荧光偏振及应用
荧光的原理及应用
荧光光谱的测量 步骤
荧光光谱的应用 领域
荧光光谱在生物医学领域的应用：通过荧光光谱技术对生物分子进行检测和分析， 可用于疾病诊断、药物研发和生物成像等方面。
荧光光谱在环境科学领域的应用：通过荧光光谱技术对水体、土壤等环境样品中 的有机污染物进行检测和分析，可用于环境监测和污染治理等方面。
荧光光谱在化学分析领域的应用：通过荧光光谱技术对化学物质进行定性和定量 分析，可用于化学分析、材料科学和药物化学等领域。
激发态的稳定性：激发态不稳定，电子会释放能量回到基态
荧光发光过程：质吸收能量后，电子从基态跃迁至激发态，再回到基态时释放能量， 发出荧光光子
荧光物质吸收能量 电子从基态跃迁至激发态 电子从激发态返回基态时释放能量 发出荧光
PART FOUR
荧光颜色与物质组成：荧光颜色与物质组成密切相关，不同物质具有不同的荧光颜色。
激发态不稳定：激 发态不稳定，会释 放能量回到基态
释放能量：释放能 量以荧光的形式释 放
荧光物质：荧光物 质需要具有吸收能 量和释放能量的能 力
PART THREE
荧光物质吸收能量
电子从基态跃迁至激发态
激发态不稳定，释放能量 回到基态
释放能量以光的形式表现
激发态的形成：电子吸收能量从基态跃迁至激发态
PART SIX
高灵敏度：荧光技术具有高灵敏度， 能够检测到微量的荧光物质。
快速：荧光技术通常具有快速检测 的优点，可以在短时间内完成大量 样本的检测。
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
特异性：荧光技术具有特异性，能 够针对特定的目标进行检测。
方便：荧光技术通常使用简单的设 备和操作流程，方便用户使用。
荧光颜色与物质结构：物质结构对荧光颜色也有影响，如共轭体系的存在会导致荧光颜色发 生变化。
荧光偏振技术原理
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法
Chem. Asian J. 2014, 9, 87-92.
第三十八页，编辑于星期二：八点 十分。
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米球形聚电解质刷增强荧光偏振信号分析方法
ChemBioChem 2010, 11, 494-497.
第三十四页，编辑于星期二：八点 十分。
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
“signal-off”
氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法
“signal-on”
Anal. Chem. 2013, 85, 1424-1430.
第三十五页，编辑于星期二：八点 十分。
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米颗粒增强荧光偏振信号分析方法
变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。
• 如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小，分 子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振光值 低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位 mP）。
• 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
荧光偏振技术的优势: 荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是不生成有
第十三页，编辑于星期二：八点 十分。
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
3. 核酸分析
实时监测DNA双链的形成和解链过程
Nucleic Acids Res. 2003, 31: e70.
第十四页，编辑于星期二：八点 十分。
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
荧光偏振技术介绍
62原理：当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。
如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。
如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。
如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。
如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
如图2.图2 荧光偏振检测原理任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。
因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。
对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。
近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。
因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。
