生物化学 酪蛋白讲义
酪蛋白的提取与定性鉴定
酪蛋白的提取与定性鉴定摘要牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为35g/L，本实验以市面上出售的伊利纯牛奶为原料进行酪蛋白的提取。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至４.７时，酪蛋白就会沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后，便可得到较纯的酪蛋白。
利用显色反应对所提取的酪蛋白进行定性鉴定，结果发现它能与双缩脲反应生成紫红色化合物；与印三酮反应生成蓝紫色物质；与浓硝酸发生黄色反应，在碱性溶液中进一步形成深黄色的硝醌酸钠。
关键词酪蛋白提取定性鉴定双缩脲反应茚三酮反应黄色反应牛奶对人体有很多好处，可以促进心血管的健康，控制高血压，增强免疫机能，还能改善睡眠状况，对人类有很大的益处。
而牛奶的主要成分是酪蛋白，所以我们去提纯分析牛奶中酪蛋白的含量很有意义，可以此来初步判断市场销售牛奶的质量。
另外，通过对提取的酪蛋白进行定性鉴定，可以了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式，知道其与某些氨基酸的呈色反应原理，并学习常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
1材料和方法1.1材料伊利纯牛奶（从超市购得）离心机抽滤装置（布氏漏斗）精密pH试纸电炉电子称烧杯试管移液管玻璃棒滤纸温度计药匙锥形瓶1.2酪蛋白的提取取两个锥形瓶，分别放入50mL牛奶和50mL醋酸缓冲液，在水浴锅中加热至40℃。
在搅拌下慢慢将两者混合。
用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心15分钟（3000r/min），弃去上清夜，得酪蛋白粗制品。
用蒸馏水洗沉淀3次，每次离心10分钟（3000r/min），弃去上清液。
在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2 次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
将沉淀摊开在表面皿上，风干；得到酪蛋白纯品。
准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100mL 牛乳（g%）得率：测得含量/理论含量X100%1.3双缩脲反应取少量尿素结晶，放在干燥试管A中。
酪蛋白的分子特性
酪蛋白的分子特性
4. 三级结构：酪蛋白的氨基酸序列决定了其三级结构。它通常具有α-螺旋和β-折叠等二 级结构，以及蛋白质内部的疏水核心和水溶性表面。
5. 功能性：酪蛋白在乳制品中具有多种功能。它可以形成凝胶，增加食品的黏稠度和质地 。它还可以稳定乳液，防止乳脂球的聚集和沉淀。
酪蛋白的分子特性
酪蛋白是一种乳制品中常见的蛋白质，具有以下分子特性：
1. 多肽链：酪蛋白是由多肽链组成的蛋白质。它由数个氨基酸残基通过肽键连接而成。
2. 多样性：酪蛋白家族包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白等多种类型 。它们在氨基酸序列和结构上有所不同，因此具有不同的功能和特性。
总之，酪蛋白是一种具有多肽链、多样性、疏水性、三级结构和功能性的蛋白质。它在乳 制品中起着重要的作用，影响着乳制品的质地和稳定性。
生物化学蛋白质 讲课文档
（Asp,D）
谷氨酸
（Glu,E）
天冬酰胺 （Asn,N）
谷氨酰胺 （Gln,Q）
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碱性氨基酸
赖氨酸 （Lys,K）
精氨酸 （Arg,R）
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杂环
