细胞培养试剂的配置教学内容
器材与试剂
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等
具体步骤
1. 水：
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗
溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液：
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液
称取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。
5. 青、链霉素溶液：
所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
具体操作均在超净台内完成。
青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。
链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
分装于－20℃保存。
使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
6. RPMI1640：
溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。
然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。
最后定容至1000ml，摇匀。
安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。
然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。
通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
7. 血清的灭活：
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
8. HEPES溶液：
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。
对细胞无毒性作用。
它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH 范围。
使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：
准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。
0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。
注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。
如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
9. 谷氨酰胺：
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。
在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。
由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。
加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。
可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。
配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
10. 肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。
因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为??℃。
使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
11. Ⅰ型胶原酶：
0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。
注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。
分装入10ml小瓶-20℃保存。
12. 明胶溶液：
因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。
所以制备过程中必须要注意无菌操作。
首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。
其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌操作分装入50ml 小瓶中，4℃保存。
13. Hanks液：
称取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4.H2O 0.06g，加H2O至1000ml
注：Hanks液可以高压灭菌。
分装于4℃下保存。
14. D-hanks液：
1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升；
2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升；
3液：酚红：0.02g，用数滴NaHCO3溶解酚红
将2，3液移入1液中。
定容到1000毫升PH值是7.4左右。
分装于4℃下保存。
15. Giemsa染液：
称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。
56℃中保温90~120分钟。
加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。
使用时按要求用PBS稀释。
一般稀释10倍。
医学研究中细胞培养技术实验指南
医学研究中细胞培养技术实验指南细胞培养技术是医学研究中不可或缺的重要手段之一，它为研究人类疾病、药物筛选和治疗方案提供了有力的工具。
本文将为您介绍细胞培养技术实验的指南，帮助您更好地开展医学研究中的细胞培养实验。
一、细胞培养基准备细胞培养基是细胞生长和繁殖所必需的基础培养环境，正确配制培养基是实验成功的关键。
1.1 选择合适的培养基根据所研究的细胞类型选择适合的培养基，通常，最常用的培养基有DMEM、MEM和RPMI 1640等。
另外，根据实验需要，可以添加胎牛血清、人血清、抗生素和生长因子等。
1.2 培养基的配方与储存根据细胞类型和实验需要，制备培养基的配制液，遵循供应商提供的配方和使用说明。
配制好的培养基应储存在4℃冰箱中，避免阳光直射，保质期根据供应商指引执行。
二、细胞培养槽和培养器具准备保持实验环境的清洁和无菌是细胞培养实验中的另一个关键点。
2.1 准备培养槽和培养器具将所需培养槽、培养瓶、离心管、吸头、培养皿、离心机等培养器具在高压蒸汽灭菌锅或培养箱中进行高温高压灭菌。
培养槽在灭菌后应放置在无尘台上，注意避免污染。
2.2 储备适量的试剂和培养物品体外培养需要用到的培养基、胎牛血清、人血清、生长因子、抗生素等试剂必须事先准备好，并按照实验操作规范使用。
