基因工程实验方案
《基因工程》实验教学教案
《基因工程》实验教学教案一、实验教学目标1. 让学生了解基因工程的基本概念、原理和操作步骤。
2. 培养学生运用基因工程技术解决实际问题的能力。
3. 帮助学生掌握基因克隆、基因编辑等实验技能。
二、实验教学内容1. 基因克隆实验：让学生通过PCR扩增目的基因，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2. 基因编辑实验：让学生利用CRISPR/Cas9系统对目标基因进行编辑，并通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证编辑效果。
3. 基因表达实验：让学生将目的基因插入到表达载体中，转化大肠杆菌，并通过IPTG诱导表达。
4. 抗原-抗体反应实验：让学生利用基因工程方法制备重组抗原，并进行抗原-抗体特异性反应检测。
5. 基因工程应用实例：让学生了解基因工程在生物制药、农业、环保等领域的应用。
三、实验教学方法1. 讲授法：讲解基因工程的基本原理、操作步骤和实验技巧。
2. 演示法：演示基因克隆、基因编辑等实验操作，让学生直观地了解实验过程。
3. 实践操作：让学生动手进行实验，培养实验操作能力和团队协作精神。
4. 讨论法：引导学生针对实验结果进行分析和讨论，提高解决问题的能力。
四、实验教学准备1. 教材和参考资料：准备《基因工程》等相关教材和参考资料，为学生提供理论支持。
2. 实验器材：准备PCR仪器、琼脂糖凝胶电泳设备、表达载体、大肠杆菌等实验所需的器材和试剂。
3. 实验指导：制定详细的实验步骤和操作指南，方便学生查阅。
五、实验教学评价1. 过程评价：评价学生在实验操作过程中的规范性和团队协作精神。
3. 应用评价：评价学生运用基因工程知识解决实际问题的能力。
4. 学生互评：鼓励学生互相评价，提高自我认知和沟通能力。
六、实验教学流程1. 实验前准备：讲解实验原理、目的和操作步骤，检查实验器材和试剂。
2. 实验操作：按照实验指导进行基因克隆、基因编辑等实验操作。
3. 实验结果分析：对实验结果进行分析和讨论，解释实验现象。
5. 实验总结：总结实验收获和不足，提出改进措施。
如何设计有效的基因工程实验方案
如何设计有效的基因工程实验方案设计有效的基因工程实验方案在生物技术领域起着关键作用。
本文将从选择合适的研究目标、确定实验所需材料和方法，以及数据分析与解释等方面介绍如何设计有效的基因工程实验方案。
首先，选择合适的研究目标是设计有效实验方案的首要任务。
研究目标应该具有一定的科学意义和实用价值，同时，应确保该目标在现有技术条件下可以实现。
确定一个明确而具体的研究问题，有助于确定设计实验所需的基因工程工具和方法。
其次，确定实验所需材料和方法是进行有效实验的关键步骤。
基因工程实验所需的材料主要包括目标基因、载体、宿主细胞和筛选标记。
目标基因应具有和研究目标相关的功能，载体应具有合适的复制起源和选择性标记，宿主细胞应具有高效的转化效率和适合的生长条件。
在选择筛选标记时，需要考虑与目标基因不相互干扰且能够可靠辨识的特性。
在方法选择方面，常用的基因工程技术包括PCR扩增、限制性核酸内切酶消化、DNA连接、电转化和化学转化等。
根据实验目标和条件，选择合适的方法对于实验的成功与否至关重要。
在进行基因编辑方面，CRISPR-Cas9系统已成为最常用的方法之一。
然而，不同的技术会存在一些优缺点，设计实验方案时需评估并选择合适的技术组合。
另外，在进行实验之前，需要充分了解实验步骤和操作要求。
实验步骤应尽可能详细，以保证实验的再现性和可靠性。
同时，确保实验操作符合生物安全规范，减少实验风险和致误的可能性。
实验方案的设计也需要考虑数据分析与解释。
有效的数据分析可以为研究结果提供科学依据，并帮助解释实验结果。
在设计实验方案时，应考虑如何收集、处理和分析实验数据。
例如，基因表达水平的分析可以通过定量PCR、Western Blot和荧光素酶报告基因等方法进行。
正确选择合适的实验设计和数据分析方法，将有助于得出可靠且有解释力的研究结论。
最后，实验方案的设计也需要考虑时间和资源的限制。
在实验设计过程中，必须合理规划每个实验步骤的时间，并评估所需材料和设备的成本与可获得性。
基因工程复原实验报告
基因工程复原实验报告实验目的：本实验旨在通过基因工程技术复原目标基因的DNA序列，并验证复原的DNA序列是否与目标基因的DNA序列一致。
实验原理：基因工程是一项利用生物技术对基因进行修饰、编辑或复原的技术。
