荧光偏振分析方法
荧光偏振技术介绍
62原理：当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。
如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。
如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。
如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。
如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
如图2.图2 荧光偏振检测原理任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。
因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。
对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。
近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。
因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。
相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。
最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。
此外，荧光偏振所需的样品量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。
概述光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。
当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析（FPIA）的原理，并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。
【关键词】荧光偏振免疫分析应用从1852年，Stokes首次提出“荧光（fluorescence）”一词，人们对荧光现象的研究就不断深入，并发展出了荧光分析技术，荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。
随着相关理论和仪器的发展，荧光分析的手段和技术水平也不断发展，现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点，在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。
基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。
一、荧光偏振原理荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。
溶液中荧光分子受偏振光激发，如激发时分子保持静止，则发射的荧光仍有偏振性，且如分子分子旋转或翻转，发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。
虽然实际测量常得消偏振的荧光，但荧光偏振技术有着重要应用[1]。
荧光偏振光强度P定义为：P=（I⊥-I∥）/（I⊥+I∥）其中，I⊥和I∥表示荧光子被激发后，发射光在垂直和水平方向上的强度。
对于荧光偏振仪器，检测到的荧光强度：P=（Ivv-G×Ivh）/（Ivv+G×Ivh）式中，下标分别代表起偏器和检偏器方向，v为垂直方向，h为水平方向，G 为校正因子，G=Ihv/Ihh。
荧光偏振光强度P与测定体系中各因素的关系可用Perrin方程表示:（1/P-1/3）=1/P0+（1/P0+1/3）（RT/V）(τ/η)其中，P0为极限荧光偏振光强度，R为气体常数，T为绝对温度，V为摩尔分子体积，τ为荧光寿命，η为溶液的粘度。
由上式知当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。
偏振X射线荧光分析教程(重要)
精品课件
偏振X射线荧光技术的历史