相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。
最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。
此外，荧光偏振所需的样品量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。
概述光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。
当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析（FPIA）的原理，并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。
【关键词】荧光偏振免疫分析应用从1852年，Stokes首次提出“荧光（fluorescence）”一词，人们对荧光现象的研究就不断深入，并发展出了荧光分析技术，荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。
随着相关理论和仪器的发展，荧光分析的手段和技术水平也不断发展，现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点，在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。
基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。
一、荧光偏振原理荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。
溶液中荧光分子受偏振光激发，如激发时分子保持静止，则发射的荧光仍有偏振性，且如分子分子旋转或翻转，发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。
虽然实际测量常得消偏振的荧光，但荧光偏振技术有着重要应用[1]。
荧光偏振光强度P定义为：P=（I⊥-I∥）/（I⊥+I∥）其中，I⊥和I∥表示荧光子被激发后，发射光在垂直和水平方向上的强度。
对于荧光偏振仪器，检测到的荧光强度：P=（Ivv-G×Ivh）/（Ivv+G×Ivh）式中，下标分别代表起偏器和检偏器方向，v为垂直方向，h为水平方向，G 为校正因子，G=Ihv/Ihh。
荧光偏振光强度P与测定体系中各因素的关系可用Perrin方程表示:（1/P-1/3）=1/P0+（1/P0+1/3）（RT/V）(τ/η)其中，P0为极限荧光偏振光强度，R为气体常数，T为绝对温度，V为摩尔分子体积，τ为荧光寿命，η为溶液的粘度。
由上式知当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。
荧光化学发光在植物分子生物学的应用
BRET应用示例－蛋白质相互作用
•COP1-光形态建成的关键抑制因子
•COP1的二聚体化
PPT文档演模板
• 发光光谱 •（关注530/480 ratio）
荧光化学发光在植物分子生物学的应 用
BRET应用示例－蛋白质相互作用
•cytoplasmic localization se
•Amylas e
•fragments
• 荧光标记的Amylose被分解成小片段(偏振值下降)
PPT文档演模板
荧光化学发光在植物分子生物学的应 用
FP应用的局限性
➢ 使用具有较短寿命的荧光素（如Fluorescein） ➢ 依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变
•LARGE molecule
•Decreased Glucosidase and Fucosidase Activity in nai1-1 and nai1-2 Arabidopsis Mutants. (Plant Cell, 1536–1549, 2004-16)
PPT文档演模板
荧光化学发光在植物分子生物学的应 用
FI应用－蛋白酶活性分析
1) 已知蛋白激酶特异性的 底物结构域
2) 磷酸化识别结构域
•Indicators for protein phosphorylation in living cells
PPT文档演模板
荧光化学发光在植物分子生物学的应 用
FRET应用的局限性
➢信噪比经常不佳，通常为1：1 • ---背景主要来自受体被直接激发的信号
PPT文档演模板
荧光化学发光在植物分子生物学的应 用
BRET应用范围
• 蛋白组学: ▪ 蛋白-蛋白相互作用 ▪ 胞内细胞器间的相互作用 ▪ 对酵母双杂交结果的验证
酶标仪——精选推荐
酶标仪酶标仪是什么？⽤来做酶联免疫反应的专⽤仪器。
本质上是⼀台光电⽐⾊计。
按照⽤途可以分为光吸收酶标仪和多功能酶标仪。
光吸收酶标仪，只有光吸收模块，所以只能做光吸收实验，核酸蛋⽩定量，酶学分析，ELISA，细胞分析。
主要型号：F50，SUNRISE。
区别，通道数不同。
F50为8通道，SUNRISE为12通道，包括⼀个参⽐通道。
光源不同，F50为LED冷光源，SUNRISE为卤素灯热光源。
波长范围不同，F50为400～750，SUNRISE为340～750，并且，可配温控模块。
另外，SUNRISE12个通道，检测更快。
有1个参⽐通道，可以开机可以⾃动校准波长。
可配温控模块，温控还是⽐较好的。
不⽤配电脑，集成有触控⾯板，内置Windows ce的系统。
F50体积⼩巧，检测准确，免费升级，免维护，不⽤换灯，卤素灯最多2年就需要更换，不⽤预热，使⽤⽅便。
两款都是经典的光吸收酶标仪。
相当的⽪实，耐⽤，⽽且也够准确。
