续搅拌，把凝固体打散，使本应该由于凝固而持续下降的曲线又上升了。可见电机搅拌具有很大影响。

再者，试管在检测时会由于搅拌子的晃动而在检测孔中发生晃动，这样会使得检测过程中试管随机发生晃动，产生倾斜，由此引入光的折射或漫反射误差，而引起检测的误差。

3-1-2 对检测容器的改进

由于使用试管作为检测容器存在着上述缺陷，因而我们尝试着使用一种新的检测容器——微流控芯片来替代试管。而微流控芯片具有微型化、集成化、便携化、自动化、低成本和低损耗等诸多优点，并且用于临床检验的微流控芯片在我国拥有最广泛的市场。因此我们尝试使用微流控芯片作为检测容器，它与试管相比具有以下优势：

1. 使用微流控芯片作为检测容器时，检测面为平面，因此可以解决使用试管时透镜效应所带来的影响。

2. 与试管相比，用于制作微流控芯片的材料有单晶硅、无定形硅、玻璃、石英和有机聚合物，如环氧树酯、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）等。它们的共同特点是具有良好的光学性质，光洁度好[27]。因此使用微流控芯片可以减小透光率误差。同时，由于同一块芯片的材质相对比较稳定，而我们使用的微流控芯片每一块具有20个检测通道，这一特点可以保证我们在一次实验中将容器误差所带来的影响降到最低。

3. 微流控芯片的储液池很小，其试样消耗已降低到数微升水平，这就降低了对试剂的消耗。同时，由于使用微流控芯片作为检测容器时，光源与光电接收装置是分别放置在检测区域的上、下位置，这样12

河北工业大学硕士学位论文

光线可以充分通过检测区，光路容易捕捉。

4. 使用试管时电机搅拌对实验具有很大影响。而使用微流控芯片时，由于是采用离心力驱动系统，血浆和试剂在离心过程中能够充分混合，因而可以省去了电机搅拌装置。

总之，实验结果表明采用微流控芯片作为检测容器与传统玻璃试管相比，试剂混合均匀，能去除透镜效应，且实验一致性好。

3-1-3 检测装置可靠性改进

在调试过程中，需要反复打开、合上仪器的外盖，对电路板反复拆装，这就对硬件的可靠性提出了一定的要求，本课题通过反复实验与改进，通过以下几方面增加硬件可靠性。

1. 可以固定接线的部分减少接插件的使用。在电路的调试与改进中发现，随着电路板的拆装次数增加，接插件容易松动和虚接，给检测工作的正常完成造成了不必要的麻烦，所以，把不必要的接插件改为直接焊接固定，是提高硬件可靠性的有效方式。

2. 通过合理安排各部分的位置以缩短导线，数据线的长度，避免交叉，从而提高系统的可靠性，避免在调试过程中改进了一部分却破坏了另外一部分的连接。

3. 由于外盖的掀开和合上，使得连接外盖上接口和电路板的数据线被反复拉拽，数据线与接口的焊接部分容易造成虚接。为了提高可靠性，使外盖的移动不再对焊接部分直接影响，本课题在外盖内部靠近电路板处加用接插件，使数据线与接插件连接，接插件与接口连接。这样以来，外盖的移动只会对外盖内部的接插件部分有影响，通过在合盖之前检查接插件是否松动，就可以免去检查焊头是否虚接的麻烦。

第3点看似与第1点相矛盾，实际在不需要接插件时减少使用，在防止接头被直接拉拽时增加使用，都是为了提高组装的可靠性，在使用时需要具体问题具体分析。

§3-2 微流控芯片检测的实验方法

3-2-1离心力驱动微流控芯片分析系统简介

离心力驱动[28，29]是微流控驱动技术中较为独特的一种技术，其系统利用芯片在微电机带动下做圆周运动时所产生的离心力作为液流的驱动力。通过改变芯片旋转速度和设计不同的通道构型可调节和控制流体的流速。1999年，Duffy等[30]报道了一种在芯片上集成加工有48个酶分析结构单元的离心式微流控芯片分析系统，系统采用比色法检测。其芯片结构如图3.2所示。通常离心力驱动的芯片为圆盘形，可在芯片上集成数十至数百个呈辐射状分布的结构单元阵列，有利于实现微芯片的高通量分析。系统工作时，被驱动液体放置于靠近芯片圆心的贮液池中，芯片旋转时在离心力作用下液流通过微通道网络流向芯片外周。该系统可在芯片旋转过程中完成酶分析所需要的试样试剂混合、反应、检测等操作。