在本实验中，我们使用了PCR技术进行目标基因的复原。
PCR（聚合酶链反应）是一种通过DNA聚合酶酶活性实现的体外DNA复制技术。
PCR技术的步骤包括DNA变性、引物结合和扩增。
首先，将包含目标基因的DNA样品变性，使双链DNA解链成两条单链DNA。
然后，设计两对引物，其中一对称为前向引物，另一对称为反向引物。
这两对引物分别与目标基因的两个末端互补，并在PCR反应中起到定位作用。
引物结合步骤是将引物与单链DNA互补配对，形成DNA引物-模板复合物。
接下来，通过加入DNA聚合酶和适当的反应缓冲液，将复合物暴露于适宜的温度下，使DNA聚合酶在引物模板复合物的作用下开始合成新的DNA链。
这个过程是以引物为模板，由DNA聚合酶从3'端向5'方向合成DNA链，产生两条互补的新DNA链。
这个循环被多次重复进行，每次循环会使目标DNA 的数量扩增一倍。
最后，通过凝胶电泳分析PCR产物。
在凝胶电泳实验中，DNA片段会根据其大小在电场作用下向正电极方向迁移，用染料染色后可以可视化分析。
实验步骤：1. 准备实验所需试剂和仪器。
2. 提取目标基因的源DNA样本。
3. 设计并合成适合的引物。
4. 设置PCR反应条件，并进行PCR反应。
根据目标基因的大小和要扩增的目标数量合理调整PCR反应体系中的模板DNA、引物和酶的浓度。
5. 将PCR产物进行凝胶电泳分析。
将电泳所需试剂配置好，将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后观察结果。
6. 提取目标基因的PCR产物。
7. 进行目标基因PCR产物的测序分析，验证复原的DNA序列是否与目标基因的DNA序列一致。
实验结果与讨论：根据电泳分析结果和测序分析的数据，我们可以判断复原实验是否成功，并验证目标基因的DNA序列是否与目标基因的DNA序列一致。
基因工程课程安排方案
基因工程课程安排方案一、课程目标和教学内容1. 课程目标通过基因工程课程的学习，学生将能够了解基因工程的基本原理和技术方法，掌握基因工程的实验操作技能，培养学生的创新意识和实践能力，为学生今后从事生物科学领域的研究和工作打下坚实的基础。
2. 教学内容（1）基因工程的基本原理和概念（2）基因克隆技术（3）质粒DNA的构建和表达（4）基因敲除和基因编辑技术（5）转基因生物的制备和鉴定（6）基因工程在医学、农业、环境保护等领域的应用（7）基因工程伦理与安全问题二、课程设置和教学方法1. 课程设置本课程拟设置为专业课，主要面向生物学、生物技术等相关专业的本科生。
课程学时为32学时，一般安排在第五至七学期的选修课程中。
2. 教学方法本课程将采用理论教学与实验教学相结合的方式进行教学。
理论教学主要通过课堂讲授、教材阅读等方式进行。
实验教学主要以实验操作演示和实践操作为主，让学生亲自动手操作，加深对基因工程理论的理解。
三、课程要求与评价方式1. 课程要求（1）学生要具备一定的生物学和生物化学知识，能够理解基因工程技术的原理和方法。
（2）学生要具备一定的实验操作技能，能够独立进行基因工程实验操作。
（3）学生要具备一定的创新意识和实践能力，能够灵活运用基因工程技术解决生物科学领域的问题。
2. 评价方式课程的评价主要包括平时表现、实验报告、课程论文和期末考试等方面。
平时表现主要包括出勤情况、参与课堂讨论、课外阅读等。
实验报告和课程论文主要评价学生的实验操作能力和科研能力。
期末考试主要考核学生对于基因工程理论知识的掌握情况。
四、教学资源和保障措施1. 教学资源（1）教师力量：课程将由具有丰富基因工程研究经验的专业教师担任授课和指导实验操作。
（2）实验设备：学校将提供基因工程实验室和必要的实验设备和试剂。
（3）教材资料：选取一系列国内外权威教材和最新研究成果作为教学参考资料。
2. 保障措施学校将加强对基因工程课程的教学管理与监督，确保教学质量和实验安全。
分子生物学与基因工程的实验探究
基因表达的检测方法
抗原抗体反应：利用特异性抗 体检测目标基因的表达产物
分子杂交技术：利用标记的核 酸探针与基因组或细胞内的核 酸进行杂交，检测基因的表达
基因芯片技术：将大量基因探 针集成在芯片上，通过与样品 进行杂交检测基因的表达
实时荧光定量PCR：通过荧光 标记的探针在PCR反应中实ห้องสมุดไป่ตู้ 监测目标基因的表达量
基因沉默：通过抑制特定基因 的表达，研究其在生物学过程 中的作用和功能
06 基因工程的应用
基因工程在农业上的应用