三、细胞的分离和培养细胞的有效分离和培养对保证实验结果的准确性至关重要。
3.1 细胞的分离根据所要研究的细胞类型选择合适的方法进行细胞的分离，如胰蛋白酶消化法、组织弹性体分离法以及银离子胶体沉淀分离法等。
在进行细胞分离前，务必将所有操作具备无菌条件，避免外界环境的污染。
3.2 细胞的培养将分离得到的细胞用预先准备好的培养基进行悬浮培养。
培养器具需先预先灭菌处理，避免细胞感染。
培养皿或培养瓶中应添加适量的培养基，根据实验需要添加相应的血清、生长因子等。
将需要培养的细胞分散均匀地加入培养器具中，将培养器具放入恒温培养箱中，维持适当的温度、湿度和二氧化碳浓度。
细胞培养基配方的使用教程
细胞培养基配方的使用教程细胞培养是生物学研究中常用的一项技术，它涉及细胞的生长、分化和增殖等过程。
细胞培养技术的发展离不开合适的培养基配方，细胞培养基配方的合理选择和使用对细胞培养的成功与否有着重要的影响。
本文将介绍细胞培养基配方的使用教程，以帮助初学者更好地理解和应用于实验中。
一、细胞培养基配方的基本组成细胞培养基是一种液体培养基，它为细胞提供了必需的营养物质和环境，促进细胞的生长和增殖。
一个典型的细胞培养基配方包含以下几个基本组成部分：1. 基础培养基：基础培养基通常由无菌水和缓冲液组成，提供了适宜的pH值和离子平衡，保持了培养基的稳定性。
常见的基础培养基有Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）、RPMI 1640等。
2. 蛋白质：蛋白质是细胞生长的主要营养物质，细胞培养基中通常含有胎牛血清（FBS，Fetal Bovine Serum）或小牛血清（CS，Calf Serum）等，它们富含生长因子和细胞黏附分子，有助于细胞的生长和增殖。
3. 营养物质：细胞培养基中还需要添加一定的营养物质，如氨基酸、糖类（如葡萄糖）、维生素和微量元素等，以提供细胞所需的能量和材料。
4. pH调节剂：细胞培养需要保持适宜的pH值，通常使用的是缓冲液和二氧化碳混合物（CO2）。
二氧化碳会在培养皿内与缓冲液发生反应，形成碳酸氢盐，调节培养基的pH值。
5. 抗生素/抗菌剂：为了防止细胞培养过程中的细菌、真菌和其他微生物污染，通常会向细胞培养基中加入抗生素或抗菌剂。
常用的抗生素有青霉素、链霉素等。
二、细胞培养基配方的使用步骤1. 准备工作：首先，需要准备好所需的培养基，按照提供的配方和比例将各种成分加入到基础培养基中，并加入适量的FBS或CS。
同时，准备好所需的细胞培养器具，如培养皿、离心管、吸头等，并对其进行无菌处理。
2. 培养基配制：按照细胞培养基配方提供的比例和顺序，将所需的成分逐一加入到基础培养基中。
细胞培养用液的配制
细胞培养用液的配制实验3 、细胞培养用液的配制【实验目的】1. 掌握DMEM培养基、胰酶的配制2. 学习针头滤器的使用方法【实验原理】一．细胞培养的基本条件1. 气体环境气体是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环，产生能量和合成各种成分。
二氧化碳主要维持培养基的pH，并作为碳源。
一般用5%的空气和5%CO2来提供动物细胞的气体生长环境。
氧分压过大，不利于细胞生长。
植物组织或细胞一般不需要额外提供CO2。
2. pH环境细胞生长的pH环境为：7.2-7.4，不同细胞有所差异。
一般细胞耐酸性比耐碱性大些。
CO2对培养基pH的影响： CO2是细胞的代谢产物， CO2的释放必然会影响培养基的pH。
CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-所以，培养基中要加一些缓冲剂，以保持pH的稳定，如NaHCO3 、HEPES等3. 糖类葡萄糖------细胞的主要营养物质，为生命活动提供能量糖类在生物体内的功能不仅仅是提供能量，与蛋白质和脂类共同构过程结构材料和生物活性物质。
体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基中都以葡萄糖作为能源材料，根据不同细胞的代谢特点，所加葡萄糖浓度有所不同。
植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。
4.氨基酸所有细胞多需要以下12种氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸另外所有细胞都需要谷氨酰胺，其具有特殊作用—促进氨基酸进入细胞膜，参与核酸合成，也是能源和碳源。
5.维生素在细胞代谢中起调节作用，虽然所需甚微，但为机体正常代谢不可缺少。
6.促生长因子培养基中除上述营养成分外，还需要促细胞生长因子，已知有许多激素具有促细胞增殖作用。
血清是提供促细胞生长因子和其他细胞所需物质的来源。
二．天然培养基与合成培养基1.天然培养基常用的天然培养基有血清、血浆、水解乳蛋白和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）、鼠尾胶原等。
细胞培养液的配制
关于R P M I1640细胞培养液的配制1) 配制培养基最好使用新制备的三蒸水。
一般在试验前当天或前一天制备为好。
调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。
2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。
3) 溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。
振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。
4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。
5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。
市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加即可。
市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加即可。
无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。
6) 调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％ NaHCO3调节pH到。
7) 过滤除菌：宜采用和滤膜各一张，上层为，下层为，以保证过滤效果。
注意滤膜正面（光面）朝上。
过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。
8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。
临用前将加入小牛血清(10%~20%)。
【注意事项】每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。
市售小牛血清使用前多应该灭活（56℃，30min），以消除补体活性。
动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。
优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。
生化检测总蛋白含量~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。