1973/74 Young, Dzubay
研制出了EDXFR
1977 为起偏器
Ryon
首次采用多层B4C
1990 结构
Brumme
设计出偏振XRF的几何
1990 的分析
Beckhoff
HOPG晶体用于轻元素
1992/99 Spectro
首次推出ED（P）XRF商业化机型
素的波长，从而获得所测元素的特征信息。
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能量色散X射线荧光光谱仪
❖ 能量色散X射线荧光光谱仪则采用能量探测器，通过 测定由探测器收集到得电荷量，直接获得被测元素
发出的特征X射线的能量：
❖
Q=kE
❖ E为入射X射线的光子能量；Q为探测器产生的相应的电荷量； k为不同类型探测器的响应参数。电荷量与X射线能量成正比，
Bragg晶体聚焦型光学系统—高功率密度
•最小斑束 < 1mm •功率密度提高6-10倍 •有利于轻元素的分析
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ED(P)XRF的次级靶--多光源系统
光源二：Al2O3/B4C 有效地激发Ti到U
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BARKLA散射偏振激发的谱图（Al2O3）
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ED(P)XRF的次级靶--多光源系统
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偏振X射线荧光光谱仪的结构
精品课件
偏振X射线荧光光谱仪
❖ X射线与物质的散射作用可产生偏振X射线，当散射角为90° 时，可产生几乎完全偏振的X射线。
❖ 由X射线光管发射的未偏振X射线经与轻元素靶以90°发生散 射后，产生高度偏振的平面X射线。用这一偏振光照射样品， 样品中元素产生的X射线是各向异性的，而入射的平面偏振 光是不能沿其平面传播的，故当探测器与样品成90°，并且 与偏振器和X射线光管平面相交时，来自X射线光管的背景降 低。
偏振X射线荧光分析教程(重要)
电磁波波谱
1 pm
100 pm 10 nm 1 um 10 um 100 mm 100 m
Gamma Rays(伽玛) X-Rays Ultra Violet (紫外) Visible Light(可见) Infra Red(红外)
Micro Wave（微波）
Radio Wave（广播)
原子结构 (Shells)
计算机
Electronics
样品
计数器
固/液体
高压供给
脉冲放大/多道分析器
偏振X射线荧光能谱分析
人类认识偏振光
1906年
1906 1973/74 1977 1980/85 1986 1990 1992/96
英国物理学家 Charles Glover Barkla
首先阐述了偏振光及特性
偏振X射线荧光技术的历史
研制出了EDXFR
1973/74
Young, Dzubay
1977
Ryon
首次采用多层B4C为起偏器
1990
Brumme
设计出偏振XRF的几何结构
1990 1992/99
Beckhoff Spectro
HOPG晶体用于轻元素的分析 首次推出ED（P）XRF商业化机型
偏振X射线荧光光谱仪的结构
偏振X射线荧光光谱仪
Ac
Th
Pa
U Np Pu Am Cm Bk
Cf
Es Fm Md No
Lr
部分偏振单色靶激发的谱图（Mo）
incoh
coh
ED(P)XRF的次级靶--多光源系统
ED（P）XRF的优点二
多X光激发源
保证待测元素的最佳激发
偏振X射线荧光光谱仪的结构
荧光偏振法
荧光偏振法荧光偏振法是一种用于研究生物大分子结构与功能的非常有用的技术手段。
荧光偏振法是利用荧光分子的特性来进行研究，荧光偏振法可以用于研究分子间的相互作用、分子内部结构的确定以及蛋白质的折叠状态等方面的问题。
以下是对荧光偏振法的详细介绍。
一、荧光偏振法的基本原理荧光偏振法是利用偏振光与荧光分子之间的相互作用来实现的。
荧光分子通常在能量激发后能够发出荧光，而荧光分子的发出方向与激发光的方向之间存在一定的关系。
因此，当将荧光分子暴露在偏振光的作用下时，在荧光发出时，会观察到特定的荧光偏振性质，这些性质可以用来研究分子结构、动力学和函数方面的问题。