离心力驱动微泵的特点是：设备较简单，微泵本身不需控制阀，仅靠一台调速微电机即可实现对流体的驱动和控制，驱动和控制设备一体化；芯片上没有可活动的机械部件，加工工艺要求不高；流体流动无脉动；驱动系统与被驱动流体不直接接触，因此对流体的种类没有特殊要求，可驱动的流体范围广泛，包括生物试样（如血液或尿）、含表面活性剂的缓冲液、有机溶剂等。离心力驱动的一个特点是其

13

微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

图3.2 离心力驱动微流控芯片分析系统

Fig. 3.2 Centrifugal force running microfluidic chip system

动力施加于芯片上的所有液流，所带来的优点是以单一微电机可同时提供芯片上所有（数十至数百个）结构单元中液流的驱动力，对于进行微流控芯片的高通量分析具有很重要的意义；所带来的问题是芯片内所有液流同时受力，如无外加微阀（起限流和切换作用）的配合使用，则无法完成复杂的微流控操作。离心式微流控芯片通常综合采用离心驱动系统和微通道上的控制微阀实现对流体的控制。目前离心力驱动芯片系统存在的主要问题是，旋转的芯片不易与外部的试样引入系统、联用的检测系统等设备进行耦联，在一定程度上限制了这一技术的应用。

3-2-2 本课题中微流控芯片检测的实验原理

我们利用圆盘形的微流控芯片作为检测容器，如图3.3 所示，首先，在微流控芯片上、下部分的合适位置固定发光二极管和硅光电池，在其侧壁的合适位置固定一个光电开关。然后，在靠近芯片圆心的贮液池R1中加入凝结剂，芯片外周的贮液池R2中加入血浆，那么在芯片旋转时凝结剂在离心力的作用下被甩向芯片外周，最终R1中的凝结剂与R2中的血浆混合。由此，该结构可在芯片旋转过程中完成试样试剂混合、反应等操作。

同时，运用能发射红光和蓝光的双光束二极管为恒定光源，光束透过R2，在其下表面有硅光电池接收光信号。在与凝结剂均匀混合后，血浆由于发生一定的理化反应而凝结，光信号也会随之发生改变。硅光电池将光信号的变化转换成电信号的变化，经采集可显示整个凝结过程电信号，经数据处理后计算，可得到需要的信息。

通过实验，我们检测到微流控芯片每转3圈，试剂可以被完全甩到R2中并充分混合，因此我们可以采用以下方法来检测凝血时间：首先选择一路通道作为本次的检测通道，在此通道的R1和R2中分别加入凝结剂和血浆，并且在此通道的外壁探出一挡光片，利用U形光电开关来监测此挡光片，以得到微流控芯片转的圈数。当光电开关数到微流控芯片转到第3圈时，立即停止供给电机脉冲，则芯片恰好停在检测通道。此时发光二极管亮起，进入检测部分，我们便可以通过发光二极管和硅光电池对此通道的凝血过程进行检测，得到凝结曲线。

14

河北工业大学硕士学位论文

图3.3 检测容器示意图

Fig. 3.1 Detecting container diagram §3-3 检测装置机械结构设计

3-3-1 检测装置总体机械结构

本检测装置由四大部分组成，分别为变压器、调理电路板、电源电路板和工作台。机械结构设计主要是安排它们的大小及相互位置，系统的内部结构如图3.4所示。图片右上方的为调理电路板，它由支撑柱支起固定在仪器底座的上方，左上方是电源电路板，它同样由支撑柱支起固定。调理电路板与电源电路板通过数据线与固定在仪器外盖上的接口相连，仪器的外盖接口与采集卡通过数据线相连，从而完成数据交换。左下方是变压器，它直接固定在底座上。右下方部分为工作台，加热，电机转动，微流控芯片加样等主要工作都要在这里完成，它更是采集信息的源头，所以它的设计与精度保证，对检测系统检测任务的顺利完成，具有至关重要的作用。

图3. 4 检测装置的内部实体图

Fig.3. 4 Detecting device interior entity diagram

15