抗虫抗病：通过基因工程技术培育出具有抗虫抗病能力的作物，提高农作物的产量和品 质。
转基因作物：将外源基因导入植物细胞，实现作物的遗传改良和育种创新。
生物固氮：通过基因工程技术改变植物的固氮能力，提高土壤肥力和减少化肥使用。
的方法。
添加标题
实验原理是进行 分子生物学与基 因工程实验的基 础，对于深入了 解生物体的生命 活动和遗传规律 具有重要意义。
添加标题
实验材料
核酸提取试剂盒
T4 DNA连接酶
限制性内切酶
聚合酶链式反应（PCR）仪和 相关试剂
实验步骤
实验准备：确定实验目的、选 择实验材料和设备、设计实验 方案
实验操作：按照实验方案进行 实验，记录实验数据和结果
数据分析：对实验数据进行处 理、分析和解释，得出结论
结果汇报：撰写实验报告，向 指导老师汇报实验结果和结论
实验结果
基因克隆：成功获 得目的基因的 DNA片段
表达载体构建：将 目的基因插入表达 载体中
转化宿主细胞：将 表达载体导入宿主 细胞中
目的基因表达：宿 主细胞中目的基因 成功表达
03 基因克隆与表达
基因工程教案
基因工程教案一、教学目标通过本节课的学习，学生应该能够：1. 理解基因工程的概念和基本原理；2. 掌握常见的基因工程技术方法；3. 了解基因工程在生物医学、农业和环境保护等领域的应用；4. 培养学生的科学研究能力和创新意识。
二、教学重点1. 基因工程的基本概念和原理；2. 常见的基因工程技术方法；3. 基因工程在不同领域的应用。
三、教学内容- 导入通过引入一个生物医学领域的实际案例或图像，激发学生对基因工程的兴趣，并引发思考。
- 基因工程的概念和原理1. 概念解释：基因工程是指通过改变生物体的遗传物质，使其具有新的性状或功能的一项技术；2. 基本原理：基因工程通过分离、修饰和重组DNA，将特定基因导入到目标生物体中，从而改变其遗传性状；3. DNA的结构和功能：简要回顾DNA的结构，介绍其携带遗传信息和编码蛋白质等功能。
- 基因工程技术方法1. DNA的分离与扩增：介绍聚合酶链式反应（PCR）技术和其在基因工程中的应用；2. 基因的克隆：介绍构建基因文库、DNA序列比对等方法；3. 重组DNA技术：介绍限制性内切酶和DNA连接酶的作用，以及重组DNA的构建方法；4. 基因转导技术：简要介绍转化、转染和病毒载体等基因转导方法。
- 基因工程的应用1. 生物医学应用：介绍基因治疗、基因诊断和药物生产等在医学领域的应用；2. 农业应用：介绍转基因作物的育种和抗病虫害能力等农业应用；3. 环境应用：介绍基因工程在清洁能源生产、生态修复和环境监测等方面的应用。
- 综合案例分析通过一个综合案例分析的形式，让学生综合运用所学知识，提出自己的想法和解决方案。
四、教学方法1. 探究式教学：引导学生通过实际案例分析和讨论，主动探索基因工程的概念和原理；2. 合作学习：组织学生进行小组讨论，共同解决综合案例分析中的问题；3. 多媒体辅助教学：使用多媒体课件、实验视频等辅助教学资料，增强学生的学习兴趣和理解能力。
五、教学评价1. 学生小组讨论的表现，包括对基因工程概念和技术方法的理解和应用能力；2. 综合案例分析的问题解决能力和创新思维；3. 课堂参与度，包括提问和回答问题的积极性。
基因工程菌设计方案
基因工程菌设计方案一、研究背景基因工程菌是指利用基因工程技术对微生物中的基因进行修改和调整，以实现特定功能或生产特定产物的微生物。
基因工程菌的应用范围非常广泛，可以用于生物药物的生产、生物能源的开发、环境修复等多个领域。
在生物药物领域，基因工程菌可以用于大规模生产蛋白质药物，如胰岛素、人类生长激素等。
在生物能源领域，基因工程菌可以用于合成生物柴油、生物乙醇等可再生能源。
在环境修复领域，基因工程菌可以用于处理污水中的有害物质，修复受污染的土壤等。
随着生物技术的不断发展，基因工程菌的应用前景越来越广阔。
因此，设计基因工程菌的研究显得尤为重要。
下面将以基因工程菌在生物能源领域的应用为例，介绍基因工程菌设计方案的具体步骤。
二、研究目的本研究旨在设计一种能够高效合成生物柴油的基因工程菌，通过调整其代谢通路，促进生物柴油合成酶的表达，从而实现高效生产生物柴油的目的。
三、实验步骤1. 选择合适的宿主菌在设计基因工程菌之前，首先需要选择一个适合的宿主菌。
宿主菌的选择需要考虑其生长速度、代谢特点、操作方便性等因素。
目前常用的宿主菌包括大肠杆菌、酿酒酵母、拟杆菌等。
在生物柴油合成方面，大肠杆菌是一种常用的宿主菌，具有快速生长、易操作等优点。
