实验一 苏云金芽孢杆菌ICP基因的检测PPT教学课件
第七章、质粒
sopA与sopB构成一个转录单位， sopA与启动区域结合，控 制2个蛋白的转录。属自体阻遏控制。 sopB蛋白起到促进sopA与启动区域结合的作用。 sopA 、 sopB缺一不可。 sopC由12个正向重复序列组成，每个含有43个bp，其中又 包含反向重复序列。
sopB与 sopC区结合形成核酸－蛋白复合物，称为 分配复合体。 分配复合体在细胞分裂时将 2个质粒移向细胞两级。 sopA与启动区域结合，控制2个蛋白的转录。 sopB 蛋白起到这一结合的促进作用。 sopA 、sopB缺一 不可。 质粒主动分配模型见图5－14
1、质粒的复制
能够独立复制的单位称为复制子（replicon）。 质粒的复制以θ型复制为主，有单向和双向复制， 以及滚环复制。复制所需蛋白主要来自寄主。 质粒的复制起始位点称为 ori V。 Ori 区域的功能： A.复制起始 B.决定宿主范围 C.决定拷贝数
2、质粒复制的调节
1）、抑制物—靶位调节 调节特点：依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物， 通过与目标RNA的互补结合阻止质粒复制起始。目 标RNA可以是复制的引物，也可以是复制所需蛋白 的mRNA。
放线菌的质粒 scp 不但是致育因子，同时还 编码抗生素合成基因。 多数质粒不显示任何表型效应，至少目前的 方法和手段还测定不出来，这些质粒称为隐 秘质粒（cryptic plasmid）,许多细菌都有， 并非无功能，只是尚未发现。
苏云金芽孢杆菌是著名的杀虫细菌，其杀虫晶体蛋 白（Insecticidal crystal protein, ICP）基因在质粒 上。 编码杀虫晶体蛋白基因多为 cry，还有 cyt 基因 不同的cry 基因杀虫活性不同 对杀虫晶体蛋白敏感的害虫有很多种，包括：鳞翅 目、鞘翅目、双翅目等等。
苏云金杆菌cry1aa基因的表达和定点突变
ＡＢＳＴＲＡＣＴＩｎｓｅｃｔｓｗｏｕｌｄｄｅｖｅｌｏｐｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅＢ口ｃｆ盯淞历“ｒｆ愕ｆＰ珊括ｔｏｘｉｎｓ，ａＩｌｄｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｐＨｏｆｉｔｓｍｉｄｇｕｔｊｕｉｃｅｔｏｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｕｎｋｎｏｗｎ．ＡｍｏｄｉｆｉｅｄＳＤＳ—ａｌｋａｌｉｎｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆＢｔ４．０７１８ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＰ３ｐｌａｓｍｉｄｃｏｎｔａｉｎｃ，），１Ａａｇｅｎｅ．Ｂｙａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｎｓｅｎｓｕｓｒｅｇｉｏｎｏｆ１３ｋｉｎｄｓｏｆｃＷｌＡａｇｅｎｅｗｉｔｈｍｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｂｎｎａｔｉｏｎ’ｓＢＬＡＳＴＷＷＷｓｅｒｖｅｒ’ｐｒｉｍｅｒｓＨ０１ａｎｄＨ０２ｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏａｍｐｌｉ６ｅｄｆＷｌＡａｇｅｎｅｆｒｏｍＰ３ｐｌａｓｍｉｄ，ｔｈｅｎｔｈｅＰＣＲＤｍｄｕｃｔｓｓｕｂｃｌｏｎｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＤＡａｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ３．５一ｋｂＢ日历ＨＩａｎｄＳ口ｆＩｉｎｓｅｒｔｏｆｐＭＤｌ８一ＴｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＥＴ３０ａｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏⅡｎｅｄＥ∞，ｆｓｔｒａｉｎＢＬ２ｌ（ＤＥ３）ｔｏｇｉＶｉｎｇＥＴＡａｓｔｒａｉｎ，ａｎｄａ１４１－ｋＤｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｂｙｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧＳｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｍｅｄｉｎａｔ、Ｖｏ－ｓｔ印ＰＣＲｗｉｔｈｔｈｒｅｅｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｍｅｆｉｒｓｔｓｔｅｐｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔｈｅ“ｂｉｇｐｒｉｍｅｒ＂ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄＰＣＲｔｏａｒｎｐｌｉｆｉｅｄｔｈｅｌ０４８－ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｅｄ．