苏云金芽孢杆菌的毒蛋白

3.1.2 “伞状模型” ：
Li等人根据ICPs可能所共有 的三维空间结构提出了“伞模 型”。依照这个模型，α6和α7螺 旋或α4和α5螺旋形成一个发夹结 构，处在结构域Ｉ的边沿，最接 近于质膜。当其它的螺旋在膜表 面象伞架打开时，这一对螺旋将 比较容易插入脂双层膜，如图：
3.1.3 “α-5螺旋六聚体”模型： Gazit等分析了α5螺旋片段提出了一个新的修饰模型。作为“伞状模型”的 补充， “α-5螺旋六聚体”模型认为，由于α-5螺旋在所有的ICPs中都是高度保 守的，而且在体外它能够在平面脂双层膜上形成孔道，因此认为α-5螺旋可通过 一个六聚体形式，即α-5螺旋的亲水侧向内，亲脂侧向外组成一个亲水离子通道， 镶嵌在脂双层中间形成离子通道。
4.1 Cry1Aa蛋白结构，β18- β19loop及与其相邻的残基
4.2 Cry蛋白中β18- β19loop的结构与苏云金芽孢杆菌的毒素蛋白
1.Bt毒素蛋白质简介 2.部分Bt毒素蛋白的结构模型
3.Bt毒素蛋白质的结构域
4.Bt毒素肽序列与三维球棍结构
1.1 编码杀虫晶体蛋白的基因在苏云金芽胞杆菌表达产生的Bt杀虫晶体蛋白， 以一种前体的形式存在于菌体内，称为原毒素(Protoxin)，能自发形成伴胞晶 体。晶体的形成可能在一定程度上防止了杀虫蛋白在环境中的降解。不同种 类的杀虫晶体蛋白可以存在于同一块伴胞晶体中。这些伴胞晶体通常有一定 的几何形状，一般规律是Cry1类型形成双锥形的晶体；Cry2类型一般形成立 方型的晶体；Cry3基本上形成菱形的晶体；其他种类的杀虫蛋白还可形成其 他的晶体形状，如卵形、等。
1.2 近年来，不断发现的杀虫晶体蛋白及其基因使得原先分类系统中的氨基 酸序列与杀虫活性间产生了不协调性，而且随着新基因的发现，这种分类方 法越来越不能满足这两个条件，使得分类难以确定。 截止2007年4月2日,这些基因按其核苷酸序列的同源性已被分为cry1cry51、cyt1、 cyt2共53类, 396种, cry基因372种,cyt基因24种
1.3 很多试验表明,Cry1Ac、Cry1Ab 和Cry1Aa 等都可以与某些昆虫的受体类钙 粘蛋白结合。这几种毒素的同源性很高,因此不难理解它们有共同的受体。竞争 性配体结合试验结果表明,它们一般在受体类钙粘蛋白上共享同一结合位点,但不 完全重叠。抗性测定试验也表明,昆虫对这3 种毒素一般具有较强的交互抗性。
3.4 三个结构域之间的相互作用
研究显示,Bt 毒素的不同结构域在一定程度上互相作用,互相影响。常用的研究 方法是对某结构域进行突变。例如,结构域Ⅰ的突变影响与受体的结合,结构域Ⅱ的 突变能在不影响与受体结合的情况下影响其毒力,Cry3A 的结构域Ⅱ上环3 发生突变 降低了亲和力却增加了毒性,结构域Ⅲ的一段保守区域发生突变能影响毒力和孔道形 成。 同时,还可以通过交换各个毒素蛋白的各个结构域的编码区，表达杂合蛋白基因， 分析杂合毒素蛋白的功能，从而阐明毒素结构域之间的相互作用。
3.2 结构域Ⅱ：
位于肽链的中间，为三组以“希腊钥匙”（Greek key）拓扑结构连接在一 起的反平行的β折叠片层，具顶端突环，该凸环在不同的毒素中，其长度和氨基 酸序列不同，参与了毒蛋白与受体蛋白的结合，决定着毒素作用于昆虫的特异性。 结构域Ⅱ是最容易在长度和氨基酸序列上发生变化的区域。
