分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制(精)
全髋关节置换术后股骨大转子骨溶解危险因素及治疗
现有 ３例 （． ） ２６ 出现股 骨侧假体 周 围骨 溶解并 伴 有疼 痛不适等症状 ， 中 ２例骨溶解 部位 位于股 骨大转 子 区 其 域； 翻修术 中证实 ３例的股骨假体均牢 固固定 ， 病灶 周 围 假膜组织病理检查 可见血 管旁淋 巴细胞 浸润 ， 分析 引起 骨溶解 的原 因可能与迟发型细胞介导 的超敏反应有关 。
后孤立性髋臼侧假体失 效 、 股骨 大转子 出现骨溶 解而股
人工关节的设 计是另 一与骨溶解 形式 （ 即骨溶解 发 生部位） 相关 的因素 。Ｃａ ｓ ５回顾性分析 两组非 骨水 ｌ 等¨ ｕ ］ 泥型 Ｔ ＨＡ， 一组 患者接受 Ａ ＭＬ金属 髋 臼杯 （ 无螺 钉孔 ， 平均 随访 １． ３７年）另一组患 者接受 Ａ ｔｒｐ ｒ ， ｒ ｏ ｏ 金属髋 臼 ｈ 杯（ 臼杯中心和周边有多个螺钉孔 ， 平均 随访 １． ２０年）两 ， 组患者所用股骨柄 （ ＭＬ柄 ） 同 ； Ａ 相 结果 显示 ， ＭＬ臼杯 Ａ
国 际 骨科 学 杂 志
２１ ０ ２年 ５月 第 ３ ３卷
第 ３ 期
Ｉｔ ｔｏ ，Ｍａ ５ ０ ２ ｎ Ｏｒｈ ｐ Ｊ ｙ２ ，２ １ ，Ｖｏ．３ ， ． １ ３ Ｎｏ ３
・
１ ５ ・ ９
全髋关节置换术后股骨大转子骨溶解危 险因素及治疗
王俏 杰
摘要
张 先 龙
股 骨 大 转 子是 人 工 关 节 周 围 骨 溶解 常发 部 位 ， 人 工髋 关 节 摩擦 界 面选 择 、 臼侧 和 股 骨 侧 与 髋
１ ２ 人 工 关节 设 计 与 固 定方 式 ．
骨溶解是人工关节磨 损 的继 发病变 ， 临床症状 的 其 出现明显迟于病变 的产 生 ， Ｘ线表现 已经 出现 明显骨 当 溶解 时 ， 者 可 能 仍 然 没 有 任 何 临 床 症 状 。 因此 ， 患 对 ＴＨＡ后 患者定期 随访 十分重要 ， 期行 骨盆 、 关节 ｘ 定 髋 线摄 片检查有助于在灾难性破坏出现前及时发现并 进行 治疗 。股骨大转子骨溶解应与股骨近端应力遮挡所 致骨 吸收相鉴别 ， 吸收表 现为人工 关节周 围骨稀 少 区域 内 骨 骨小梁稀薄 、 变细 ， 但仍 可见到 骨小梁 ， 骨溶解 表现 为 而 人工关节周围骨透亮 区 内看 不见骨 小梁存 在 ， 病灶边 且 缘有清晰的硬化边界＿ 。 ３ ］ 关 于对 Ｔ ＨＡ后股骨大转子骨溶解伴股骨侧假体松 动患者的治疗 ， 同学者之 间意见 较为一 致 ； 对 Ｔ 不 但 ＨＡ
人工髋关节置换术后假体脱位原因分析与处理
人工髋关节置换术后假体脱位原因分析与处理廖威明;胡俊勇;林子洪;康焱;傅明;盛璞义;杨忠汉;何爱珊;徐栋梁;杨子波;余世民【摘要】目的探讨人工髋关节置换术(artificial hip replacement,AHR)后假体脱位的原因及处理措施.方法对2000年1月至2010年7月本院和外院收治的17例AHR术后假体脱位患者的术前病因和假体脱位原因进行回顾性分析,并对其进行手法复位和手术治疗.结果术后经4个月～10年随访,17例患者中16例未发生再次脱位,1例于3个月内多次脱位的患者经手术治疗后未再出现脱位.结论假体位置不良、髋关节周围软组织失衡、术者经验不足以及病人因素是假体脱位的常见原因;提高手术水平、采取规范的手术技术、实施术后功能康复和健康教育是预防脱位的重要措施.【期刊名称】《中国骨科临床与基础研究杂志》【年(卷),期】2010(002)004【总页数】5页(P261-265)【关键词】关节成形术,置换,髋;假体失效;髋脱位【作者】廖威明;胡俊勇;林子洪;康焱;傅明;盛璞义;杨忠汉;何爱珊;徐栋梁;杨子波;余世民【作者单位】510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科;510080,广州,中山大学附属第一医院关节外科【正文语种】中文【中图分类】R687.42假体脱位是全髋关节置换术（total hip arthroplasty，THA）后的常见并发症,发生率仅次于无菌性松动，各家报道不一，较多文献报道初次THA脱位率为1%左右[1-3]。
人工髋关节置换术后假体松动研究进展
人工髋关节置换术后假体松动研究进展
饶毅;陈跃平
【期刊名称】《现代中西医结合杂志》
【年(卷),期】2015(24)4