Ａ２２４－ｂｐｍｕｔａｔｅｄｆ｝ａｇｍｅｎｔｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｄｉｇｅＳｔｉｎｇｐＭＤＭＸｗｉｔｈ砌ＰＩａｎｄ丑ｆｓＨＩＩａｎｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｍｅｆｈｇｍｅｎｔｉｎｐＭＤＡａａｔｔｈｅｓａｒｎｅｐｏｓｉｔｉｏｎｔｏｇｅｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＭＤＭａ．ｐＭＤＭａｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＢ日ｍＨＩａｎｄＳｂ，Ｉ，ｔｈｅ３．５－ｋｂｍｕｔａｔｅｄ矗ａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＥＴ３０ａＶｅｃｔｏｒｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｍｕｔａｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎＥＴＭａＣ８１２ＡａｎｄＣ８１４Ａ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｔａｍｃ，），１ＡａｇｅｎｅｗａｓａｌｓｏｏＶｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ舶ｍＥＴＡａｓｔｒａｊｎａ１１ｄｍｕｔａｔｅｄＥＴＭａｓｔｒａｉｎｄｉｓｓｏｌＶｅｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ２一Ｍ［ｅｒｃａｐｔｏｅｍａｎｏｌｓ锄ｅｐＨｏｒｉｎｄｉＶｉｄｕａｌｌｙ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔ１１ａｔ，ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２－Ｍｅｒｃａｍｏｅｔｈａｎｏｌ，ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ疔ｏｍｍｕｔａｔｅｄＥＴＭａｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｍｏｒｅｅａｓｙｔｏｄｉｓｓｏｌｖｅ，ａｎｄｃｏｕｌｄｄｉｓｓｏｌｖｅｂｅｔｔｅｒｉｎ１０ｗｐＨｏｒｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２一ＭｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌｔｈａＪｌｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓｆ＿ｒｏｍＥＴＡａｓｔｒａｉｎ．ＩｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｎｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆＣ８ｌ２ＡａｎｄＣ８１４Ａｃｏｕｌｄｓｉｇｎａｌｌｙｃｈａｎｇｅｔｈｅｄｉｓｓｏｌｖａｂｉｌｉｔｙｏｆｊｎｃｌｕｓｊｏｎｂｏｄｉｅｓ．ＴｈｅｓｔｕｄｙｐｒＤＶｉｄｅａＶａｌｕａｂｌｅｏｐｔｉｏｎｆｌｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄｏｎｓｕｃｈａｂａｓｅ，出ｅｒｏｌｅｏｆｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅｉｎｔｈｅｐｒｏｔｏｘｉｎｓｔａｂｉＩｉｔｙａ１１ｄｔｏｘｉｃｉｔｙｃａｎｂｅｍｒ出ｅｒａｃｈｉｅｖｅｄＫｌｅｙｗｏｒｄｓ：８口ｃ“，￡岱ｆ是“ｒ豫ｉｌ拿挖ｓ扭，ｃ，ｙｌＡａｇｅｎｅ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ前言１．苏云金芽孢杆菌１．１苏云金芽孢杆菌（Ｂｔ）概论苏云金芽孢杆菌（肋ｃｆ，，“ｓ胁“ｒｆ娼招瑚如，简称Ｂｔ）是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性细菌，按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版可将其归属为第二类第十八群芽孢杆菌属（口口ｃ讲珊）中的一种【ｌＪ。
产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产抗菌物质性质
※生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11147产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产 抗菌物质性质李 云，杨胜远 * ，林晓东，钟瑜红，苏 婷，刘湘嘉(韩山师范学院生物系食品与发酵工程研究所，广东 潮州 摘 521041)要：从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株 K2，其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌，特别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。
发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后，仍然有很强的抗菌活性，并对多种蛋白 酶敏感，表明抗菌活性物质为蛋白类物质。