3.3 结构域Ⅲ： 位于C端，是由两组反平行的β折叠片层组成的夹心结构，以“果酱卷” （Jelly roll）拓扑结构排列。其功能目前了解较少。 有人推测其可能能够防止蛋 白酶对晶体蛋白分子的过度降解，稳定晶体蛋白整体结构，决定杀虫晶体蛋白专 一性。有证据显示其与维持蛋白结构的稳定性、通过与结构域Ⅰ接触调节离子通 道的电流以及特异受体的识别和结合有关。
2.2 大部分的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因各编码含一个60kD左右的胰蛋白酶 抗性中心，分子量为130-160kD的蛋白。晶体蛋白中杀虫活性部分位于晶体蛋白N-末 端的胰蛋白酶抗性中心, 而C-末端对于维持蛋白的晶状结构具有非常重要的作用。 目前已通过多对同晶置换法X-衍射晶体图谱确定了一些晶体蛋白的三维结构，湖 南师范大学 生命科学学院的微生物分子生物学研究室利用同源建模的方法获得了 Cry5Ba的理论三维模型。与确定三维结构的晶体毒素进行比较，发现它们的三维结 构很相似，都是由三个典型的结构域组成拓扑学结构。
2.3 对Cry毒素结构和功能的的研究离不开一些常用的生物信息学软件，例如 Swiss-PdbViewer， Pymol。
Cry5Ba
Cry1Aa
I
III
II
Swiss-PdbViewer显示Cry蛋白三维模型
Pymol显示Cry蛋白三维模型
Molsoft预测cry蛋白活性位点
3.1 结构域Ⅰ 3.1.1 位于肽链的N 端,是一组由6-7个两亲的α螺旋围绕着一个疏水的α螺旋形成 的α 螺旋束，参与了细胞膜的穿孔。人们利用蛋白质及脂膜相互作用的生物化学原 理，通过对多个毒素蛋白三维结构比较和功能分析，并提出了如下模型： “铅笔刀”模型： 该模型由Hodgman提出。该模型被 认为α5螺旋和α6螺旋最可能是孔形 成的结构单位，这是完全基于亲水 脂螺旋的疏水表面积来推测的。α5 螺旋和α6螺旋连在结构域Ｉ的端点， 离膜最远。因此，在作用于膜时， 这两个螺旋必须象打开的铅笔刀一 样从结构域Ｉ中伸出，插入脂双层 膜。这样一个模型不需要结构域Ｉ 中其它α螺旋的重排，一个亲水离子 通道将由多个毒素分子寡聚体通过 相同的作用方式排成一个圆而形成， 如图：
1.4 Morin 等报道棉红铃虫( Pectinophora gossypiella) 对Cry1Ac 的抗性(抗性 比值为3100 倍)与受体类钙粘蛋白基因编码区的3 个缺失突变位点( r1 , r2 和r3) 有关。每一个缺失突变至少导致毒素结合区域的上游缺失8 个氨基酸残基。含两 个突变位点( r1 r1 , r1 r2 , r1 r3 , r2 r2 , r2 r3 , 或r3 r3) 的昆虫具有抗性,而含一个 突变位点( rs) 或不含突变位点( ss) 的昆虫为敏感个体。 上述试验结果同时表明,烟蚜夜蛾幼虫和棉红铃虫幼虫在中肠BBMV Cry1A 毒素受体氨肽酶N 正常存在的情况下,也可因受体类钙粘蛋白基因突变而产生极 高水平的抗性。由于抗性昆虫中Cry1A 毒素的其它受体仍然存在,高抗性昆虫的 BBMV 就可能与毒素发生特异性结合,只是有些情况下结合的毒素数量略有减少。 同时还提示有关受体氨肽酶N 的变化与Bt 抗性的关系仍需进一步研究。
2.1 Bravo 等以Cry1Ab 毒素与烟草天蛾为研究模式,获得了一系列突破性进展: 2002 年他们发现,结合到Bt2R1 的Cry1Ab 毒素还会被BBMV 上的蛋白酶进一步水 解,去除大小约3kD 的α21 螺旋,然后聚集形成四聚体结构。Cry1Ab 的低聚体有毒 杀烟草天蛾的活性,与Cry1Ab 毒素单体不同,低聚体能在膜上形成稳定的“孔”[