苏云金芽孢杆菌作业

发酵工艺学作业 题 目 苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 学 院 班 级 学 号 姓 名 苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 摘要：苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种开发和利用较为成功的微生物生物农药，但也存在着生产成本高、发酵条件难控制等缺点。本文主要综述了Bt生物农药的发酵工艺研究进展，主要包括BT发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等方面。并对Bt生物农药的发展前景作出了展望。 关键词：苏云金芽孢杆菌；生物农药；发酵工艺；展望

Review on fermentation of Bacillus thuringiensis

Abstract: Bacillus thuringiensis (Bt) is a microbial pesticides,Which has been successful developed and used.The fermentation technology of Bacillus thuringiensis (Bt) in recent years were summarized, including raw material, temperature, pH value, oxygen, fermentation time.In this aricle,the development prospct of Bt microbial pesticides is also put forward. Key words: Bt;microbial pesticides; fermentation technology;forward 前言 生物农药又可称为绿色农药、生态农药，是20世纪70年代提出的，是指可以用来防治病、虫、草、鼠等有害生物及调节植物生长的生物体或源于生物体的各种生理活性物质。生物农药不仅具有常规农药的高活性，能大规模工业化生产，而且专一性强，一般不伤害虫的天敌和有益生物，对人畜无毒，不污染环境，可在田间大规模应用。 微生物生物农药是生物农药中的主要类型之一[1]。而在微生物生物农药方面又以苏云金芽孢杆菌（Bt）为目前产量最大，应用最为广泛的一类细菌杀虫剂[2,3]，占到生物农药的90%左右[4]。Bt的发酵方式可分为液体发酵和固体发酵两种类型。我国主要采用液体深层发酵生产苏云金芽孢杆菌制剂。但液体发酵存在培养基成本高、效率低等问题，使得产品生产成本较高[5]。 我国一些地方的中小型农药厂生产苏云金芽孢杆菌多用简易的，小批量的固体发酵方法。 固体发酵方法作为生产BT生物农药的一种新方式，与液体发酵方式相比，具有投资低、产量高、后处理方便等优点，从而逐渐体现其优越性，但其技术和设备研究并未完全成熟。 本文对Bt发酵生物农药的发酵工艺最新研究进展进行了综述，主要包括Bt发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等5个方面。并对BT生物农药的发展前景作出了展望。 1培养基 根据相关文献报道[6]，Bt在含氮0.075%～0.225%，含糖0.1%～1.5%和碳氮比为0.4～20.0的范围内都能生长良好。因此，为了降低生产成本，节约资源，人们通常选择廉价、易得的农副产品作为Bt发酵的原料。 1．1碳源 碳源大多为淀粉和蔗糖等。一般发酵培养基中，总营养物含量在5%左右，C/N比为(4～5):1为宜，这样的配比使得最后发酵液中芽孢量为20亿个～50亿个/ml。碳源除可以用玉米粉、葡萄糖、蔗糖外，还可以用丙酮丁醇废醪。