组氨酸 （His,H）
中性脂肪族氨基酸
甘氨酸 （Gly,G）
丙氨酸 （Ala,A）
缬氨酸 （Val,V）
含羟基或硫脂肪族氨基酸
◆ 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎 所有的生命活动过程。蛋白质的主要生理功能:催化
功能；结构功能；调节功能；防御功能；运动功能；运 输功能；信息功能；储藏功能 • • • • •
第七页，共120页。
1.蛋白质顺序异构现象是蛋白质生物功能多样性和种属特异
性的结构基础。
2.催化作用：在体内催化各种物质代谢反应的酶几乎都
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二、氨基酸的分类
自然界中游离存在的AA有300多种，生物体中发现 的 AA已有180多种，但构成蛋白质的AA只有20种 名称（三句半口诀）
甘丙缬亮异
苏丝半蛋天 谷精赖苯酪 组色脯
AA的名称常使用三字母的简写符号表达，也使用单 字母的简写符号表示--主要用于表达长多肽链的AA顺序
10.其它：甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特异的生物学功 能。
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结构蛋白
构建生命体的材料（没有不含蛋白 的生物体）
如a-角蛋白、胶原蛋 白
催化作用
高效专一地催化机体内几乎所有的 生化反应
酶
调节作用
通过体液，神经系统调节机体代谢 活动有序进行
如激素、神经递质、 钙调蛋白、阻遏蛋白
酪蛋白参数
酪蛋白，也称为Casein，是一种在哺乳动物（包括牛、牦牛、山羊、马、兔等）和人的乳汁中广泛存在的磷酸化蛋白质。
它可以分为四种类型：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。
以下是关于酪蛋白的一些参数信息：
β-酪蛋白（β-CN）：它是由乳腺腺泡上皮细胞合成的磷酸化蛋白质，占人乳中酪蛋白总量的50%～85%。
在人初乳中，β-酪蛋白的含量为0.26 mg/100 mL，而在成熟乳中，其含量为0.3～0.5 mg/100 mL。
分子量：不同类型的酪蛋白具有不同的分子量。
例如，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白的分子量分别为2.3万、2.3万和2.4万道尔顿，而κ-酪蛋白的分子量为1.9万道尔顿。
氨基酸残基含量：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的氨基酸残基含量分别为199、207、209和169。
磷酸丝氨酸残基：这四种酪蛋白中分别含有8、10、5和0个磷酸丝氨酸残基，这些残基可以结合同等数量的矿物元素，如无机磷、钙和镁。
请注意，以上参数可能因不同的研究或来源而有所变化。
为了获得更准确和详细的信息，建议查阅相关的专业文献或咨询相关领域的专家。
酪蛋白的等电点为
酪蛋白的等电点为酪蛋白是一种重要的蛋白质，它是乳制品中最主要的蛋白质成分之一。
酪蛋白具有多种生物学功能，包括营养、免疫、生理和功能等方面。
酪蛋白的等电点是指在特定条件下，酪蛋白分子带有零电荷的pH值。
本文将介绍酪蛋白的等电点及其相关知识。
酪蛋白的结构和性质酪蛋白是一种大分子蛋白质，由多种氨基酸组成。
它的分子量约为24000-25000道尔顿，是一种水溶性蛋白质。
酪蛋白的结构包括α-酪蛋白和β-酪蛋白两种，其中α-酪蛋白是一种水溶性蛋白质，而β-酪蛋白则是一种疏水性蛋白质。
酪蛋白的结构和性质决定了它在不同条件下的电荷状态和溶解性。
酪蛋白的等电点酪蛋白的等电点是指在特定条件下，酪蛋白分子带有零电荷的pH 值。
当酪蛋白分子带有零电荷时，它的溶解度最低，容易形成沉淀。