荧光偏振法的基本原理可以通过极化法与偏振法来进行分析。
这些方法利用荧光分子的极化来探测荧光分子的偏振性质。
在极化法中，荧光分子处于热平衡状态下，因此，在具有不同极化方向的偏振光激发下，荧光分子发射的荧光强度也会发生变化。
在偏振法中，荧光分子产生的荧光偏振性质被用来研究分子的构象和方向性的问题。
二、荧光偏振法的优势荧光偏振法有很多的优势，包括以下几点：1. 荧光偏振法可以研究分子的结构和函数。
荧光偏振法可以通过测量荧光偏振性质来研究分子的结构和函数，这使得荧光偏振法成为了一个非常有用的技术手段。
2. 荧光偏振法具有高灵敏度和高分辨率。
荧光偏振法的灵敏度和分辨率都非常高，这使得荧光偏振法成为了一种非常重要的技术手段。
3. 荧光偏振法可以研究生物大分子的互作用。
荧光偏振法可以用来研究生物大分子的互作用，如蛋白质之间的相互作用、蛋白质-核酸相互作用等，这些研究对于研究生物大分子的结构和功能都非常重要。
三、荧光偏振法的应用荧光偏振法在生命科学研究中经常被使用。
荧光偏振法在蛋白质研究、膜研究、DNA/RNA研究、细胞动力学研究等方面都有广泛应用。
1. 荧光偏振法在蛋白质研究中的应用。
荧光偏振法可以用来研究蛋白质的结构和功能。
荧光标记的蛋白质可以用来研究其折叠状态、构象变化和互作用等方面的问题。
荧光偏振度
荧光偏振度1. 什么是荧光偏振度？荧光偏振度是描述荧光分子在激发态和基态之间发生跃迁时所产生的偏振光的性质的一个参数。
它可以用来衡量荧光分子在不同方向上发射的光的强度差异，从而反映分子在激发态和基态之间跃迁的选择性。
2. 荧光偏振度的测量方法2.1 偏振荧光显微镜偏振荧光显微镜是一种常用的测量荧光偏振度的方法。
通过使用偏振片和分析片，可以选择性地过滤掉特定方向上的偏振光，从而实现对样品中发射出的荧光信号进行测量。
2.2 荧光极化法荧光极化法是另一种常用的测量荧光偏振度的方法。
它利用样品中荧光分子在激发态和基态之间跃迁时所产生的偏振性质。
通过测量样品中垂直和水平方向上的荧光信号强度，可以计算出荧光偏振度。
2.3 其他方法除了偏振荧光显微镜和荧光极化法，还有一些其他的方法可以用来测量荧光偏振度，如荧光共振能量转移、荧光寿命测量等。
这些方法在不同的实验条件下具有不同的优势和适用性。
3. 荧光偏振度的应用3.1 生物医学研究荧光偏振度在生物医学研究中有着广泛的应用。
它可以用来研究蛋白质的结构和功能，通过测量蛋白质中色氨酸和酪氨酸的荧光偏振度，可以获取它们在分子水平上的信息。
3.2 材料科学在材料科学领域，荧光偏振度也被广泛应用于材料表征和分析。
在液晶材料研究中，通过测量液晶分子中发射出的荧光信号的偏振性质，可以了解到液晶分子排列的方向和有序程度。
3.3 光电子学荧光偏振度在光电子学领域也有重要的应用。
在液晶显示技术中，荧光偏振度可以用来控制液晶分子的排列方向，从而实现液晶显示器的图像显示。
4. 荧光偏振度的影响因素荧光偏振度受到多种因素的影响，包括荧光分子的结构、环境条件以及测量方法等。
这些因素对荧光偏振度的影响需要进行详细的研究和分析。
5. 结论荧光偏振度是描述荧光分子在激发态和基态之间发生跃迁时所产生的偏振光性质的一个重要参数。
通过不同的测量方法和应用领域，我们可以深入了解荧光偏振度在生物医学研究、材料科学和光电子学等领域中的应用价值。
荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析具有高灵敏度、高特异性和低检测限等优点，能够实现快速、准确地定量检测目标 物质。此外，该技术还具有操作简便、样本用量少等优点，使得其在生物医学领域中具有广泛的应用 前景。
02
荧光偏振免疫分析技术
荧光物质与标记技术
荧光物质
荧光物质是一种能够在特定波长光激发下发出荧光的物质，常用于荧光偏振免疫 分析中的标记物。常见的荧光物质包括荧光素、量子点、荧光染料等。
数据处理
数据处理是对检测到的信号进行解析、计算和分析的过程。通过建立数学模型和算法，将荧光信号转化为待测物 质的浓度或活性。数据处理还包括对实验数据的统计、分析和可视化，以提供准确的实验结果和可靠的结论。
荧光偏振免疫分析的优缺点
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便、可 定量检测等。
缺点