其中葡萄糖由于受Fe2+和PO43-等离子的影响，在灭菌时很容易焦糖化，对发酵产生很大的影响[7]。由于Bt在发酵过程中能分泌活跃的胞外淀粉酶，故最好选择淀粉作碳源[8]。陈在佴等[9]对BT99-11菌株进行培养条件的研究发现，玉米淀粉比葡萄糖和玉米粉对发酵的影响更显著。 1．2氮源 氮源为豆饼、棉籽饼等蛋白质物质，其中以豆饼粉、玉米浆、鱼粉、蚕蛹粉、棉籽饼等有机氮为好，pH要求中性。吴继星[10]等进行两个菌株的混合培养，研究得出，在以豆饼粉为主要氮源的培养基上发酵水平分别达到5650和5800U/ul,显然豆饼粉培养基较棉籽饼培养基优越；申烨华等[11]对Bt-HD-1菌株进行了发酵培养，研究得出棉籽饼粉对发酵的影响显著，而鱼粉和豆饼粉对其发酵的影响不显著。在工业上，发酵中使用玉米浆比酵母粉对芽孢和伴孢晶体的影响更显著。苏云金芽孢杆菌在利用糖时会大量产酸，如果糖浓度过高，发酵液的PH值可能会降到5．5以下，这种pH会抑制或阻止苏云金杆菌的生长，同时苏云金杆菌在利用氮源时会产生一些碱性物质，会利用糖代谢时产生的酸性中间产物，因此糖浓度过少，对苏云金杆菌发酵也是不利的。综上所述，选择适合的氮碳比对BT发酵时十分重要的[11]。 1．3填料 在固体发酵中还要加入具有一定疏松通气作用的填料，这些填料可以为谷壳、砻糠、秸秆粉等农副产品，其中麸皮、米糠既可疏松透气又可作为氮源。因此麸皮、米糠是比较常用的有机载体，但是如果单独使用麸皮等载体，在培养基高温灭菌消毒后，存在着粘度加大、疏松度降低、后续接种困难等问题。张怡，杨天雪[12]等利用废次烟草部分替代固体发酵中的麸皮等有机载体，72h后棉铃虫的较正死亡率可达74%，从而降低了生产成本。 2温度

温度直接影响到微生物体内各种酶的活性，一般而言，发酵温度升高，酶的活性增大，微生物生长代谢加快，生产期提前；但温度过高会使酶失活，表现在菌体容易衰老，发酵周期缩短，从而影响最终产物[13]。因此，在发酵过程中必须保证稳定和适宜的温度范围。不同的微生物之间基本生长温度有较大的差别，对一种微生物而言，其最适生长温度一般为30℃[14]。Bt的最适生长温度在29～31℃之间，温度越低，发酵时间越长，发酵水平越好。杨淑兰[15]等对生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌的固体发酵进行了研究，结果发现，在室温23～25℃、29～31℃、35～36℃三组实验中，29～31℃的发酵效果最好，在35～36℃时菌体被抑制生长。该实验表明，控制温度至关重要，特别在对数生长期，菌体代谢旺盛，产生较大热量，此时更要控制温度，控制温度在最适范围以内，从而提高产量和毒效。 3 pH值 pH是微生物生长和产物合成非常重要的参数，是代谢活动的综合指标，对于发酵过程具有十分重要的意义。不同种类的微生物对pH的要求不同。pH的变化会影响微生物的生长和代谢产物的生成，因而控制发酵液中的pH尤为重要。 苏云金芽孢杆菌对pH有较高的耐性，可以在较宽的pH范围内好好的生长[5]。在酸性条件下生长性能较差，在弱酸和酸碱条件下生长较好[16]。当6.0时，菌数相差不大。灭菌后pH<6.5后有利于芽孢的萌发和菌体的大量生长，但对后期晶体的形成不利，pH>7.5则会延长芽孢的萌发期，因此灭菌后pH应在6.8左右为宜[17]。方苹等[18]进行了Bt固体发酵的条件试验，结果发现发酵初始pH值为7.5时所产芽孢数达到最大值，基本稳定在2137×1010个/g。Ejiofor等[19]研究表明，当pH值为5左右时，Bt形成芽孢和半孢晶体的能力较pH为中性偏碱时弱。Abdel-Hameed等[20]通过实验研究表明,当培养基的pH 值低于6. 5时,对菌体芽孢的形成和δ-内毒素产生负面的影响。