SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物实验十三质粒DNA的提取与鉴定一实验目的1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。
2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。
3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。
二实验原理质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。
然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。
离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。
（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。
一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。
（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
三药品器材一器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
质粒DNA的抽提与纯化（附注问题非常详细）
质粒DNA的抽提与纯化（附注问题非常详细）第一篇：质粒DNA的抽提与纯化 (附注问题非常详细)质粒DNA的抽提与纯化(附注问题非常详细)目的：采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
仪器与主要试剂仪器（见附录）：主要试剂：溶液I：50 mmol/L 葡萄糖10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克/毫升溶菌酶溶液II：200 mmol/L NaOH 1% SDS 溶液III：3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTA实验方法：1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB 液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟7．12000rpm离心15分钟8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。
SDS碱裂解法制备质粒DNA
SDS碱裂解法制备质粒DNA步骤（1）挑取转化后的单菌落，接种到2ml的含有适当抗生素的丰富培养基中，37℃振摇培养过夜（培养物的体积小于溶液体积的1/4，否则容器不易盖紧，剧烈振摇培养）（2）收菌，将菌液倒入离心管中，4℃，12500r/min，3min。
（离心后将上清液倒入费废液缸中，倒扣在吸水纸上，若还有液体残留，用移液枪吸出）（3）将细菌沉淀重悬于100μl的预冷的碱性裂解液I（Glu, EDTA, Tris-Hcl）中，涡旋振荡。
（4）加200μl新配置的碱性裂解液II(0.2M NaOH,1%SDS)于每管细菌重悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混合内容物，切勿振荡，将离心管放置在冰上3-5min. （5）加150μl预冷的碱性裂解液III（CH3COOH,CH3COONa），盖紧管口，反复颠倒数次，使得溶液在粘稠度额细菌裂解物中分散均匀。
冰上防止3-5min。
（6）离心（4℃，12000r/min，6min），并将上清转移到另一个离心管中。
（7）在通风橱内加400μl的氯仿：异戊醇（24:1）（8）抽提：将管放在漂浮板上，划8字8min，后离心（4℃，12000r/min,7min），吸取上清液300μl到另一个离心管中。
（9）加无水乙醇600μl，混匀放置在-20℃沉淀15min，后离心（4℃，12000r/min,15min）（10）小心吸去上清液，将离心管倒置在吸水纸上，加70%乙醇700μl洗涤沉淀，弹起沉淀，浸泡一会，离心（4℃，12000r/min,4min），洗涤两次。
（11）倒掉上清，甩一下，吸去上清，晾干。
（12）TRE溶解（1mlTE，1μlRNA酶）20μl/管。
（13）65℃15min，后4℃冰箱保存。
碱裂解法大量提取质粒DNA
碱裂解法大量提取质粒DNA（同时纯化）准备工作：细菌培养：小量提取质粒DNA鉴定正确后，将菌液以1/50~1/20体积的比例接种到250ml 液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长晚期。
注：培养体积与最终质粒DNA的收获量并无线性关系。
只要培养条件适宜，50ml的培养液有时也可得到总量高达1m g以上的质粒。
操作步骤：1、细菌的收获：将菌液倒入合适的离心管中，8000g离心5分钟，弃上清，并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。
2、将细菌沉淀重悬于10ml溶液Ｉ中。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)注：（1）若溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ配制时间过久，可加入少量溶菌酶；（2）由于沉淀的影响，悬液的体积会达到11~13ml。
3、加15ml溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1%SDS4、加12ml溶液Ⅲ，轻微振荡混匀。
溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml5、12000g离心5分种，弃沉淀。
将上清转移到另一离心管中。
6、加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。
12000g离心５分钟，弃上清。
7、沉淀溶解于4~6ml TE中，加入1/50体积RNase A贮存液，颠倒混匀，37℃静置10分钟。
8、加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈振荡混匀。
9、4℃12000g离心30秒，将上层液体与少量下层液体转移到另一离心管后，再12000g离心5分种，小心吸取上层液体。
10、加入等体积13％聚乙二醇(PEG8000)-1.6mol/L NaCl混合液，颠倒混匀，冰上静置0.5~2小时。
11、4℃12000g离心10分种，弃上清，DNA沉淀用70%乙醇洗涤。
12、沉淀干燥后，溶解于适量高压灭菌的水中。
注：（1）溶解体积一般为0.2~1ml；（2）此时得到的是已经纯化的质粒DNA，可直接进行各种酶学操作。
质粒的提取和纯化
【器材】
微量移液取样器，枪头，PCR管， Spin Column CM， Collection Tube，离心机
【试剂】
Buffer P1, Buffer P2, Buffer N3, Buffer PS, Buffer PB, Buffer PW, Buffer EB, RNase A, 无 水乙醇。
【操作步骤】
⒋ 向离心管中加入350μl Buffer N3，立即上下颠倒
混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5
分钟。 12,000rpm离心10分钟。 ⒌ 向已装入收集管的吸附柱中加入200μl Buffer PS， 12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。 ⒍ 将步骤4所得的上清液转移到吸附柱中， 12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。
实验：
质粒的提取和纯化
【目的】
了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小 量制备方法。
【原理】
本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十 二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它 既能使细菌细胞裂，又能使一些蛋白质变性。 用 SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质 粒DNA 和染色体DNA。 两种DNA 在强碱环境都会变 性。当加入pH=4.8的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值后， 质粒DNA 将迅速复性，而染色体DNA 分子巨大，难 以复性。通过离心，大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质沉淀（SDS 的作用下）除去，而质粒 DNA 留在上清中。再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可 得到纯化的质粒 DNA。
【操作步骤】
⒎向吸附柱中加入500 μl Buffer PB ， 12,000rpm
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒dna的碱法大量制备,实验报告
质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。
）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。
保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。
）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。