对实验条件要求较高、仪器设备昂贵 、需要专业操作人员等。
通过病毒与细菌检测，有助于疾病的早期诊断、治疗监测和预防控制，对于公共卫生和疫情防控具有 重要意义。
其他医学应用
荧光偏振免疫分析在医学诊断中还有 许多其他应用，如药物浓度监测、自 身免疫性疾病的抗体检测、生物毒素 和毒素抗体的检测等。
通过这些应用，可为临床医生提供更 全面的诊断信息，有助于疾病的精准 治疗和患者管理。
100%
数据记录
记录荧光信号的变化，生成数据 曲线或表格。
80%
结果分析
根据数据曲线或表格，计算抗原 的浓度或活性，进行结果解读和 报告。
04
荧光偏振免疫分析在医学诊断中的应用
肿瘤标志物检测
肿瘤标志物是肿瘤细胞分泌或脱落到体液中的物质，可用于肿瘤 的早期发现、诊断、治疗监测和预后评估。荧光偏振免疫分析可 以检测体液中微量肿瘤标志物，为肿瘤的早期发现和治疗提供有 力支持。
荧光偏振免疫分析
仪器功能特点
双向选择能力--为将来扩充为LAS系统提供平台
读条码能力--避免人为误放,可随意放置样品和试剂
自动稀释功能--可成批,任意和单独选择,扩展可检出范围 自动转测功能--为临床诊断提供更多依据,并减少病人负
担
自动重测功能--避免错误结果
触摸式屏幕--提供更方便的操作模式
含有36个位置。 一旦MEIA分样步骤完成,样品被放入纤维杯，在纤维 杯转盘进行清洗，加入底物，读数，所有的MEIA分 析在此进行，此转盘含有32个位置 分析结束后反应杯和纤维杯被自动扔入固体废物箱
供应中心
废液和 废物 1号液
4号液
2号液 3号液
供应中心
库存的管理 上机的大瓶试剂为通用试剂,例如:MUP,离子液,MEIA
储存标准曲线数量--4条不同批号,前后交接,避免浪费
试剂前处理步骤--无,节省劳力,避免误差 质控--每日监控, L-J质控图可全面监控系统和试剂状
态
其它特性
清洗模式--按项目的不同选择不同的冲洗模式以达到
最佳冲洗效果
清洗方式--磷酸缓冲液清洗内部结构设计为最大剪切
力的探针清洗,特殊清洗站设计使探针内外壁清洗
携带率表现--6×106 IU/L β -HCG交叉测定于阴性标
本时携带率＜1μ IU/L,2g/L 重组HBsAg交叉测定于阴 性标本时携带率＜0.1μ g/L
每日维护保养时间—3分钟仪器自动完成
试剂特点
稳定性:
标准曲线稳定时间--同一批号的试剂
试剂开启后稳定时间--2~8℃尽效期 试剂可否长期上机--可以,且无冰箱 试剂有效期--一般至少6个月,最长可达1年 精密度--按NCCLS的EP5-T2标准小于5%CV 灵敏度--极佳的灵敏度,HBsAg可测0.17ng/ml,
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荧光偏振分析方法
偏振荧光光谱是最常见的一种分析方法。
它是通过测量样品在不同偏振光激发下的荧光发射光谱来获得样品的偏振特性。
实验中，可以使用偏振片对入射光进行偏振，然后收集样品的荧光发射光，再通过偏振分析系统分析荧光光的偏振状态。
通过比较不同偏振光下的荧光发射强度和偏振度，可以得到样品的荧光偏振特性，并进一步推断样品的结构和性质。
荧光偏振成像是一种非常重要且有潜力的分析方法。
它可以提供样品内部的空间分辨荧光偏振特性信息。
在实验中，可以使用荧光显微镜和偏振成像系统对样品进行观察和分析。
通过在不同偏振方向下收集样品的荧光图像，可以获得样品的荧光偏振信息，并进一步研究样品的分子排列和组装状态。
荧光偏振分析方法在生物科学、材料科学和化学等领域具有广泛的应用。
在生物科学中，荧光偏振分析可以用于研究生物大分子（如蛋白质和核酸）的折叠和结构变化。
在材料科学中，它可以用来研究液晶材料和光电材料的结构和性质。
在化学中，它可以用来研究化学反应的动力学和机理。
尽管荧光偏振分析方法具有重要的研究价值，但在实际应用中仍面临一些挑战。
一方面，荧光偏振分析需要高度精密的仪器设备和复杂的数据处理方法，对实验条件和样品质量都有一定的要求。
另一方面，荧光偏振分析只能提供间接的结构和性质信息，需要通过与其他实验方法（如核磁共振和X射线衍射）相结合使用，以得到更全面和准确的结果。
综上所述，荧光偏振分析方法是一种重要的研究工具，可以提供样品的结构和性质信息。
它在生物科学、材料科学和化学等领域有广泛的应用
前景。
虽然面临一些挑战，但随着技术的不断发展，荧光偏振分析方法将在科学研究和应用中发挥越来越重要的作用。