2. 确定目标基因生物柴油的合成需要多个酶参与，因此首先需要确定参与生物柴油合成的目标基因。
常用的目标基因包括脂肪酸合成酶、脂肪酸酶、脂酰辅酶A合成酶等。
3. 构建表达载体在确定目标基因后，需要将这些基因导入到宿主菌中进行表达。
为此，需要构建一个合适的表达载体。
表达载体的构建包括选择适当的启动子、选择合适的表达基因等。
同时，还需要考虑构建选择标记的载体，以便筛选转化成功的菌株。
4. 转化宿主菌构建好表达载体后，需要将其导入到宿主菌中进行转化。
转化可采用化学转化、电穿孔转化、电渗转化等方法。
在转化后，通过筛选标记来筛选出转化成功的菌株。
5. 验证目标基因表达转化成功的菌株中，目标基因是否能够成功表达是一个关键问题。
生物基因工程实验课
生物基因工程实验课一、课程目标知识目标：1. 让学生理解基因工程的基本概念、原理及操作流程。
2. 掌握基因克隆、基因表达和基因编辑等核心技术。
3. 了解基因工程在生物科学研究和实际应用中的重要性。
技能目标：1. 学会使用基因工程实验相关仪器设备及实验操作技巧。
2. 能够独立设计简单的基因工程实验方案，并进行实验操作。
3. 提高观察、分析、解决问题的能力，以及团队协作和实验报告撰写能力。
情感态度价值观目标：1. 培养学生对生物科学研究的兴趣，激发创新精神。
2. 增强学生的环保意识和伦理观念，使其能够理性看待基因工程技术的利弊。
3. 树立学生的科学态度，培养严谨、细致、负责的学习态度。
课程性质：本课程为实验课，侧重于基因工程技术的实践操作，结合理论教学，培养学生的实际操作能力和科学思维。
学生特点：初三学生，具备一定的生物学基础，好奇心强，求知欲旺盛，但实验操作能力有限。
教学要求：结合学生特点，注重理论与实践相结合，强化实验操作训练，提高学生的实践能力和科学素养。
通过本课程的学习，使学生在掌握基因工程技术的基础上，能够将其应用于实际问题，为后续学习打下坚实基础。
二、教学内容1. 基因工程基本概念与原理- 基因的结构与功能- 基因工程的定义及分类- 基因重组技术的原理2. 基因工程实验技术- 基因克隆技术- PCR扩增技术- 基因表达与蛋白质提取- 基因编辑技术3. 基因工程应用实例- 转基因生物的培育- 基因工程药物研发- 基因治疗与生物制药4. 实验操作技能训练- 实验室安全与规范操作- 基因克隆实验操作- PCR实验操作- 基因表达实验操作教学内容安排与进度：第一课时：基因工程基本概念与原理第二课时：基因克隆技术及实验操作第三课时：PCR扩增技术及实验操作第四课时：基因表达与蛋白质提取实验操作第五课时：基因编辑技术及实验操作第六课时：基因工程应用实例分析与讨论教材章节关联：《生物学》初三下册，第五章“基因与遗传”：5.1 基因的结构与功能5.2 基因工程简介5.3 基因工程的应用三、教学方法本课程将采用以下多元化的教学方法，以激发学生的学习兴趣，提高教学效果：1. 讲授法：- 对于基因工程的基本概念、原理和操作流程等理论知识，采用讲授法进行教学。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验一、大肠杆菌质粒的提取与电泳检测一、实验目的学习质粒DNA提取的基本原理，理解各种试剂的作用，掌握质粒最常用的提取方法，为基因工程提供载体原料。
二、实验原理将一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖或表达的工具较载体。
细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体。
质粒是一种独立于染色体外的稳定的遗传因子，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞总，大小从1—200kb不等。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能复制，而宿主即使没有质粒也可以正常存活。
但质粒的存在使得宿主细胞具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。
常用的质粒载体大小在2.7—10kb之间。
如pBR32、pUC系列、pGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
细菌质粒的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量小，易于复性的特点进行的。