【摘要】人工髋关节置换术能够有效缓解髋部各种疾患所带来的疼痛和重建髋关节功能。
但由于术后感染、骨质疏松、骨吸收等各种原因造成髋臼松动或股骨柄松动,甚至假体断裂,已成为关节外科最具挑战性的临床问题。
现将造成假体松动相关因素的研究综述如下。
1流行病学调查近10年的文献显示,人工髋关节假体置换术后的并发症发生率并不低,而在并发症中,假体松动一直以来都是人工髋关节置换术后最重要并发症之一。
【总页数】3页(P454-456)
【作者】饶毅;陈跃平
【作者单位】广西中医药大学研究生学院，广西南宁530001;广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530011
【正文语种】中文
【中图分类】R684
【相关文献】
1.人工髋关节置换术后假体松动原因分析及围术期护理干预
2.人工髋关节置换术后假体松动原因分析及治疗
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理4.人工髋关节置换术后假体松动原因的研究进展5.人工髋关节置换术后假体松动的研究进展
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国产骨水泥型人工全髋关节置换术后松动原因分析
６ 年 代韧 ，ｈｒｌ ０ Ｃ ａｎｅ ｙ采用 骨水泥 固定技 术 ， 使全 髋 关节置 换术 取得极 大成 功 ， 随着 时 间的推 移 ， 骨水 泥失败 造 成假体 松 动 越 来越 常 见 ， 们开 始 探讨 生 人 物 学 固定 技术 ， 望 以骨 长入 假体 表 面而 达 到 假体 希 固定 的 目的 ， Ｉ 但 临床资料 显示 并 非十分 理 想 ， 一段时 间以来 ， 水 泥 固定和 生物 学 固定 的 利 弊成 了临床 骨
修 手术 。
８ ２倒 患 者 中 ， ５ 男 ０倒 （ 动 ｌ 松 ５例 ） 女 ３ ， ２例 （ 松动 ８倒 ）年 龄 ４ ～８ ； ２岁 ， 均 ６ ０ 平 ２４岁 ； 重 ７ 体 ８
～
４ ｇ平均 ５， ｇ左 髋 ４ 倒 ， ３ｋ ， ０２ｋ ； ０ 右髋 ４ ２倒 。
驶 骨 颈 囊 内骨 折 ３ ０髋 ， 骨 头无 菌 性坏 死 ２ 股 ５
１ ２ 疾 病 种 类
髋 ， 骨颈 陈旧性 骨折 ｌ ， 股 ２髋 髋关 节骨关 节炎 ８ ， 髋 强直性脊 柱炎 ３ ， 臼发育 不 良 ４髋 。 前患 髋有 髋 髋 术 手术史者 ２ ８例 ， 中 ｌ 行 股 内收 肌 切 断 术 ，２ 其 ２例 ２ 例 股骨 颈 囊 内骨 折双 头 加压 钉 内固定 术 ， 行 带 ５例 血管 蒂骨瓣 移植 术 。
周发 生早期 脱位 ， 麻 醉下 手法复 位成 功 ， 经 并行外 展
所 有 患者均 采 用硬 膜外 麻 醉 ， 卧 ９。 ， 后 侧 ０位 髋 外 侧入 路 ， 位 后 ， 除股 骨 头 颈 ， 留股 骨矩 １ ５ 脱 截 保 ． ｃ Ｔ ｍ ｓ征阳性 者均 行髂 腰肌松解 。 ｍ，ｏ ａ 第一代 骨水 泥 技术 安装 假体 ， 假体 均 采用 国产 骨水 泥 型 高密 度聚
人工全髋关节置换术后假体松动分析
人工全髋关节置换术后假体松动分析目的：探讨人工全髋关节置换（THA）术后假体松动的原因，以提高全髋关节置换术的治疗效果。
方法：回顾性分析自2009年5月—2014年1月诊治由于THA术后假体松动而行人工全髋关节翻修术19例，探讨THA术后假体松动的诊断、原因和翻修注意事项。
结果假体取出后19例中15例关节内出现灰黑色颗粒样物质。
19例经全髋关节翻修术后18例疼痛消失，髋关节功能恢复满意;1例翻修术后1周出现脱位，经制动6周后髋关节功能恢复满意。
结论：THA术后假体松动与患者自身原因、假体的选择和手术技术操作有密切关系，早期翻修手术要有针对性。
1资料与方法1.1 一般资料本组19例中，男11例，女8例，年龄61岁-85岁。
THA手术原因：股骨头坏死5例，股骨颈骨折9例，转子间骨折3例，先天性髋关节脱位1例，类风湿1例。
置换关节类型：骨水泥型9例，生物型8例，混合型2例（骨水泥臼生物柄1例、生物臼骨水泥柄1例）;假体松动出现时间为THA术后1-4年，假体柄松动10例，假体柄断裂1例，假体臼松动8例。
患者均出现髋部或大腿疼痛。
X线片显示11例髋臼假体角度欠佳，8例股骨假体内翻，假体周围均出现透亮带或虫蚀空洞样改变，ECT骨显像无感染迹象。
19例均行人工全髋关节翻修术治疗。