多功能酶标仪除了光吸收模块，还有温控，⽓体模块，进样器，荧光模块，发光模块，震荡模块。
所以，波长范围200~1000全波长。
还会看到⼀个参数：OD范围：0～4。
在酶标仪上，测量光吸收量⽤OD表⽰样品的吸光度。
典型应⽤，核酸定量，因为核酸在260有特征吸收。
蛋⽩在280有特征吸收，故可以定量蛋⽩。
⽽，两者的⽐值，可以反应样品核酸的纯度。
DNA或RNA的浓度OD260=1.0相当于50 g/ml双链DNA(dsDNA)40 µg/ml单链DNA/RNA20 µg/ml寡核苷酸(Oligos)DNA或RNA的纯度DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0蛋⽩质定量—最常⽤的两种⽅法y Bradford法—考马斯亮蓝染⾊法考马斯亮蓝G-250和蛋⽩结合形成蓝⾊化合物（在595 nm处有最⼤吸收峰）BCA法蛋⽩质的酞胺键在碱性条件下和Cu2+反应⽣成Cu+与BCA结合形成紫⾊复合物（在562 nm处有最⼤吸收峰）因为特征吸收波长的原因，F50，SUNRISE不能做核酸和蛋⽩定量。
光的偏振现象及应用
光的偏振现象及应用在我们日常生活和科学研究中，光无处不在。
然而，光的奥秘远不止于它的明亮和温暖，其中一个引人入胜的现象便是光的偏振。
光，通常被我们认为是一种电磁波，如同水波一样，在空间中传播。
但与水波不同的是，光的振动方向是多样的。
而当光的振动方向变得有规律，不再是随意的各个方向时，就产生了偏振光。
想象一下，你手中拿着一根绳子的一端，上下抖动，产生的波沿着绳子传播。
如果这时候你给绳子加一个限制，让它只能在一个方向上抖动，那么产生的波就是偏振的。
光的偏振也是类似的道理。
偏振光有几种常见的产生方式。
其中一种是通过反射。
当自然光以特定的角度照射到某些表面时，反射光会变成偏振光。
比如，我们在开车时，有时候会看到路面或者水面反射的强光非常刺眼，这时候如果我们戴上偏振眼镜，就能有效地减弱这种反射光，让我们看得更清晰。
另一种产生偏振光的方式是通过偏振片。
偏振片就像是一个特殊的“筛子”，只允许特定方向振动的光通过。
我们常见的偏振眼镜就是在镜片中加入了偏振片。
那么，光的偏振现象有哪些奇妙的应用呢？在摄影领域，偏振镜可是摄影师们的得力助手。
当拍摄蓝天时，使用偏振镜可以减少大气散射导致的偏振光，让蓝天更加湛蓝，白云更加突出，增强画面的对比度和色彩饱和度。
拍摄玻璃橱窗内的物品时，偏振镜能够消除玻璃表面的反射光，清晰地展现橱窗内的展品。
在 3D 电影中，偏振光也发挥着关键作用。
3D 电影的原理是让观众的左眼和右眼分别看到不同的图像，从而产生立体感。
通过特殊的放映设备和偏振眼镜，让左眼看到一种偏振方向的光，右眼看到另一种偏振方向的光，这样我们就能感受到逼真的 3D 效果。
在科学研究中，偏振光更是不可或缺。
例如，在化学分析中，利用物质对偏振光的吸收特性，可以确定分子的结构和性质。
在天文学中，通过观测来自遥远天体的偏振光，可以了解天体周围的磁场分布和物质的运动情况。
在通信领域，偏振光也有着独特的应用。
由于偏振光的振动方向可以被精确控制和调制，因此可以用于提高光通信的容量和保密性。
光的偏振与偏振光的应用
光的偏振与偏振光的应用光的偏振是光波在传播过程中振动方向的归属。
光的偏振可以分为线偏振和圆偏振两种类型。
线偏振光是指光波振动方向只在一个平面上的偏振光，而圆偏振光是指光波在空间中呈现出旋转状的偏振光。
光的偏振性质在许多领域有着广泛的应用，本文将探讨光的偏振以及偏振光在科学研究和技术应用中的重要性。
一、光的偏振的起源和特性光的偏振现象最早由法国科学家雅克·布鲁斯特在19世纪初发现。
他发现光在介质界面反射时，发射出的光线呈现出具有特定方向的偏振现象。
进一步的研究发现，光的偏振是由电磁波的振动方向决定的。
根据波动理论，光可以看作是电场和磁场相互垂直并在空间中传播的电磁波。
光波的电场分量在垂直于传播方向的平面内振动，而偏振光则是指光波的电场分量在特定方向上振动的光。
具体而言，线偏振光是指电场分量偏振于一个确定的平面，而圆偏振光则是电场分量绕传播方向旋转形成的。
二、光的偏振的应用领域1. 光学显微镜：光的偏振在生物学和材料科学中有着广泛的应用，特别是在显微镜观察下的样品分析。
通过使用偏振片和偏振镜，可以有效地调节进光的偏振方向，使得只有偏振方向与样品性质相互匹配的光能通过样品，从而获得清晰的图像和更多的细节信息。
2. 偏振光与液晶显示：液晶显示技术中，利用偏振光的特性，通过电场控制液晶分子的排列方向，进而调节光的偏振方向，实现图像的显示和色彩的变化。
这种技术被广泛应用于电子产品中的液晶显示屏和液晶电视中。
3. 偏振光与光学器件：偏振光的应用不仅仅局限于显示技术，还广泛应用于制造各种光学器件中，如偏振片、偏振镜、偏振器等。
这些器件可以选择性地调节和控制光的偏振方向，用于光的分析、光的操控和光的调制等方面。
4. 偏振光与材料科学：光的偏振在材料科学研究中也扮演着重要的角色。
通过研究材料对不同偏振光的吸收、散射和透射特性，可以了解材料的结构、性质以及相互作用方式，为材料的设计和应用提供依据。
5. 光纤通信：光纤通信技术中，偏振保持和偏振控制对于信号传输的稳定性和可靠性具有重要意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
荧光偏振现象
荧光偏振&荧光各向异性
Fluorescence Polarization (FP) P = (I∥ - I⊥) / (I∥ + I⊥)
Fluorescence Anisotropy (FA) r = (I∥ - I⊥) / (I∥ + 2I⊥)