通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育 分析，鉴定菌株 K2 是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
菌株 K2 产生的抗菌物质在 pH6～9 条件下 80℃处理 30min 仍保持稳定的抗菌活性，其对敏感菌的作用主要是杀菌，而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。
该抗菌物质 在菌体生长对数中期产生，在稳定期中期抗菌活性达到最大。
关键词：苏 云 金 芽 孢 杆 菌；细菌素；鉴定；抗 菌 物 质Identification of Bacteriocin-producing Bacillus thuringiensis and Properties of Its Antibacterial SubstancesLI Yun，YANG Sheng-yuan*，LIN Xiao-dong，ZHONG Yu-hong，SU Ting，LIU Xiang-jia (Food and Fermentation Engineering Institute, Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)Abstract： Strain K2 having the ability to produce bacteriocin was isolated from the surface of picked vegetables. The neutralized cell-free fermentation supernatant exhibited an inhibition effect against Gram-positive bacteria, especially strong inhibition effect against Bacillus strains. The inhibition activity of the fermentation supernatant still kept high after ammonium sulphate precipitation and dialysis, and the activity of the dialysis retentate was sensitive to a variety of proteases. These results indicated the protein nature of antibacterial substances contained in the dialysis retentate. Base on morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K2 was classified as Bacillus thuringiensis. The antibacterial substance from strain K2 remained strong antibacterial activity after heating treatment at 80 ℃ and pH 6 － 9 for 30 min, suggesting its excellent thermostable property and pH resistance. The antibacterial activity was generated from midlogarithmic growth phase and reached the maximum activity at mid-stationary phase. Key words：Bacillus thuringiensis；bacteriocin；identification；antibacterial substance 中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0147-06细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机 制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，主要抑制 其他相近种类的细菌，一般产生菌自身对其细菌素具有 免疫性[ 1 ] 。
基因工程的基本工具说课稿公开课一等奖课件省赛课获奖课件
例大肠杆菌的质粒
大肠杆菌的质粒， 其中含有抗药基因， 如四环素的标记基因。 质粒的存在与否对宿 主细胞生存没有决定 性作用，但复制只能 在宿主细胞内成。
基因工程的基本内容
一、基因工程的概念 原理：基因重组 研究水平：分子水平
二、基因操作的工具 1、基因的剪刀——限制性内切酶 含有专一性
2、基因的针线——DNA连接酶 3、基因的运输工具——运载体
将苏云金芽孢杆菌抗虫基因移植到棉花的细 胞中，使棉花含有抗虫害的作用。
通过数年的努力，科学家于20世纪70年代创 立了能够定向改造生物的新技术——基因工程。
基因工程的基本内容
一、基因工程（基因拼接技术或DNA重组技术）
1、概念 在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”