1.2手术方法采取硬膜外麻醉、神经阻滞麻醉、全身麻醉，侧卧体位。
从原手术切口进入，试探性取出松动的股骨假体和髋臼假体。
必要时可以劈开股骨上段，切忌暴力拔出，以免进一步破坏股骨及髋臼残留的骨质。
假体或其周围连带的骨水泥取出后，彻底清理髓腔和髋臼内残留骨水泥、纤维界膜和肉芽组织等，冲洗干净。
重新扩髓和磨锉髋臼，根据骨质残留的情况置入不同类型的翻修假体，必要时植骨处理。
2结果假体取出后19例中15例关节内出现灰黑色颗粒样物质。
3例骨水泥型髋臼假体中，骨水泥与骨质间形成2-5 mm的界膜，2例骨水泥碎裂，13例髋臼假体内壁磨损严重（1-11 mm）。
全髋关节置换后的假体松动与深静脉血栓
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１ ７ －２ ５ Ｃ ２ －５ ９Ｒ ２ ０ 年敝 权 归 《 国组 织 Ｉ 程 研 窘 ｓ 憔 ｊ 复 》 穗纛 社 所表 ６ ３８ ２ Ｎ １１ ３ ／ ０１ 中 寒氍
全髋 关节置 换后 的假体 松动 与深静 脉血栓①：本刊 中文部
核 激 活 因子 受 体 ｍＲ Ａ与 骨 保 护 素 ｍＲ Ａ比 Ｎ Ｎ
戴 闽（ 昌大学 第一 附属 医院骨二 科 ，江 西省 南 南
昌市 ３００ ） ３ ０ ６ 推 荐理 由： 与其他 配伍 的假 体 一样 ，金 属．
２ 金属 离子 对 单核， 噬细胞 细 胞 活性 及其 巨
膜 上Ｒ ＮＫ Ａ 表达 的影 响 ３ 人工 髋 关 节假 体 材料 磨 损性 能及 其影 响
因素 ４ 活 血通 络 汤预 防 人工 股 骨 头置 换 后 下肢
金 属假 体在 使 用过程 中也会 产生 大量 的磨 损颗
粒 和金 属 离子 ，其 中金 属 离子 以钴和 铬 离子较
深静 脉血 栓形成 ５ 全髋 关节 置换 后 深静脉 血栓 栓塞 与 Ａ Ａ ＥＩ评 分 ：９ ￣资 料回顾 Ｒ ＣＨ Ｉ ８１ Ｊ ６ 人工 髓关 节置换 后 的深静脉 血栓 丹成 ： 参 发
ｌ ＳＳＮ ６ ３— ２ ＣＮ ． ５ ９ Ｒ １ ７ ８ ２５ ２１ １ ３ ，
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人工髋关节置换术后假体松动的原因及处理
其取 出并重新 置入 髋臼及股骨头假体 ， 效果 较好 。 关键词 ： 人工髋关节置换术 ； 臼假体 ； 髋 股骨头假 体 ； 假体松动 ； 假体抛 光 ； 假体纤维膜
中 图分 类 号 ： ６ １ ８ Ｒ ８ ． 文献 标 志 码 ： Ｂ 文 章 编 号 ：０ ２２ ６ ２ １ ）２ ０ ８ —２ １０ — Ｘ（ ００ ４ —０ １０ ６
假体后疗效满 意。结论
人工髋关节置换术后假体 松动的原 因主要 是假体表 面 出现抛 光现象 和界 膜形成 。采 用
个 体 化 非 骨 水 泥 型 假 体 、 锉 刀 操 作 、 立 良好 的骨 床 将 有 效 避 免 髋 关 节 置 换 术 后 假 体 松 动 ； 小 建 出现 假 体 松 动 后 应 将
关 节 为 骨水 泥型 ２ ８髋 、 骨水 泥型 ｌ 非 ７髋 ， 国产 人 工
关节 ２ Ｏ髋 、 口人 工 关 节 ２ 进 ５髋 。发 现 假 体 松 动 的
时 间为人 工髋 关 节置 换 术后 ２ａ６个 月 一１ ９ａ７个
目前 ， 全髋 关 节 置换 术 后 假体 松 动 的诊 断 尚无 金标 准 。ｘ 线 片 上 假 体 松 动 的 征 象 主要 是 假 体 位 移、 下沉 或假 体及周 围出现骨 水 泥断裂 ， 果假体 周 如
对３ ９例 （ ５髋 ） 工髋 关 节 置 换 ４ 人 本 组 假 体
术后假体松动患者 的临床资料进行分析 ， 术取 出假体进 行观察 ， 新 置人髋 臼及股 骨头假体 。结果 手 重
松动发生在人 工髋关节 置入术后 ２ａ６个月 ～ ９ａ７个月 ，５髋 中骨水泥型 ２ １ ４ ８髋 、 非骨水 泥型 １ 。手术取 出的 ７髋 假体均呈现 出不同程度的多 区域抛光现象和界膜形成 ， 中 ９例假 体表层钴 铬小珠 脱落 ， 其 重新置 入髋 臼及股骨 头
假体周围骨质溶解细胞分子生物学研究
