荧光偏振常用荧光标记物
荧光偏振技术介绍
62原理：当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。
如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。
如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。
如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。
如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
如图2.图2 荧光偏振检测原理任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。
因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。
对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。
近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。
因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。
相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。
最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。
此外，荧光偏振所需的样品量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。
概述光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。
当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析（FPIA）的原理，并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。
【关键词】荧光偏振免疫分析应用从1852年，Stokes首次提出“荧光（fluorescence）”一词，人们对荧光现象的研究就不断深入，并发展出了荧光分析技术，荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。
随着相关理论和仪器的发展，荧光分析的手段和技术水平也不断发展，现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点，在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。
基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。
一、荧光偏振原理荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。
溶液中荧光分子受偏振光激发，如激发时分子保持静止，则发射的荧光仍有偏振性，且如分子分子旋转或翻转，发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。
虽然实际测量常得消偏振的荧光，但荧光偏振技术有着重要应用[1]。
荧光偏振光强度P定义为：P=（I⊥-I∥）/（I⊥+I∥）其中，I⊥和I∥表示荧光子被激发后，发射光在垂直和水平方向上的强度。
对于荧光偏振仪器，检测到的荧光强度：P=（Ivv-G×Ivh）/（Ivv+G×Ivh）式中，下标分别代表起偏器和检偏器方向，v为垂直方向，h为水平方向，G 为校正因子，G=Ihv/Ihh。
荧光偏振光强度P与测定体系中各因素的关系可用Perrin方程表示:（1/P-1/3）=1/P0+（1/P0+1/3）（RT/V）(τ/η)其中，P0为极限荧光偏振光强度，R为气体常数，T为绝对温度，V为摩尔分子体积，τ为荧光寿命，η为溶液的粘度。
由上式知当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。
抗体标记 绿色荧光素种类
抗体标记绿色荧光素种类
抗体标记是生物学和生物化学领域中常用的实验技术，用于检
测特定蛋白质的存在和定位。
绿色荧光素是一种常用的荧光标记物，可以用于追踪和观察细胞内的蛋白质。
在实验室中，常见的抗体标
记绿色荧光素的种类包括荧光素蛋白（GFP）、蓝色荧光素（BFP）、黄色荧光素（YFP）和红色荧光素（RFP）等。
其中，荧光素蛋白（GFP）是最常用的一种，它源自水母，能够
发出绿色荧光。
由于其稳定、明亮的荧光特性，被广泛用于活细胞
成像、融合蛋白的定位等实验中。
蓝色荧光素（BFP）、黄色荧光素（YFP）和红色荧光素（RFP）则分别发出蓝色、黄色和红色荧光，
可以用于多重标记和共定位实验。
这些荧光标记蛋白可以通过基因工程技术将其连接到感兴趣的
蛋白质上，形成融合蛋白，然后利用抗体进行检测。
通过荧光显微
镜等设备观察细胞或组织中的荧光信号，可以了解蛋白质的表达和
定位情况，从而深入研究细胞功能、信号传导通路等生物学过程。
除了上述提到的荧光素蛋白外，还有许多其他类型的荧光标记物，例如荧光染料和量子点等，它们在不同的实验条件下具有各自
的优势和特点。
科研工作者可以根据实验需要选择合适的抗体标记绿色荧光素的种类，以便进行精确而可靠的实验研究。
荧光偏振技术介绍
62原理：当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。
如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。
如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。
如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。
如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