选定一个效果较好的批号后，可一次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO孵箱（孵育培养物）、2水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
二.无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者20.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
三.器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：(1)新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
细胞培养基本实验操作一般培养试剂介绍常用培养基及基本特性HBSS的配制和使用攻略
细胞培养基本实验操作一般培养试剂介绍常用培养基及基本特性HBSS的配制和使用攻略常用培养基及基本特性1、RPMI-1640 MediumRPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。
主要用于悬浮细胞培养。
其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。
2、Minimum Essential Medium（MEM）也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。
成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。
MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。
3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。
适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。
4、DMEM-低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。
低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。
5、DMEM/F12DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。
F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。
该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。
为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12（1：1）中加入15mM HEPES缓冲液。
6、McCoy’s 5AMcCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。
细胞培养液配制操作规程
细胞培养液配制操作规程
试剂和器材准备：
1. 用三角瓶装1L 超纯水，放入搅拌子，盖上铝箔纸，121摄氏度高压灭菌30分钟，冷却过夜。
2. 过滤器装好滤膜后用报纸包装好，121摄氏度高压灭菌30分钟。
3. 装培养液的试剂瓶瓶口用铝箔纸包好，140摄氏度烘烤3小时。
配制过程：
1. 将盛有灭菌超纯水的三角瓶放到磁力搅拌器上，搅拌速度以液面恰能产生漩涡为宜。
2. 打开干粉培养液的包装，将干粉慢慢加入容器，边加边搅拌
3. 往包装袋内加入适量的超纯水使残留的培养液粉末溶解并倾倒入三角瓶内，如此清洗数遍
4. 添加NaHCO3。
RPMI1640添加2.0g NaHCO3，DMEM添加3.7g NaHCO3。
5.搅拌约2小时待干粉完全溶解。
6. 用1N NaOH 和1N HCl调节培养液pH在
7.1～7.2，调节好pH后盖紧容器。
7. 加入5 mL 200×的PS双抗，搅拌均匀。
8. 0.22um微孔滤膜过虑除菌，分装到试剂瓶中，盖好瓶盖密封，4摄氏度保存。
使用前添加血清，使血清含量为10％。
未加血清的培养液可在4摄氏度保存8个月，加血清后应在1个月内用完。
9. 检验。
取过滤后的培养液3～5mL，置于无菌的35mm培养皿中，放入培养箱中培养两天，检查是否有长细菌。
注：
1. 过滤完毕后应及时把过滤器和试剂瓶清洗干净。
清洗过程：自来水冲洗，蒸馏水洗3遍，超纯水洗一遍，沥干，烘干
2. 本操作规程以配制1L为例，配制量多时各组分应等比例增加。
1。
培养用液的配制
实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。
2. 掌握常用的灭菌方法。
3. 了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。
依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。
首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。
若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。
这一过程可在超净工作台外操作。
实验步骤一、原代细胞的培养1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。
4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。
细胞培养试剂的配制
细胞培养试剂的配制一、Hank’s液配方：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hank’s液可以高压灭菌。
4℃下保存。
二、磷酸盐缓冲液(PBS)的配制母液的配制：0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L 的NaH2PO4，81ml 0.2mol/L 的Na2HPO4, 即可。
然后只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，如：0.1M PB（PH=7.4）：取500ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml 即可。
0.01M PB（PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml 即可。
0.02M PB（PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至1000ml 即可。
若需要NaCl的话，加入NaCl至0.9%（g/100ml）即可。
三、胰蛋白酶溶液的配制配制胰蛋白酶时，要注意药品的牌号，活性及保存时间。
不同的牌号、质量会有差别，更重要的应注意酶的活性。
配制时，应按所标活性(一般活性为1：250)配制最适浓度的溶液。
配制方法下：0．25％胰蛋白酶(活性1：250)溶液的配制：1：250 胰蛋白酶0.25gHank 液100ml配制时，先用少量Hank 液溶解胰蛋白酶，然后再将余液加入。
置于370C 水浴中，溶解lh(时间长短取决于溶解程度，待溶液全部透彻清亮为止)。
溶解后，用除菌滤器过滤，无菌分装，密封，贴好标签，置于低温冰箱(-20℃)保存。
使用前，用7.4％NaHCO3调PH 至7.6-7.8。