酪蛋白的等电点通常在pH 4.6左右，这是因为在这个pH值下，酪蛋白分子的羧基和氨基带有相等的正电荷和负电荷，因此酪蛋白分子带有零电荷。
酪蛋白的等电点对乳制品加工和质量有重要影响。
在乳制品加工过程中，酪蛋白的等电点可以用来控制酪蛋白的溶解度和稳定性。
例如，在制作奶酪时，酪蛋白的等电点可以用来控制凝固过程中的酪蛋白沉淀和凝固速度。
在乳清分离和浓缩过程中，酪蛋白的等电点可以用来控制酪蛋白的沉淀和分离速度。
酪蛋白的等电点还可以用来控制乳制品的质量。
例如，在制作酸奶时，酪蛋白的等电点可以用来控制酸奶的口感和质地。
在制作乳清蛋白粉时，酪蛋白的等电点可以用来控制乳清蛋白粉的溶解度和稳定性。
酪蛋白的等电点还可以用来研究酪蛋白的电荷状态和分子结构。
例如，在电泳分离中，酪蛋白的等电点可以用来确定酪蛋白的电荷状态和分子量。
在质谱分析中，酪蛋白的等电点可以用来确定酪蛋白的分子结构和序列。
总结酪蛋白是一种重要的蛋白质，具有多种生物学功能。
酪蛋白的等电点是指在特定条件下，酪蛋白分子带有零电荷的pH值。
酪蛋白的等电点对乳制品加工和质量有重要影响，可以用来控制酪蛋白的溶解度和稳定性。
牛乳中酪蛋白的一级结构
牛乳中酪蛋白的一级结构酪蛋白是一种在牛乳中存在的重要蛋白质，它占据牛乳蛋白总量的80%以上。
酪蛋白具有复杂的结构，包括一级、二级、三级和四级结构。
在本文中，我们将重点讨论酪蛋白的一级结构。
一级结构指的是蛋白质中的氨基酸序列。
牛乳中酪蛋白主要由四种不同的酪蛋白组成，即αs1-酪蛋白(αs1-casein)，αs2-酪蛋白(αs2-casein)，β-酪蛋白(β-casein)和κ-酪蛋白(κ-casein)。
每种酪蛋白都由多个肽链组成，这些肽链之间通过键合相互连接，形成多肽链复合体。
αs1-酪蛋白是牛乳中含量最高的酪蛋白，占总酪蛋白的40%左右。
它由207个氨基酸组成，分为αs1-CN-I、αs1-CN-II和αs1-CN-III三个肽链。
αs1-CN-I是最大的肽链，含有92个氨基酸；αs1-CN-II包含90个氨基酸；αs1-CN-III包含25个氨基酸。
这三个肽链通过二硫键相互连接，形成一个大的多肽链复合体。
αs2-酪蛋白是牛乳中含量第二高的酪蛋白，占总酪蛋白的30%左右。
它由207个氨基酸组成，分为αs2-CN-I、αs2-CN-II和αs2-CN-III三个肽链。
αs2-CN-I和αs2-CN-II都包含99个氨基酸，而αs2-CN-III包含9个氨基酸。
这三个肽链通过二硫键相互连接，形成一个大的多肽链复合体。
β-酪蛋白是牛乳中含量最低的酪蛋白，占总酪蛋白的10%左右。
它由209个氨基酸组成，分为β-CN-I和β-CN-II两个肽链。
β-CN-I包含50个氨基酸，而β-CN-II包含159个氨基酸。
这两个肽链通过非共价键相互连接，形成一个大的多肽链复合体。
κ-酪蛋白是牛乳中最小的酪蛋白，含量约为0.1%。
它由169个氨基酸组成。
κ-酪蛋白具有独特的结构，由一个α-螺旋和一个β-折叠区域组成。
α-螺旋区域含有64个氨基酸，而β-折叠区域含有48个氨基酸。
这两个区域通过非共价键相互连接，形成一个小的多肽链。
酪蛋白凝固的基本原理概论
酪蛋白凝固的基本原理概论酪蛋白凝固是指在适宜条件下，酪蛋白分子在液体中聚集形成三维网络结构，形成凝胶态的过程。
这种凝结过程主要是通过酪蛋白分子间的相互作用引起的。
酪蛋白是一种质朊丰富的蛋白质，存在于牛奶和其他哺乳动物的乳汁中。
酪蛋白主要由α-酪蛋白（α-CN）、β-酪蛋白（β-CN）和κ-酪蛋白（κ-CN）等多种蛋白质组成。
在牛奶中，这些酪蛋白的结构是以胶束的形式存在。
酪蛋白凝固的基本原理与酪蛋白分子之间的各种相互作用有关。
这些相互作用主要包括水化作用、氢键和疏水相互作用。
首先，水化作用起到了关键作用。
在水中，酪蛋白分子通过水分子与之相互作用，形成水合层。
这种水合层可以阻碍酪蛋白分子之间的相互接触和相互作用。
而在酪蛋白凝固的过程中，通过改变环境条件，如提高温度或酸化，水合层会受到破坏。