注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。
b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。
3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。
注：最后菌液的OD600值应为0.4。
由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。
4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。
注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。
碱裂解法大量制备质粒DNA
碱裂解法大量制备质粒DNA所需试剂：溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌15min，贮存于4℃。
溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释) 1％SDS 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。
于室温放置5-10分钟。
当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。
为防止NaOH接触空气中的CO2使溶液发生反应，所以要现用现配。
溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml 冰乙酸11.5ml 水28.5ml。
所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
RNA酶：将RNA酶粉剂100mg溶于10mMTris-CI(pH:7.5)，15mMNaCI中，定容至10ml，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
实验步骤：（1）将大肠杆菌菌株涂抹于含50μl/ml卡那霉素的LA平板上，37℃条件下培养过夜。
（2）取一单菌落于3ml液体LB培养基(含50ug/ml卡那霉素)，37℃，220rpm/min培养过夜。
（3）从过夜培养液中取lml加入到1000ml的液体LB培养基(含50ug/ml卡那霉素)中，37℃，220rpm/min，培养约8个小时。
（4）将菌液分装到50ml离心管中，10000rmin/min 离心30s,收集培养物中的菌体, 尽量弃尽上清, 重复此操作2-3次，收集一定菌液；（5）加入10ml溶液Ｉ（含1％RNA酶），在涡旋器上使菌体充分重悬; 或用微量移液器混匀；（6）加入10ml 溶液Ⅱ，立即将离心管缓慢颠倒数3- 5 次直到溶液变澄清，冰浴2min；（7）加入10ml溶液Ⅲ,缓慢颠倒离心管3- 5 次直至白色絮状物充分形成, 冰浴2min;（8）12000rpm/min 离心10min后将上清转入另一管中,分装成两管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），在室温下4000 rpm/min离心10min。
质粒DNA提取(碱变性法)_百替生物
第 1 次课 6 学时注：本页为每次课教案首页实验四、质粒DNA提取（碱变性法）一质粒1 质粒（plasmid）：是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
2 质粒与宿主细胞的关系（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。
（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。
（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿。
（4）质粒赋于宿主各种有利的表型，使宿主获得生存优势。
3 质粒提取实验在生物化学与分子生物学中具有非同寻常的意义。
是基因工程中常用的载体之一。
转基因的时候不会转移直接的外源基因，需要把外源基因连接到载体上进行转化。
载体的存在就像一个运输工具一样，把目的基因转到受体生物中。
任何的目的基因的克隆，外源基因的转入，载体的构建都绝对的离不开质粒的提取过程。
4 常用的载体质粒：是通过DNA重组技术构建而成的。
pUC18, pUC19,T-EASY等。
二提取三碱变性碱变性法主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。
染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。
质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。
由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。
四、实验步骤与方法1 接含PUC18质粒的单菌落于3ml Amp+LB液体培养基中LB液体培养基：分别称取10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、5g NaCL于1L 烧瓶中，950mlddH2O，5MNaOH调pH到7.0，补充至ddH2O1L，高压灭菌。
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SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化
[适用对象] 生物工程专业
[实验学时] 8学时
一、实验目的
使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。
二、实验原理
质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。
它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在基因工程中是最常用的载体。
提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。
提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、仪器设备
培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。
四、相关知识点
本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。
多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。
五、实验步骤
细胞培养
接种培养
挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
离心
取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
细胞的裂解
悬浮细菌沉淀
将细菌沉淀重悬于100μl预冷的碱裂解溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
（为确保细菌沉淀在碱裂解溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底互相接触同时涡旋振荡，可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率。
）裂解细菌悬液
加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
沉淀染色体和蛋白质
加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。
溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋
白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
沉淀多余的蛋白质
加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。
小心移出上清于一新微量离心管中。
质粒DNA的回收
沉淀核酸
加入 2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。
洗涤沉淀
1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
溶解质粒DNA
沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA 分子，-20℃保存备用。
质粒DNA电泳检测
制胶
用封边封住塑料托盘开放的两边，形成一个模具，置于一个水平支架上。
加上梳子。
称取琼脂糖0.5g，加0.5×TBE的电泳缓冲液100ml，用微波炉加热至琼脂糖熔化，待熔化的凝胶稍冷后加入溴化乙锭，使终浓度为0.5μg/ml。
混匀凝胶。
将凝胶浇灌到模具中。
室温下30－40min。
上样电泳
向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。
混合DNA样品和0.2倍体积6×载样缓冲液，用微量移液器将其移至加样孔内。
关上电泳槽盖，接好电极进行电泳。
紫外灯下观察电泳结果，记录。
六、实验报告要求
1、写明报告日期、地点、条件。
2、实验报告的目的和要求。
3、实验过程。
4、描绘实验结果。
5、分析结果并讨论。
6、回答思考题。
七、思考题
溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ中的主要试剂是什么？在质粒提取过程中分别起到了什么作用？
八、实验成绩评定办法
主要评分点：原理描述（10%）、实验流程（20％）、调试过程（10％）、数据记录（10％）、解决问题的能力（20％）、资料搜集（10％）、实验结果（10％）、实验效果（10％）等。