蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算
实验3 酵母蔗糖酶的制备
实验3 酵母蔗糖酶的制备一、实验目的1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量二、实验原理酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。
三、实验器材1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。
2、材料：啤酒酵母、3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。
四、实验步骤1 研磨水提取(1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。
(2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。
(3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。
(4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。
(5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。
(6) 将上清液转入量筒，量出体积。
用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。
（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。
2 热处理和乙醇沉淀(1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。
(2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
(3)将上清液转入小烧杯中，放人冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐)，缓慢地加入等体积预冷至—20℃的95％乙醇，同时轻轻搅拌．再在冰盐浴中放置l0min、以沉淀完全。
关于蔗糖酶活性的研究 生物化学实验
对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究兰德新（同组：李建鑫）浙江工业大学海洋学院食工1201摘要：目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。
方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。
结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。
为我们将来的实验奠定了技术上的基础。
关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE文献综述:蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。
因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。
而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。
在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在植物体内的时空分布。
蔗糖酶的制备和活力测定
冰浴和离心的同时， 可以开始做级分I和级分II的
蛋白质含量测定，
酶活测定
葡萄糖标准曲线的制备
管号
试剂 ml
标准糖溶液 5mM 0.1M醋酸缓冲液
0 0 2.0
1 0.6 1.4
2 0.8 1.2
3 1.0 1.0
4 1.2 0.8
5 1.4 0.6
0.1M NaOH溶液
二硝基水杨酸溶液
2.5
0.5
2 0.4 0.2
3 0.6 0.2
4 0.8 0.2
5 1.0 0.2
H2O
0.1M NaOH溶液 二硝基水杨酸溶液
1.8
2.5 0.5
1.6
2.5 0.5
1.4
2.5 0.5
1.2
2.5 0.5
1.0
2.5 0.5
0.8
2.5 0.5
混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标， 以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线
3. 级分I （1:50）
4. 级分I （1:100）
6. 级分II （1:50）
7. 级分II （1:100）
参照蛋白质浓度标准曲线(预制)，计算出各级分蛋白质含量。 y=0.0035x
X代表溶液的浓度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值
实 验 结 果
1、葡萄糖浓度的标准曲线
2、级分I和级分II中的蔗糖酶的活力 （每 1ml蔗糖酶溶液产生的还原糖量） 3、级分I和级分II中蛋白质的含量（每1ml 所含的mg） 4、计算级分I和级分II蔗糖酶的比活力： 比活力=
OD(595nm)
20 40 60 Protein Con.(mg/ml)
蔗糖酶的测定
蔗糖酶的测定：
酶液制备：称取0.5g左右棉花材料，加入5ml,0℃左右0.1mol/L 的磷酸—柠檬酸缓冲液[PH—5.0]，碾磨。
在冰浴中提取0.5小时。
然后在4℃、223离心20min。
收集上清液。
磷酸—柠檬酸缓冲液[PH—5.0]
母液：A )0.1mol/l柠檬酸溶液（19.21g溶于1000ml）
B)0.2mol/l磷酸氢二钠溶液（53.65g Na2HPO4.7H2O）或
71.7g Na2HPO4.12H2O溶于1000ml)
A）:x ml +B）:y ml，稀释到100ml PH—5.0 x=24.3 y=25.7
酶活性测定:
以蔗糖为底物，反应总体积为2.5ml[含1ml、pH 5.0、0.2mol/L 的磷酸——柠檬酸缓冲掖，0.2ml lmol/L的蔗糖，0.05ml酶液和1.2ml 蒸馏水]。
酶活性低时适当增加酶液体积。
在30℃恒温水浴中保温lh。
加1ml DNS溶液(取6.3g DNS(3，5一二硝基水杨酸)加262ml 2（mol/l）克当量NaOH注入酒石酸钾钠(182g溶于500ml蒸馏水中)热溶液中，加重蒸酚5g，无水亚硫酸钠5g，加热至DNS溶解，冷却定容到1000ml，避光保存。
)
终止反应，在沸水浴中加热5分钟，立即放在冷水中使反应缓冲液冷却，540nm处测定吸收值。
在以上的混合液中加预先灭活的酶液为空白对照。
取20-100ug葡萄糖，加lml DNS溶液，加热5分钟，540nm处比色，绘制标准曲线。
计算酶的活力。
蔗糖酶
3.1 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究自1860年Bertholet从啤酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。
蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似。
本实验未区分内酶与外酶，是直接从酵母粉中进行提取。
用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。
比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。
该实验共有九个分实验，几乎覆盖了酶分离纯化、鉴定及其酶学性质研究的全部内容，为学生提供了一个较全面的实践机会，学习有关酶的分离纯化及其相关研究。
1．蔗糖酶的提取与部分纯化2．离子交换柱层析纯化蔗糖酶3．蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定4．分离产物的SDS－PAGE电泳检测5．反应时间对产物形成的影响6．pH对酶活性的影响和最适pH的测定7．温度对酶活性的影响和最适温度的测定8．底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K m和最大反应速度V max的测定9．尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验3.1.1 蔗糖酶的提取与部分纯化3.1.1.1 目的1）学习微生物细胞破壁方法。
酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓和酶活力测定
蛋白总量 = 蛋白浓度×总体积 总酶活 = 酶活×校正体积 比活力（Unit/mg）＝总酶活力/总蛋白 纯化倍数 = 比活力之比 回收率 = 总酶活之比
分实验四：离子交换柱层析纯化蔗糖酶
一、实验目的 学习掌握离子交换柱层析的原理与操作
二 、实验原理
离子交换是指液相中的离子与固相交换 基团中的离子可逆反应。离子交换剂有阳离子 交换剂（如：羧甲基纤维素：CM-纤维素）和阴 离子交换剂（如：二乙氨基乙基纤维素： DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经 离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电 荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改 变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来 。
➢在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。 ➢葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。 ➢氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂 磷钼酸试剂 葡萄糖标准溶液 0.2mol/L蔗糖溶液 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到 层析柱中，注意不要扰动柱床，上样后，用大约 30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，当A280nm 值降低稳定后，可用恒流泵及梯度混合器进行梯度 洗脱 [梯度混合器左侧放入50ml 0.02 mol/L pH值 为7.3的Tris-HCl缓冲液（含1 mol/L NaCl）， 右侧放入等量0.02 mol/LpH值为7.3的Tris-HCl 缓冲液]。
10 ──反应10min
B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）
啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提纯及测定解读
浙江工业大学药学院生物化学实验论文2013 年12 月13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。
（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。
（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。
（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD540计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。
(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。
（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。
蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5.实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。
蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验
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3、 蔗糖酶粗品（E1）的制备
①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；
②抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜， 8000r/min
7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择 确
定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；
8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计
试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。
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Байду номын сангаас
二、实验原理
前言
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构 和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。
② 工作以曲葡线萄。糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出
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3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540
（mg） （ml） （ml）
（ ml）
10
0
2.0
3
2 0.4 0.2
1.8
3
3 0.8 0.4
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度
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成品E3 计算出E3浓度
周六（全天）上午8：00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定
(2).用正交法测定几种因素
对蔗糖酶 活力的影响
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