和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合， 然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因 在受体细胞内体现，产生出人类所需要的基因产 物的办法。它能定向改造生物的遗传性状。
例：下列黏性末端属于用同一种限制酶
切割而成的是
B
A．①② C．①④
B．①③ D．②③
复习巩固
从下列叙述的事实中你能得到什么结论？ ⑴人的β-珠蛋白的基因中，外显子的碱基对在整个基因碱基对 中所占的比例为(146×3)÷1 700×100%=26%。 ⑵人的凝血因子的基因中，外显子的碱基对在整个基因中所占的 比例为(2 552×3)÷186 000×100%=4%。
①在真核细胞中，不同基因的编码序列(或非编码序列)， 在各自基因中所占的比例是不同的； ②在真核细胞中，编码序列在整个基因中所占比例较少， 而非编码序列所占的比例较大。体现了真核细胞基因构 造及其功效的复杂性。
原理：基因重组 研究水平：分子水平
第十一章微生物的分类和鉴定ppt课件
例1：苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种 Bacillus thuringiensis （subsp）galleria 例2：椭圆酿酒酵母（或酿酒酵母椭圆变种） Saccharomyces cerevisiae （var）ellipsoideus
由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准， 为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱， 细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念”
学名（scientific name）
指一个菌种的科学名称，它是按照《国际 细菌命名法规》命名的、国际学术界公认并通 用的正式名字。
一、双名法（binominal nomenclature）
双名法指一个物种的学名由前面一个属名（generic name）和后面一个种名加词（specific epithet）两部分
Ainsworth从1966年起，就把真菌界分为两大门 （粘菌门和真菌门），并把真菌门再分成五个亚门。 目前，该系统已为各国广大真菌分类学者所普遍采 用，影响较大。
三、酵母菌的分类
酵母菌的分类普遍采用荷兰的Loddov在1970 年提出的分类系统。
在这个分类系统中，以是否形成各类有性孢子 作为分类的起点，
细致的观察和测试，参照一定的，用对比的方法来 确定该微生物的分类地位。
第一节 通用分类单元
三、种以下的分类单元
亚种（subspecies，subsp.，ssp.） 变种（variety，var.） 型（form） 类群（group） 菌株（strain） 小种（race） 相（phase） 态（state）
一般指自然存在的微生物交互变异中的一定阶段。
（八）态（state）
通常指微生物的菌落变异状态，如粗糙、光 滑或粘液状等。
第九章 微生物 第十章 基因诊断PPT课件
（四）分子生物学检测
1、优点：敏感性高，直接测定病原体的遗 传物质
2、方法：PCR、核酸探针杂交技术
第二节.标本采集与运送：
总原则 ：
应用抗生素之前采集，采集病变部位比 如粪便要采集脓血部位，防止污染，避 免正常菌群对致病菌的污染，有些细菌 不耐冷，厌氧菌及时送检，标本应盛于 无菌、干燥、 有盖的容器内 ，透明盒身， 要可以看到标本性状。
（2）成年男性：先以肥皂水清洗尿道口，再 用清水冲洗，就可采集中段尿。
（3）婴幼儿：消毒外阴部或外生殖器，无 菌尿杯对准尿道口留取。
2、留置导尿的尿液应用注射器从尿袋近尿 道端吸取5ml，切不可直接从尿袋底部出口 留取。
3、厌氧培养时采用耻骨上膀胱穿刺术取尿 液。
4、抗酸杆菌染色检查，为提高检出率，可 留取24小时尿液,然后取部分沉淀送检.
2、标本应新鲜,采取粘液,脓血部位或絮状物12ml；成形粪便采取蚕豆大小。
3、婴幼儿或无大便者可用直肠拭子采取:无菌棉签 用生理盐水湿润后插入肛门4-5cm处转动取出于无 菌试管中送检。
（六）创伤口分泌液,脓液标本采集
1、自创面,感染面采集标本时,应先用无菌生理盐 水清洗表面,在以无菌棉签采取深部分泌物,(坏死 组织与正常组织相接部位)。
2、气管切开的患者，应在更换新气管套管 后自管内取标本。
3、肺结核患者结核分枝杆菌检查应采集较 多的痰液，若痰量少，应采集24小时痰液 以提高阳性率。
4、支气管分泌物,肺泡灌洗液由专业医师 采集
5、肺脓肿患者厌氧培养时，可直接在环甲 膜下穿刺抽取分泌物，排去空气后，插入 无菌的橡皮塞送检。也可用专用厌氧培养 运送管
2、脓肿可用注射器吸取脓液,如量少,也可用无菌 棉签采集。
3、厌氧培养应用针管抽取深部脓液，排出空气， 针尖插入无菌橡皮塞中送检。
含cry8型基因苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定
含cry8 型基因苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定王志鑫1，束长龙2，申培立1，苏旭东1，李志辉1，于妍1，张先舟1，马雯1，檀建新1【摘要】摘要:为发掘对蛴螬有防治作用的苏云金芽孢杆菌及其cry 基因，在河北省各县市共采集土壤样品254 份，采用温度筛选法分离出Bt 菌株42 株，经PCR-RFLP 方法鉴定，其中10 株含有cry8 型基因。