P = 3 r / (2 + r) r = 2 P / (3 – P)
Weber greatly expanded the theory and developed the first instrumentation for the measurement of FP.
Dandliker and co-workers expanded FP into biological systems, such as antigen-antibody reactions and hormone-receptor interactions.
荧光偏振现象
荧光偏振现象
Fluorescence polarization (FP) can be considered a competition between the molecular motion and the lifetime of fluorophores in solution.
– θrot is the rotational relaxation (correlation) time (the time required to rotate through an angle whose cosine is 1/e, or approximately 68.5°)
– τfl is the fluorescence lifetime of the excited fluorescent probe
荧光偏振及应用
姜浩 2007.3
内容
荧光及其测量 荧光偏振 应用
– 流动性 – 分子基本性质 – 酶学 – 分子相互作用 – 荧光偏振免疫 – 成像
荧光标记方法
荧光
The fluorescence of a molecule is the light emitted spontaneously due to transitions from excited singlet states (usually S1) to various vibrational levels of the electronic ground state, i.e. S1,0→S0,v.
r = r0 exp ( –t /θ) Steady-State Fluorescence Polarization Time-Resolved Fluorescence
荧光偏振现象
If linear polarized light is used to excite an ensemble of fluorophores, only those fluorophores aligned with the plane of polarization will be excited. There are 2 scenarios for the emission.
荧光偏振的测量
荧光偏振的测量
Following a pulse excitation, the fluorescence anisotropy of a spherical particle in a homogeneous isotropic medium decays exponentially
发射光谱 激发光谱 时间分辨 空间分辨
内容
荧光及其测量 荧光偏振 应用
– 流动性 – 分子基本性质 – 酶学 – 分子相互作用 – 荧光偏振免疫 – 成像
荧光标记方法
荧光偏振简史
Fluorescence polarization was first described in 1926 by Perrin.
Jolley and co-workers developed FP into a commercial system for the monitoring of therapeutic drug levels and the detection of drugs of abuse in human body fluids.
荧光的测量
It can be characterized by several parameters.
– Intensity at a given wavelength I(λ)
– Quantum yield
Φ
– Lifetime
τ
– Polarization
P
These parameters can be monitored in a steady-state or time-resolvedห้องสมุดไป่ตู้manner.
荧光
Jabłoński diagram illustrating the creation and fate of a molecular excited singlet state, including absorption (ABS), fluorescence (FL), phosphorescence (PH), internal conversion (IC), intersystem crossing (ISC), vibrational relaxation (VR) and collisional quenching (CQ).Not included are processes like solvent relaxation, energy transfer and photochemical reactions
荧光的测量
They carry information about both the photophysical properties of the fluorescing molecule and the chemical and physical nature of its microsurroundings.