在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短时间内复性而染色体DNA不能复性。
用碱变性方法提取质粒就是利用离子型表明活性剂SDS溶解细胞膜上的脂肪及蛋白，在pH 高达12.6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，成了杂乱无章的片段。
而相对分子质量较小的质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离，当pH4.8的NaAc或KAc高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA可以完全形成互补链，又恢复到原来的构型。
而染色体DNA不能恢复而形成缠连的网状结构，变性DNA与菌体的蛋白质凝聚成块。
经过离心，出去的沉淀是变性的染色体DNA和蛋白质杂质，而上清液中的质粒DNA分子，则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。
由于乙醇沉淀的时候，不光DNA还有性质相似的RNA也一起被沉淀下来。
为了除去RNA，可以利用RNA酶进行处理，其后采用苯酚使RNA酶失活。
出去RNA酶活性往往会采用一些复合物如苯酚、氯仿等，并且苯酚不仅使RNA酶失活，还能有效去除菌体的蛋白质等物质。
因为只用无水乙醇沉淀，样品中还是混有蛋白质。
所以为了获得高纯度质粒，应在无水乙醇沉淀前，先用苯酚进行处理，以便除去其中的蛋白质。
三、实验试剂1.含质粒的大肠杆菌菌株LB培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%Nacl、调pH7.2抗生素：氨苄青霉素：母液100mg/mL，工作浓度100ug/mL溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。
溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。
TE缓冲液（pH=8.0）：10mmol/LTris-Hcl/1mmol/LEDTA2mg/mLRNase A溶解于10mmol/LTris-Hcl(pH7.5)、15mmol/LNacl3mol/LNaAc(pH5.2苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）、冰冷无水乙醇、冰冷70%乙醇碱裂解法小量提取质粒DNA步骤如下：（a）挑单菌落接种于含相应抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜。
（b）每管取1ml菌液然后12,000 g离心30 秒，集菌。
（c）加200 μl溶液I，用振荡器剧烈振荡悬浮菌体。
（d）加300 μl新配制的溶液II，温和颠倒混匀5次以上。
（e）溶液澄清后立即加入300 μl预冷的溶液III，混匀后冰上放置5分钟。
（f）4℃、12000 g离心10 （或5）分钟。
（g）取上清，加入等体积的氯仿，颠倒混匀后，4℃、12000 g离心10 分钟沉淀蛋白。
（h）吸取上清，加等体积异丙醇，混匀。
室温放置10分钟。
（i）12000 g离心10 分钟，弃上清，再用75% (v/v)乙醇洗涤沉淀，12000 g 离心5分钟。
(k)沉淀在37 ℃干燥后后溶于适量水或TE（50ul），（-20°C）保存备用。
质粒DNA的检测:取5ul的质粒与2ul的6×上样缓冲液混合后，在0.7%凝胶上电泳检测。
溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。
溶液I的作用：１、任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此可用适当浓度和适当pH值的Tris-HCl溶液。
２、大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I 中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH 稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦，溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。