杨淑兰等[21]进行苏云金芽孢杆菌固体发酵杀虫粉百公斤级扩大实验时发现，pH值为8时菌数最多，但由于配制液体种子培养基时，使用的原料在灭菌时产生了乙酸，将一部分碱中和了，实际pH为7，从而Bt的最适生长pH为7。 中科院生态中心[8]利用味精废水进行Bt的发酵也得到了同样的结论。丁学知等[22]对4.0718菌株发酵的最佳条件进行了研究，结果表明，发酵液的起始pH值为7.8-8.0. 4 通氧量 好氧性微生物的生长发育和产物的合成都需要消耗氧气，它们只有在有氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用，因此，供养对需氧微生物必不可少。Bt属于革兰氏好氧菌，因此在发酵过程中必须提供充足的氧气，以维持菌体生长和代谢产物的形成。在发酵初期，菌体细胞数量少，需氧量不大，但当菌体达到指数生长期时，菌体繁殖很旺盛，以糖代谢为主，需氧量最多，因此必须增加氧气的供应量[5]。根据生长周期中各阶段对氧的需求量的不同，合理的调整氧气的加入量，在需氧量较大时加大氧气的通入量，其中提高搅拌速度[23]是提高发酵水平的一种有效措施，此外，适当使用某些可溶性营养成份和进行分批补料发酵有利于改善氧气的传递[24]。 5 发酵时间 在发酵过程中，应严格控制发酵的时间，发酵时间若不足，则孢子没有充分形成，伴孢晶体的产量不足；发酵时间若太长，则由于培养基中营养物质的消耗以及代谢产物的积累，菌体数量不再继续增加，菌体逐渐老化，伴孢晶体的产量也会因此而降低[25]。一般Bt的培养时间为44-48h, 姚伟芳等[ 26 ]对Bt固态发酵条件的优化研究,结果表明,发酵时间为42 h左右效果最佳。王世梅等[ 27]利用城市污泥生产Bt生物农药时发现,在培养30 h时,有75%的芽孢脱落,在培养36 h时,有90%的芽孢脱落,在培养48 h时,细胞总数和芽孢数均达到最高。李新社等[28]对Bt不同时间的发酵培养所产生的芽孢进行计数统计，发现在培养2天时所产生的芽孢数目比前一天所产生的芽孢数要多，以后基本上不再增加甚至略有减少。周先治等[29]研究了Bt-LSZ9408菌体的生长曲线，结果表明，在8～20h范围内为对数生长期，菌体浓度逐渐增大，24h后菌体浓度达到最大值，在28～40h之间菌体数变化不大，称之为稳定生长期，40h后菌体浓度降低，进入衰亡期。通过涂片观察，发现8h时有少量菌丝体，20h时有孢子形成，28h时有半孢晶体形成，32h时有晶体出现，40h时晶体数达到80%以上。在对数生长期适当的增加生物所需的营养物质可提高Bt菌的产量[30]。 6 总结 我国Bt生物农药研究开发与应用技术已达到国际先进水平。世界上首家Bt专门研究机构——中国湖北Bt研究开发中心于20世纪90年代中期在湖北省农科院成立。新型发酵设备的出现、发酵吨位的提高、工业发酵技术的成熟、发酵液处理技术的完善以及剂型的多样化都无疑为我国Bt生物农药产业发展创造了条件，但与国外在菌种和生产技术方面相比仍有较大差距。Bt的产业化生产已经取得了一定的成绩，在实际生产中，人们为了降低生产成本，大多采用农副产品作为Bt发酵的原料。在Bt发酵过程中，会受到多方面因素的影响，这就要求我们要从多角度、多方面综合考虑，从而开发出更经济合理的培养基和培养方法。 7 展望 Bt的发展前景是非常乐观的。随着各门学科的不断发展，人们正在不断地从生物化学、基因工程等上游技术研究思路出发，同时结合代谢动力学、发酵动力学、发酵后处理化工技术、生物化学反应工程技术等下游技术研究微生物的发酵过程，通过各门学科的交叉和渗透，一定能不断扩宽Bt的开发领域。与此同时，随着以基因工程为主导的现代生物技术的不断发展，新一代遗传工程杀虫剂具有良好的开发应用前景，研究性能良好的Bt基因工程菌成为今后的一大热点。 参考文献 [1] 喻子牛. 微生物农药及其产业化[M]. 北京:科学出版社, 2000: 27 - 34. [2] 阮丽芳，王玉洁，沈萍．产黑色素B．thuringiensis重组菌株的构建及其培