这些菌株有如下特点:同一菌株含1 种或多种质粒;PCR-RFLP 鉴定证明有多种cry8 基因存在，多数菌株中含2 种cry8 基因，如cry8E 和cry8F 常共存于同一菌株中;Cry8 杀虫晶体蛋白分子量约为130 ～140 kDa，晶体形态均为球形。
这10 株菌采样地点分布于保定、衡水、邯郸、廊坊、唐山和邢台等地，植被类型多样化，说明cry8 型Bt 菌株在河北省分布广泛，可为蛴螬类害虫的防治提供丰富的Bt 资源。
【期刊名称】华北农学报【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6【关键词】关键词:苏云金芽孢杆菌;基因鉴定;cry8 基因;PCR-RFLP;蛴螬苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种在土壤中广泛存在的革兰氏阳性菌，在其营养期后期产生的伴孢晶体(也称为杀虫晶体蛋白)对多种昆虫具有高效且专一的杀虫效果，其杀虫谱包括鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、同翅目(Homoptera)等10 个目500 多种害虫［1-2］，尚未发现对人、畜、昆虫天敌及水生生物有危害，因此，作为一种微生物杀虫剂被广泛应用于农林业等害虫的生物防治。
蛴螬是金龟子总科幼虫的统称，可以危害多种农作物，如花生、大豆、玉米、马铃薯等，给农业生产造成巨大损失，据调查统计，86%的植物地下部分损伤由蛴螬引起［3］，在我国蛴螬的发生面积约为每年666.7 万hm2，严重时达2 133.3 万hm2，作物产量损失可达20%～40%［4］;还对城市绿化，足球场和高尔夫球场的草坪维护带来很大影响［5］。
3-2 基因工程的基本操作程序(教学课件)——高中生物人教版(2019)选择性必修3
转基因抗虫棉 DNA合成仪
一.目的基因的筛选与获取 （3）利用PCR获取和扩增目的基因
PCR技术：PCR是_聚__合___酶__链__式__反__应_的缩写，是一项根据__D__N_A__半__保__留复制 的原理，在_体__外_提供参与DNA复制的_各__种组___分_与_反_ 应_条__件____，对 目__的___基__因__的__核___苷__酸__序_ 列_进行_大___量__复制__的技术；
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左) 与非转基因抗虫棉(右)
从社会中来
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的 筛选与获取
与载体拼接
2.基因表达 载体的构建
抗虫基因
普通棉花 （无抗虫特性）
3.将目的基因 导入受体细胞
导入 棉花细胞
重组DNA分子
4.目的基因的 检测与鉴定
害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞 膜穿孔，最后造成害虫死亡。 2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环 境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸 性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗 虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
一.目的基因的筛选与获取 3.筛选合适目的基因 ①筛选方法之一
2.原则：_碱___基__互__补__配___对__原__则___ (A-__T___;C-___G___)
（3）利用PCR获取和扩增目的基因 ①DNA复制所需的基本条件:
参与的组分
解旋酶（体外用高温代替） DNA母链
4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
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螺旋、紧密折叠地装配在头部中。T4基因组rII区域有2个
基因rIIA和 rIIB，这2个基因突变均表现为快速溶菌，这
种快速溶菌突变型的生长对大肠杆菌的不同品系具有选择
性：突变型若感染E.coli C菌株，可以形成大而透明的噬
菌斑，因此将E.coli C菌株称为受纳性寄主；突变型若感
染E.coli K菌株，则不能复制其DNA,因此不能形成噬菌斑，
▪ HA平板9块（效价测定用5块） ▪ HSA试管 3mL x 9只 ▪ 20l、200l移液器各一支，Tip ▪ 48 oC水浴
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四．实验方法和内容
（一）噬菌体T4裂解液的制备▪ 1．双层平板法制备裂解液 ▪ （1）将E.coli C接种3mL HB中，37℃ 震荡培养5—6小时。 ▪ （2）制备HA平板，待凝固后置50℃ 烘30分钟备用。
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导语