磨损颗粒 与巨噬细胞 相互作用产生 的促炎症反应是 引发骨质溶解一 个关键 的始 发因素 ， 导致 了破骨 细胞 的 过度生成和激活。在小 鼠骨质溶解模 型中使用抗炎 因子 白介素一 受体 拮抗剂 （ －Ｒ ） １ Ｉ １ ａ 或是病毒性 Ｉ－０等因子 Ｌ Ｌ１ 对小 鼠进行 基因治疗 ， 阻断或减 轻小 鼠对聚 乙烯 颗粒 可 的炎性反应 ， 减缓磨损颗粒导致的骨质 溶解ｌ 这有力地 ２ ， 证 明这些促 炎 因子 的信号 转导 过程 对 引起 骨质溶 解所 起 的作用 。此 外 ， 敲除 Ｔ Ｆ受 体 编码 基 因或 是使 用 用 Ｎ 依那西普（ 种 Ｔ Ｆ ａ 一 Ｎ － 拮抗剂 ） 的方法来 抑制 Ｔ Ｆ ａ Ｎ － 活 性， 可减轻 Ｐ ＭＭＡ和 钛颗 粒导 致 的炎性 反 应 和骨 质溶 解ｌ ２ 。另有研究 胡表明 ， 病毒性 Ｉ－０可 抑制钛 颗粒 导 Ｌ１
到的情况相 符合口 ， 示体外 ＭＭＰ水平 的升 高可 能 提 会导致组织的崩解 。骨质溶解动物模 型支持 了巨噬细胞 对磨损颗粒的反应 。例 如 ， 兔子 的胫 骨植入 聚 乙烯 假体 会导致异物巨细胞反 应＿ １ 。同样 ， 骨质溶解犬 类模型 的 假体周 围细胞 中也有促 炎因子 （ 包括 Ｐ Ｅ 、Ｌ １水平 的 Ｇ ２ Ｉ ＿） 升高＿ ２ 。大 鼠和小 鼠骨 质溶解 模 型中 同样 可 观察 到 陶 瓷、 聚乙烯或聚 甲基丙 烯酸 甲酯 （ ＭＭＡ 颗 粒导致 的炎 Ｐ ）
维普资讯
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１ Ｏ ７ ・
国际 骨 科 学 杂 志
２０ 年 ５月 第 ２ ０７ ８卷
第 ３期 Ｉｔ ｔｏ ， ｙ２ ，２ ０ ，Ｖｏ．２ ， ． 周 围骨质溶解细胞分子生物学研究
邵振 兴
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分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制[ 09-03-10 13:21:00 ] 作者：金山编辑：studa20【摘要】目的探讨人工髋关节假体分离出的颗粒碎片刺激巨噬细胞而释放的肿瘤坏死因子(TNF-α)在人工髋关节术后引起骨溶解的作用机理。
方法采用钛颗粒刺激巨噬细胞而释放TNF-α模型及酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹、凝胶迁移率实验方法来研究其生物分子学机制。
结果鼠类巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α，而JNK抑制剂 SP600125和 NF-кB抑制剂MG132 大大抑制了钛颗粒诱导的TNF-α释放，但p38抑制剂无此作用，甚至，钛颗粒诱导巨噬细胞而激活AP-1 和 NF-кB。
结论钛颗粒诱导的TNF-α释放与JNK/AP-1及NF-кB通路有关。
【关键词】人工髋关节置换术钛颗粒骨溶解肿瘤坏死因子【Abstract】 Objective To study the mechanismof osteolysis after total hip replacement by tumor necrosis factor-α (TNF-α) release in macrophages stimulated with particulate debris from prosthesis. Methods A model of TNF-α release by stimulating macrophages with titanium particles was made and study the mechanism of TNF-α release by Elisa/West blot/EMSA. Results TNF-α was released in murine macrophage stimulated by titanium (Ti) particles and specific inhibitors of JNK (SP600125) and NF-κ B (MG132), but not p38 (SB203580) dramatically inhibited Ti-stimulated TNF-α release. Moreover,transcriptional activation of AP-1 and NF-κ B was also induced by Ti particles. Conclusion These results demonstrate that Ti particle-induced TNF-α release is mediated through JNK/AP-1 as well as NF-κ B pathways.【Key words】 THR; Ti particles; osteolysis; TNF人工髋关节置换术后假体周围的骨溶解及随后而来的假体疏松是置换术失败的常见原因。