如图2.图2 荧光偏振检测原理任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。
因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。
对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。
近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。
因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。
相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。
最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。
此外，荧光偏振所需的样品量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。
概述光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。
当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。
临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验-荧光免疫技术 复习资料汇编
临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验-荧光免疫技术复习资料汇编一、概述荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光。
（一）荧光荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光。
荧光物质（二）其他荧光物质铕（Eu3＋）为三价稀土镧系元素，其螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。
二、荧光抗体技术荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位。
荧光抗体技术包括荧光抗体制备、标本制作、荧光抗体染色和荧光显微镜检查等内容。
（一）荧光抗体的制备1.抗体要求：用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力。
2.荧光素要求：①与蛋白质结合后不易解离，而未结合者易于清除；②荧光效率高；③荧光色泽与背景组织对比鲜明；④不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
3.抗体的荧光素标记：搅拌法和透析法。
4.荧光素标记抗体的纯化：去除未结合的游离的荧光素。
可采用透析法或层析分离法。
5.荧光抗体的鉴定：荧光素与蛋白质的结合比率（组织切片的荧光抗体染色以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色以F/P＝2.4为宜）、抗体效价、抗体特异性。
6.荧光抗体的保存：小量分装，-20℃冻存可保存1～2年。
真空干燥后可长期保存。
稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。
（二）标本的制作临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。
制作标本要力求保持抗原的完整性、切片要求尽量薄、干扰物质要充分洗去、安全。
（三）荧光抗体染色与结果判断1.直接法用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。
荧光偏振法
荧光偏振法荧光偏振法是一种用于研究生物大分子结构与功能的非常有用的技术手段。
荧光偏振法是利用荧光分子的特性来进行研究，荧光偏振法可以用于研究分子间的相互作用、分子内部结构的确定以及蛋白质的折叠状态等方面的问题。
以下是对荧光偏振法的详细介绍。
一、荧光偏振法的基本原理荧光偏振法是利用偏振光与荧光分子之间的相互作用来实现的。
荧光分子通常在能量激发后能够发出荧光，而荧光分子的发出方向与激发光的方向之间存在一定的关系。
因此，当将荧光分子暴露在偏振光的作用下时，在荧光发出时，会观察到特定的荧光偏振性质，这些性质可以用来研究分子结构、动力学和函数方面的问题。
荧光偏振法的基本原理可以通过极化法与偏振法来进行分析。
这些方法利用荧光分子的极化来探测荧光分子的偏振性质。
在极化法中，荧光分子处于热平衡状态下，因此，在具有不同极化方向的偏振光激发下，荧光分子发射的荧光强度也会发生变化。
在偏振法中，荧光分子产生的荧光偏振性质被用来研究分子的构象和方向性的问题。
二、荧光偏振法的优势荧光偏振法有很多的优势，包括以下几点：1. 荧光偏振法可以研究分子的结构和函数。
荧光偏振法可以通过测量荧光偏振性质来研究分子的结构和函数，这使得荧光偏振法成为了一个非常有用的技术手段。
2. 荧光偏振法具有高灵敏度和高分辨率。
荧光偏振法的灵敏度和分辨率都非常高，这使得荧光偏振法成为了一种非常重要的技术手段。
3. 荧光偏振法可以研究生物大分子的互作用。
荧光偏振法可以用来研究生物大分子的互作用，如蛋白质之间的相互作用、蛋白质-核酸相互作用等，这些研究对于研究生物大分子的结构和功能都非常重要。
三、荧光偏振法的应用荧光偏振法在生命科学研究中经常被使用。
荧光偏振法在蛋白质研究、膜研究、DNA/RNA研究、细胞动力学研究等方面都有广泛应用。
1. 荧光偏振法在蛋白质研究中的应用。
荧光偏振法可以用来研究蛋白质的结构和功能。
荧光标记的蛋白质可以用来研究其折叠状态、构象变化和互作用等方面的问题。
荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析具有高灵敏度、高特异性和低检测限等优点，能够实现快速、准确地定量检测目标 物质。此外，该技术还具有操作简便、样本用量少等优点，使得其在生物医学领域中具有广泛的应用 前景。