▪ 自从1917年发明在平板上观察噬菌斑（plaque）的方法后 一直延续至今，噬菌体浓度的测定也是通过计数噬菌斑的 多少。100个细菌在平板上会形成100个菌落，若108个细 菌在平板上会融合在一起形成一个浑浊层，称为“lawn”， 为使菌体能形成均匀的一层，首先将细菌混合在少量热的 液体琼脂中，然后倒在固体平板的上层，这一液体琼脂称 为Top agar或 Soft agar，它会迅速凝固形成一个光滑的表 层，细菌在这一薄层中会长得非常均匀。如果有1个噬菌体 存在，它将会感染细菌，随后被感染的细菌裂解后释放 100～200个子代噬菌体，它们又去感染附近的细菌，如此 延续下去几个小时，噬菌体就会把这一区域的细菌全部吃 光，在浑浊均匀层上形成一个清晰透明的洞，称为plaque, 因为1个噬菌体形成1个plaque，故噬菌体的浓度便可以计 算出。噬菌体的浓度单位称为噬斑形成单位，表示： PFU/mL。
基因突变，影响的不是同一功能。
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导语
▪ T4噬菌体是一类专性寄生的原核生物，
只能在寄主细胞内繁殖。噬菌体比细菌繁 殖速度快得多，典型的细菌一般在30min 内由1个变为2个，而1个T4噬菌体在相同 的时间内可以形成将近100个左右的子代 噬菌体，因此2h后当细菌和噬菌体都繁殖 了4代时，细菌的数目是24＝16，而噬菌 体的数目却是1004＝108！
因此将 E.coli K菌株称为限制性寄主。S.Benzer巧妙地
利用这一特点设计了经典的互补实验，首次证明顺反子
（Cistron即基因）是一个必须保持完整才具有正常生理
功能的遗传物质最小的功能单位。一个基因或一个顺反子
是一个完整的结构，所以属于同一基因的两个突变型不能
互补，如果两个突变型能够互补，就说明它们属于不同的
所占的区域称为顺反子A，一系列rIIB突变型在染色体上所占
的区域称为顺反子B，由于rII突变型均为点突变，故实验中
必须要有检测回复突变的对照。
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三、实验材料和用具
▪ 菌种：E.coli C(受纳性寄主)和 E.coli K （限制性菌株）过夜培养物
▪ T4 rII突变型26，28，29：点样浓度为 1x108/ml,倒平板浓度为1x109/ml
▪ （3）取小试管一只，加0.5mL菌悬液，加0.2mL浓度为105～ 106的 T4储存液，再加入3mL 50℃ 左右的HSA（软琼脂培养 基），混合均匀后倒在HA平板上层，凝固后37℃培养过夜。
▪ （4）用涂棒 将HA平板上层软琼脂刮入离心管，加入3mL HB， 静置30分钟，加2—3滴氯仿，剧烈震荡半分钟。
▪ （5）4000 rpm 离心15 min，取出上清液，加几滴氯仿，4℃
冰2箱020保/12/存10 备用。
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（一）噬菌体T4裂解液的制备
▪ 2．液体法制备裂解液
▪ （1）将E.coli C 接种3mL HB中， 37℃ 震荡培养2~3小时。
▪ （2）加入1%体积的 T4储存液（或单噬 斑1个），继续震荡培养5小时，一般应测 OD600 值，当OD值下降又回升时停止培 养。
▪ 将一系列表型相同的rII突变型,双双混合感染限制性宿主进行
互补实验，全部 rII突变型可以区分为 rIIA和rIIB两个互补群，
同属于rIIA或rIIB的两个突变型在混合感染中没有互补作用，
任何一个rIIA突变型和任何一个rIIB突变型在混合感染中都有
互补作用，使表型恢复正常。一系列rIIA突变型在染色体上
微生物遗传部分
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实验四、T4噬菌体基因组rII 区域不同基因突变的互补
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导语
▪ T4是研究得最深入的一类大肠杆菌烈性噬菌体，其基因
组是双链线性DNA分子，约有1.7x105碱基对，编码的蛋
白质超过135种。T4基因组的两端具有约3～6kb的正向重
复序列，全长比其头部长650倍，意味着T4 DNA是高度
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一、实验目的
▪ 通过实验了解基因互补的原理，并确定几 个T4快速溶菌突变型是否属同一基因突变。
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二、实验原理
▪ 将2个不同的T4 rII突变型共同感染限制性寄主E.coli K菌株, 若2个突变的噬菌体不是影响相同的功能,则可表现互补使其 各自的DNA在E.coli K菌株中得以复制,在复制过程中相互重 组,进而形成了野生型的噬菌体, 野生型的噬菌体经反复感染 和裂解限制性寄主,便可形成清晰的噬菌斑。
液0.1mL（10-6，10-7），每个稀释度两只试管， 再加入2.5mL HAS（50℃左右）， 混合均匀后迅 速倒在HA平板上层，凝固后，37℃倒置培养。 ▪ 培养6小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效 价。
▪ （3）加2~3滴氯仿，震荡半分钟， 4000rpm离心15分钟，取上清液加几滴氯 仿，置4℃冰箱保存备用。
2020/12/10
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（二）裂解液效价测定
▪ 将E.coli C 接种3mL HB中，37℃震荡培养5小时。 ▪ 制备HA平板，待凝固后置50℃ 烘30分钟备用。 ▪ 将T4裂解液依次稀释至10-7 。 ▪ 取一只小试管，加入0.2mL E.coli C，加入T4裂解