由于假体长时间磨损与腐蚀生成的颗粒碎片导致假体周围形成假膜，这些假膜由肉芽肿形成，它包括巨噬细胞、纤维母细胞、巨细胞及破骨细胞［1，2］。
假体周围膜组织的这些细胞受这些碎片颗粒而产生有关骨溶解及假体松动的炎症因子如TNF-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-11及转化生长因子-β［3，4］。
通过这些细胞因子的相互作用，破骨细胞被激活吸收骨组织，导致骨溶解及假体松动。
这些炎症因子中，TNF-α是很重要的骨溶解因子。
Kimble 等已证明TNF-α可以增强成骨细胞NF-кB配位子（RANKLE）受体及巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)受体活性［5］。
而且，Ingham 等发现TNF-α又直接促进早破骨细胞分化并激活成熟的破骨细胞吸收骨组织［6］。
与此同时, Merkel 等通过去除肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因的动物颅骨与PMMA 颗粒接触，发现无骨溶解现象［7］。
这些结果显示，TNF-α是人工关节术后磨损颗粒导致的骨溶解重要细胞因子。
但至今,尚未报告与此相关的分子生物学机制。
本次实验,通过鼠巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α模型来分析TNF-α合成的分子生物学机制。
1 材料与方法1.1 材料 DMEM培养基，牛胎血清（FBS）来自于Gibco Invitrogen 公司（Rockville.MD）。
PD98059、SP600125、MG132 来自于Calbiochem (La Jola CA)。
抗磷酸-ERK /JNK/IkBα抗体来自于Cell Signaling Technology(Beverly,MA)。
测定鼠TNF-α ELISA 试剂盒来自于BioSource international(Madison WI)。
EGCG 来自于Sigma (StLouis,MO)。
硝基纤维膜及化学法光试剂盒来自于Amershan Biosciences Corperation(Piscataway,NJ)。
其余化学试剂来自于Sigma公司。
1.2 细胞培养 RAW264.7 细胞培养在由10% FBS 及1% 青链霉素添加的DMEM 培养基以及5％CO2湿润的37°C空气中，等生长到60%～70%后计数并培养在96孔培养皿（2×104细胞/孔）或60mm 组织培养皿(2×106细胞皿)，然后，细胞与已知浓度的PD98059、SP600125、MG132处理30min后，再与钛颗粒处理。
上清液及细胞收集后用于进一步分析。
1.3 钛颗粒准备钛颗粒（1～3μm）来自于Cerac(Milwaukee,WI)。
颗粒用25％硝酸及95％乙醇、0.1N氢氧化钠混合液消毒（Ragab et al,1999）。
颗粒内毒素由Limulus Amebocyte Lysate 方法（Biowhittaker,Walkersville,MD）测定。
1.4 方法1.4.1 ELISA （酶联免疫吸附剂测定） RAW264.7细胞（2×104/孔）在PD98059/SP600125/MG132 等抑制剂添加或不添加的情况下用钛颗粒处理。
TNF-α用ELISA 方法（BioSource）来测定。
具体如下：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，4℃放置24～48h。
洗涤液冲洗ELISA板3次，加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，37℃，1h。
标准品稀释方法：取标准品，溶于100μl标准品稀释液中做1:100稀释为10ng/ml 以后再倍比稀释至78pg/ml，即：10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。
洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，37℃，1h。
洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温或37℃显色15～30min。
ELISA读数仪测450nm/650nm处OD值，绘制标准曲线。
1.4.2 Wetern blot(蛋白质印迹) 将RAW264.7细胞用钛颗粒处理后，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150mmol/L NaCl、1NP-40、0.5去氧胆酸及50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)中，室温下1h，离心10min(13000r/min)，取上清液，检测蛋白浓度。
将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3min，分别加入4%～15% 十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，电泳45～60min(电压200V)。
将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜，在90V电压下转移1h，将其置于5%无脂牛奶中1h(去除非特异性染色)后取出，加第1抗体-ERK/JNK/IkBa(抗体稀释液：1%小牛血清、Tris盐溶液、0.5 Tween 20)于硝酸纤维膜，4℃过夜，漂洗3次后加HRP标记的抗1抗体，再置室温1h，漂洗3次，用放射自显影法显影，Kodak X胶片摄影。
Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较。
1.4.3 EMSA(凝胶迁移率实验) Park方法准备细胞核提取液［8］。
蛋白浓度用BCA试剂盒测定。
凝胶迁移测定方法按Promega 公司说明书进行。
7μg 核抽提液与1μg poly d(I-C)含50，000～100，000 cpm 32P标记的AP-1/ NF-κB置25μg的结合缓冲液（10mM Tris.HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 1mM DTT, 和4% glycerol）于室温30min。
形成的复合物在0.5xTBE缓冲液(50mM Tris. HCl, pH8.5, 50mM borate,和1mM EDTA)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并凝胶在真空中变干60min后 X 胶片摄影。
1.4.4 统计学方法统计分析用SPSS11.0并完全随机设计的单因素方差分析。
P <0.05具有意义。
2 结果2.1 钛颗粒刺激后由时间及剂量依赖性释放TNF-α为确定RAW264.7细胞在何有效浓度的钛颗粒才能释放TNF-α，选择了三种不同浓度的钛颗粒并与RAW264.7细胞混合。
取其上清液用ELISA法测定TNF-α。
图1示三种浓度的钛颗粒剂量依赖性释放TNF-α，图2示0.02% 浓度钛颗粒刺激后时间依赖性释放TNF-α。
2.2 ERK/p38/JNK/NF-к B 抑制剂对RAW264.7细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α的效果为了解RAW264.7细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α与哪支细胞信号通路有关，细胞先由ERK/p38/JNK/NF-к B 抑制剂处理后，再受0.002%钛颗粒刺激24h。
用ELISA法测定其上清液中的TNF-α。
与对照组（651.5±9.3pg/ml)相比，30μM PD98059, 25μM SB203580, 20μM SP600125, and 10μM MG132 各抑制TNF-α66% (218.2±21.1pg/ml), 20%(550±5pg/ml), 91% (56±6pg/ml) and 92% (51.3±4.7pg/ml) (P<0.01) (见图3) 。
其中JNK抑制剂（SP600125）及NF-к B 抑制剂（MG132）显示较强的抑制作用。
图3 ERK1/2、JNK及NF-кB抑制剂对RAW264.7。