02
荧光偏振免疫分析技术
荧光物质与标记技术
荧光物质
荧光物质是一种能够在特定波长光激发下发出荧光的物质，常用于荧光偏振免疫 分析中的标记物。常见的荧光物质包括荧光素、量子点、荧光染料等。
数据处理
数据处理是对检测到的信号进行解析、计算和分析的过程。通过建立数学模型和算法，将荧光信号转化为待测物 质的浓度或活性。数据处理还包括对实验数据的统计、分析和可视化，以提供准确的实验结果和可靠的结论。
荧光偏振免疫分析的优缺点
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便、可 定量检测等。
缺点
对实验条件要求较高、仪器设备昂贵 、需要专业操作人员等。
通过病毒与细菌检测，有助于疾病的早期诊断、治疗监测和预防控制，对于公共卫生和疫情防控具有 重要意义。
其他医学应用
荧光偏振免疫分析在医学诊断中还有 许多其他应用，如药物浓度监测、自 身免疫性疾病的抗体检测、生物毒素 和毒素抗体的检测等。
通过这些应用，可为临床医生提供更 全面的诊断信息，有助于疾病的精准 治疗和患者管理。
100%
数据记录
记录荧光信号的变化，生成数据 曲线或表格。
80%
结果分析
根据数据曲线或表格，计算抗原 的浓度或活性，进行结果解读和 报告。
04
荧光偏振免疫分析在医学诊断中的应用
肿瘤标志物检测
肿瘤标志物是肿瘤细胞分泌或脱落到体液中的物质，可用于肿瘤 的早期发现、诊断、治疗监测和预后评估。荧光偏振免疫分析可 以检测体液中微量肿瘤标志物，为肿瘤的早期发现和治疗提供有 力支持。
荧光偏振分析方法
02
通过实时监测荧光标记信号分 子的偏振状态，可揭示信号传 导过程中的分子事件和调控机 制。
03
荧光偏振技术还可用于研究细 胞间信号传导和细胞通讯过程 ，为理解细胞行为和生理功能 提供新的视角。
04
荧光偏振在材料科
学中应用
高分子材料结构与性能关系研究
荧光偏振用于研究高分子 链构象
通过荧光偏振技术可以观察高分子链在不同 条件下的构象变化，进而理解其物理性质和 化学性质。
数据处理
对采集到的数据进行处理和分析， 包括数据清洗、归一化、统计分 析等步骤，以提取有用的信息并 得出结论。
结果展示
将处理后的数据以图表、图像等 形式展示出来，以便更直观地理 解和解释实验结果。
03
荧光偏振在生物医
学领域应用
药物筛选与评估
1
荧光偏振技术可用于高通量药物筛选，通过测量 荧光标记药物与靶标结合后的偏振变化，快速识 别潜在活性化合物。
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荧光偏振分析方法
目录
CONTENTS
• 荧光偏振原理及基本概念 • 荧光偏振实验技术与方法 • 荧光偏振在生物医学领域应用 • 荧光偏振在材料科学中应用 • 荧光偏振在环境监测领域应用 • 荧光偏振技术发展趋势与挑战
01
荧光偏振原理及基
本概念
荧光产生与发射过程
荧光物质吸收光能
荧光物质在受到特定波长的光照射时，会吸收光能并激发电子从 基态跃迁到激发态。
01
利用荧光偏振技术可以快速筛选具有特定功能的材料，如发光
材料、光电材料等。
荧光偏振用于功能材料性能优化
02
通过荧光偏振技术可以研究功能材料的性能与结构之间的关系，
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光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）
PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD 的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。
FL2探测器检测PE。
多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）
PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。
FL3探测器检测PerCP。
碘化丙啶（ propidium iodide，PI）
可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。
在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。
在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。
FL2探测器检测PI。
中间体异硫氰酸荧光素乙二胺（fluorescein t hiocarbamylethylenediamine，EDF）和异硫氰酸荧光素己二胺（fluoresceinthiocarbamyl hexylenediamine，HDF）合成：用甲醇配制1%的三乙胺溶液，分别将20mg（0.3 mmol）乙二胺和34.8 mg（0.3 mmol）己二胺溶于5 ml 甲醇三乙胺溶液中；再将11.7 mg（0.03mmol）FITC 溶于1 ml 甲醇三乙胺溶液中，逐滴加到乙二胺和己二胺溶液中，室温避光搅拌反应1 h，浓缩，硅胶柱层析（乙酸乙酯﹕甲醇＝3﹕1，v﹕v），得到粉末状的EDF 和HDF，电喷雾离子化质谱（ESI-MS）鉴定后，备用。
羧基四甲基罗丹明（ＴＡＭＲＡ）
5-氨基荧光素（AF）
近年来，菁染料逐渐受到人们的关注。
目前研究比较活跃的标记菁染料主要有两大类，一类
是噻唑橙（ｔｈｉａｚｏｌｅｏｒａｎｇｅ，ＴＯ）、唑橙（ｏｘａｚｏｌｅｏｒａｎｇｅ，ＹＯ）系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料［８］。
菁染料主要用于标记核酸，高志宇等［９］的研究表明，在喹啉环氮上引入适当的亲水性取代基，可以使ＴＯ类的菁染料用于蛋白质标记领域。
荧光素类标记试剂包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）、羟基荧光素（ＦＡＭ）、四氯荧光素（ＴＥＴ
罗丹类染料包括Ｒ１０１、四乙基罗丹明（ＲＢ２００）和羧基四甲基罗丹明（ＴＡＭＲＡ）。