基因工程实验(答案)教学教材

基因工程实验（答案）

――凯1. 简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结）答：①基因组DNA的提取；②PCR T增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCF T 增的DNA片段以及DNA勺体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。

2. 如何正确使用微量移液器？（自己写的）

答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪

头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液

体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。

3. 在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？

答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。

溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以

免浮出。

4. 简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义）

答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1 X TBE溶液于瓶中，微波炉加热

至琼脂溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，

待琼脂降温至55E下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1X TBE溶液导入洗

净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；

⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开

始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。

5. 琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75）

答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；

⑥嵌入染料的存在与否；

6. 在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31）

答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。

7. 在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？

答：酚一一是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿一一除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇一一降低表面张力，从而减少气泡的产生。

8. 提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA ?

答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1〜0.25mol/L的NaCI

9. 简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。

答：SDS――破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA――整合金属离子，抑制DNase 活性；酚/氯仿/异戊醇一一见第7题；无水乙醇一一沉淀DNA ；70%乙醇一一洗涤DNA沉淀。

10简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+ , dNTP，引物，DNA , 缓冲液，Taq DNA聚合酶）。

答:⑴利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，经高温变性，低温退火，适温延伸三个步骤合成特异DNA片

段。

（2）Mg2+: TaqDNA聚合酶的活性需要；dNTP：作为底物；引物：作为延伸的出发点；DNA :模板；缓冲液：维持反应环境的PH值；TaqDNA聚合酶：催化DNA的合成。

11.PCR循环次数是否越多越好，为什么？

答：否。因为PCR产物的积累存在平台效应。

12•降低退火温度，延长变性时间对PCR结果有什么影响？

答：前者会使非特异性产物增多；后者会导致酶的活性降低。

13.如果检测的PCR结果中出现很多非特异性条带，可能有哪些原因导致？

答：①引物特异性不强；②Mg2浓度过高；③引物二聚体形成；④退火温度过低；

⑤循环次数过多。

14简述DNA片段回收纯化的原理。（？）

答：各DNA片段的大小不同，则经琼脂糖凝胶电泳后得到了分离，收集含有DNA 的凝胶部位通过溶解凝胶、使DNA与硅胶柱结合、再通过洗涤杂质、最后DNA洗脱，通过新的EP管收集等，最终得到纯化的目的。

15.为什么DNA体外连接反应反应要设在16°C?

答：因为此温度下能最大限度的发挥连接酶的活性，同时有助于维持短暂配对结构

的稳定。

16简述TA克隆试剂盒进行体外连接的原理。（实验书P149）

答：经DNA聚合酶得到的PCR产物一一双链DNA片段的末端具有一个突出

A”碱基，而T载体每条链的3'端带有一个突出“T”碱基，则其两端可以与PCR 产物的两端进行正确的T--A配对，再在连接酶的催化下，即可将目的片段连接到载体上，形成重组载体。

17. 简述氯化钙制备感受态细胞的原理。（实验书P153）

答：经低温预处理的低渗CaCI2溶液处理受体细胞后，则可使细胞的通透性增大，从而极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物。

18. 重组质粒的转化方法有哪些？

答：CaCI2法，电击法，农杆菌转染法；花粉管通道法，基因枪法等。

19•当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有Amp的LB培养基平板前，为

什么要在LB培养基一上培养1h？

答：使感受态细胞复苏，同时让重组质粒在感受态细胞中适应并富集，以便于

表达产物，使受体细胞具抗性能力。

20. 什么情况下转化平板上会出现卫星菌落，为什么会出现卫星菌落？答：涂布后的培养基培养时间过长。

因为载体上的抗性基因的表达产物由于培养时间过长而得到积累，使加入的抗生素失效，从而让不含质粒的空菌落的一大量生长，故出现卫星菌落。

21. 碱裂解细胞抽提质粒的基本原理是什么？

答：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解后，DNA和蛋白都发生变性。当加入中和液后，由于构象上的区别，质粒DNA能较快的复性呈溶解状态，离心时留在上清液中，而染色体DNA不能复性，从而形成缠绕的网状结构并与蛋白凝聚，因离心沉淀。

22. 电泳检测提取的质粒是会看到三条带，这三条带分别代表了什么？

答：最前端为超螺旋，中间为开环DNA，最后为复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。

23质粒抽提中溶液I、U、川的作用是什么？

答：溶液I ――使沉淀重新悬浮；溶液II ――让染色体DNA ffi质粒DNA变性；溶液川一一中和碱，使质粒DNA M性。

24. 什么是限制性内切酶的星号活性？

答：在某些条件下，一种特异性识别序列的限制酶在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性。

25. 细菌产生的限制性内切酶，为什么不对自己的DNA进行切割？

答：因为细菌能通过甲基化酶的甲基化作用保护自身的DNA不被相应的限制酶