这样，酪蛋白分子之间的相互作用将得以增强。
其次，氢键也是酪蛋白凝固过程中的重要相互作用之一。
酪蛋白分子中存在着大量的酰胺键和羟基等可以与氢氧化物形成氢键的官能团。
这些氢键既可以通过分子内的形成，也可以通过分子间的相互作用形成。
在酪蛋白凝固的过程中，由于环境条件的改变，酪蛋白分子之间的氢键会增加，导致分子之间的相互作用增强，从而促使凝固的发生。
最后，疏水相互作用在酪蛋白的凝固过程中也发挥了重要的作用。
酪蛋白分子中的疏水氨基酸残基主要位于分子的内部，而亲水性残基主要位于分子的表面。
这种结构使得酪蛋白分子在水中形成了胶束。
当环境条件改变，如温度升高或pH 的改变，疏水氨基酸残基将会暴露在凝胶的表面上，从而增加了分子之间的疏水相互作用，推动凝固的发生。
总结起来，酪蛋白凝固的基本原理可以归结为水化作用、氢键和疏水相互作用的改变。
通过改变环境条件，如温度和pH等，这些相互作用可以得到增强，从而使酪蛋白分子相互聚集形成凝胶态。
这个过程在许多食品工艺中起到了重要的作用，如奶酪、酸奶等的生产中。
牛乳中酪蛋白的理化性质及应用
乳化性
蛋白质是食品中使用最广泛的发泡剂。一般地，
当酪蛋白溶液中溶解态蛋白质浓度越高，所形成的 泡沫越多。此外，偏离等电点处，发泡能力较强的 原因还在于: 蛋白质净电荷的提高减弱了疏水相互 作用，提高了蛋白质的延长性，使得蛋白质能够更 快的扩散到空气- 水界面，将空气包埋，提高泡沫 的形成能力。在分界线处，聚合态蛋白质扩散速度 相对较慢，发泡性降低，但泡沫的稳定性较高，可 能由于界面上蛋白质- 蛋白质之间的相互作用，形 成了黏稠的膜。此外，由于缺乏在界面和吸附分子 之间的静电排斥，被吸附至界面的蛋白质数量增加。 当界面压力、界面膨胀特性提高时，也会提高泡沫 稳。
酪蛋白的物理性质
• 不溶于水，遇稀酸式凝乳酶则会凝固。 • 不溶于有机溶剂（酒精）。 • 颜色为白色，无味，粒状固体，相对密度为1.26
酪蛋白的化学性质
酪蛋白+钙盐→沉淀（加热） 酪蛋白+ 酸 →沉淀（凝固） （PH=4.6时为等电点，两性蛋白质。）
酪蛋白+酶（凝乳酶） →凝固（干酪），医药（干酪素）
疏水性
随着加热温度的升高，酪蛋白表面疏
水性显著升高。体现出加热强度加大后， 暴露到酪蛋白表面的疏水基团数量增加 的明显趋势。随着pH值的降低，表面疏 水性有逐渐升高趋势。
黏度
酪蛋白溶液的黏度随着温度升高逐渐下降。一般地，酪蛋白分子在 溶液中呈现为伸展的无规线团状，随着温度的升高，无规线团结构 被破坏，表现为无规线团卷曲，使分子间的缠结更为紧密，导致酪 蛋白分子流体体积减小，溶液黏度减小。另一方面，温度升高，分 子间氢键作用被削弱，这也是体系黏度下降的主要因素。此外，升 高温度，还可能提高酪蛋白分子链的柔顺性，使溶液黏度降低。
强力粘接剂
干酪素与碱反应其产物具有很强的粘接力，并且干酪素不 溶与水，因此有很好的抗水性，广泛地应用于家具和乐器 的粘合中。
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实验五酪蛋白的制备及含量测定
一、实验目的
1.学习和掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的原理和方法
2.学习分光光度计的原理和操作方法。
二、实验原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调成4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸残基，它们的结构中具有共轭双链，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。
在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。
但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差异，因此需用同种蛋白质作对照，结果才可靠。