加入溶液III后出现大量沉淀，这与SDS的加入有关系。
这其实是十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带。
其实这三条带以电泳速度的快慢排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
实验二、DNA片段（PCR或者酶切）的体外连接感受态细胞的制备重组质粒的转化阳性克隆的筛选（抗性筛选、蓝白斑筛选）大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。
1. 取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl 溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，剧烈振荡；3. 加入200µl 新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；4. 加入150µl预冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5mlH2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；5. 在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；7. 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；8. 加1ml70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH2O溶解；9. 用0.5µl的RNase37℃温育5~10分钟；10.电泳鉴定。
乙醇沉淀DNA1. 加入1/10体积的乙酸钠（3mol⁄L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3mol⁄L；2. 加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟；3. 12,000g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4. 加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；5. 于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；6. 加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。
酶切1. 酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。
2. 在离心管中加入如下成分：10×Buffer 1μl待切样品xμl酶0.5-1μl加水补足10μl3. 混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
4. 将离心管置于37℃中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间适当延长。
5. 用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。
双酶切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。
）连接1. 连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
2. 在离心管中加入如下成分：10×连接Buffer1μl待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为1∶3-5）连接酶0.5-1μl加水补足10μl3. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
4. 将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求而定，一般为22℃1-3hr或16℃连接过夜）。
连接完的样品可直接用于转化，也可放4℃冰箱短期保存。
感受态细胞的制备1. 挑取适当菌株的E.coli单菌落接种于2mlSOB培养液中，37℃摇床过夜。