在半定量测定和纯蛋白的定量测定时，可用280nm的光吸收法。
在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法。
紫外吸收法操作简便快捷，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛。
三、实验仪器及试剂
95%乙醇(配100mL)、乙醇-乙醚混合液（V:V=1:1）(配200mL)
0.2mol/L NaOH （配250mL）
0.2M pH4.7 HAC-NaAC 缓冲液（配300mL）: A液：称NaAc·3H2O 54.44克，定容至2L。
B液：称醋酸 12克，定容至1L。
取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3L。
1mg/ml标准酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
用时配制成浓度为1mg/ml的溶液。
牛奶、无水乙醚、离心机、天平、滤纸（Φ=9cm）、表面皿、抽真空泵、抽滤装置（布氏漏斗，抽滤瓶，圆形抽滤管，橡皮塞）、40℃水浴、通风柜、紫外分光光度计、试管
四、实验步骤
1、等电点法制备酪蛋白
将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃，将20mL牛奶加热至40℃，（牛奶和缓冲液预热的目的？）在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液，用精密pH试纸调pH至4.7（如果pH没有调至4.7，对得率有什么影响？），可见溶液变为乳白色悬浮液。
待悬浮液冷却至室温，4000rpm 离心8min，弃上清，得酪蛋白粗制品。
用6mL水洗脱沉淀1次（酪蛋白溶于水吗？），4000rpm离心5min，弃上清在沉淀中加入6mL 95％乙醇（乙醇作用？），搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗（什么作用？）中抽滤，用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀1次，最后用乙醚洗涤沉淀1次（乙醚什么作用？在什么环境中使用？），抽干。
将沉淀摊开在干净玻璃或培养皿上，风干，得酪蛋白纯品，准确称量，计算含量和得率。
（注意含量和得率的区别）含量（g％）＝（酪蛋白g／100mL牛奶）×100％
得率＝（测得含量／理论含量）×100％，理论含量为3.5g/100mL牛乳
2、紫外吸收法测蛋白质含量（这步和上步的关系？上步中制得的酪蛋白是纯品吗？紫外吸收法测得的蛋白质含量准确吗？）
（1）标准曲线的绘制（标准曲线的横纵坐标的单位是什么？1-8号管的横坐标对应的数值是？表中1-8号管的蛋白质浓度数值是怎么得来的?）
加完混匀后，用紫外分光光度计测A280，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
（2）酪蛋白样品液制备测定
配制酪蛋白含量在0.05～1.25mg/mL(为什么配成这个浓度？怎么配成这个浓度的溶液？)的待测样液进行吸光值测定。
为使酪蛋白溶解，可向样品中加入少量0.2mol/L NaOH，再用蒸馏水洗入100ml容量瓶中定容。
取待测酪蛋白溶液1.0mL置试管中，加入蒸馏水3ml，混匀，（以什么为对照调零？）按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测酪蛋白的浓度。
五、实验结果
1、计算酪蛋白含量和得率，并指出实验步骤中会影响得率高低的具体操作。
2、根据紫外吸收法测出1.0mL样液中酪蛋白的浓度，计算出20mL牛奶中含有的酪蛋白质量。
并进一
步计算出根据紫外吸收法得到的酪蛋白含量和得率。
3、比较等电点法制备酪蛋白质量和紫外吸收法计算出的酪蛋白质量，得出结论。