细胞毒性实验方案

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细胞毒性实验设计方案1.胰酶双抗( 青霉素/ 高DMEM( 糖)

链霉素）DAPI

准备材料：MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 指甲油6 孔培养板多聚甲醛培养瓶(25mL) 96 孔培养板超薄载玻片一包0.45

滤膜m μ灭菌：50mL ，10mL，5mL离心管两种枪头2. 实验方案

材料本实验所用的为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅

（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时

SiO2-本实验的夹心二氧化硅中药物得以释放。目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（，SiO2-SS-HA

SiO2-SS-HA/DOXSS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为、、DOX

成纤维细胞为正常人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和分别采用, HepG2 L929空白对照组为纯细胞细胞模型。

SiO2-SS-HA/DOX、HepG2 人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为采用

1%(w/v) DOXSiO2-SS-HA、，空白对照组为纯细胞。10%(v/v)

培养基中含有FBS和

、、。配制不同浓度的链霉素青霉素双抗( / ) SiO2 -SS-HA/DOXSiO2 HA药物载、DOX

体培养基溶液。

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HepG2以人肝癌细胞为肿瘤细胞模型(1).

12% DMEM 87%

1%

血清培养基的配置：双抗

具体操作步骤：

细胞的复活：

℃温水中，使细胞快速溶解。②将悬浮的细①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37 无血清培养基，5mL 胞移至离心管中，加1000rmp,5min 离心

（每次转移时，将之前的离心管洗涤，5mL去上清，再加有血清培养基，转移至培养瓶中。并用移液枪来回吸，使液

体混合均匀。）

③将培养瓶放入培养箱中培养。

细胞的传代：

℃，每次使用一管，避的胰酶分装至小离心管中，0.25%将，冻存于2mL每个管中-20

免反复冻融。

的酒精放入超净台。②将培养液倒入废液75%①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷缸，操作完成后，残留培养基用吸管吸干净，培养瓶口---

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用火烧。

③加入2mL 胰酶将瓶底铺满，消化2-3min ，于显微镜

下观察细胞形态，呈

2mL 12% DMEM终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。圆形，即消化完毕，加入

离心。⑤迅速倒掉上清，加入10mL离心管中，

1000rmp,5min, ④将细胞悬浮液移入6mLDMEM培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入

培养箱中培养48h。，于37℃，5%的CO22mLDMEM，至5mL

- ⑤。⑥下一次传代步骤同①

：细胞存活率测定方法（布板，加样）

④。①同传代步骤①-

并用移液枪来回吸，使液体混合均匀，将所有含②给每个离心管中加入定量的培养基，

有细胞的培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为30mL。

个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含③96 孔板中每个浓度设计5

细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空白调零孔，每孔加入，5% (v/v) CO 2 L 含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，100μ22 小时。温度保持在37℃，培养

微升的0.03g ④将谷胱甘肽加入到10mL培养基，充分溶解，浓度为0.003g/mL, 取2

0.003g/mL 谷胱甘肽溶液加入到10mL的培养基中，将这两个浓度含谷

胱甘肽的培养基替换部分原来的培养基，作为对照，不需要加谷胱甘肽的孔换上

5% (v/v) CO 2，温新鲜培养基，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，

小时，具体的加样孔见图一。2 度保持在37℃，培养

的培养基中，分成两份，其中3mL样品溶到SiO2

-SS-HA/DOX 1.2mg ⑤将的

的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，1.5mL 一份里加入其中一份

SiO2-SS-HA/DOX样新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的加入1.5mL

品。SiO2-SS-HA 样品的浓度配制方法同上。

的0.918mg ⑥将SiO2-SS-HA/DOX的培养基中，剩下的步骤同样品溶到3mL

⑤。

所示。将孔板放入培养箱孔板中的培养基，如图96 1 ⑦将配制好的载体溶液替换原来37，温度保持在℃，培养5%(v/v) CO2中，培养箱保持一定的湿度，

24小时。

5 mg/mL ⑧配制的溶液，将孔板中的培养更换成MTTMTT溶液，将孔板放---

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入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO 2，温度保持在37 ℃。培养4 小时后，

将孔板中的培养基取出，用PBS溶液清洗3 次，然后向每孔加入100 μL 的DMSO，溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为490nm

图1 药物载体布板示意图

⑵. 以L929 成纤维细胞为正常细胞模型:

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实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。实验目的为测定药物载体溶液对正常细胞的细胞毒性。

培养基的配置：双抗1%

血清12% DMEM 87%

具体操作步骤：

细胞的复活：

℃温水中，使细胞快速溶解。②将悬浮的细37①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入离心胞移至离心管中，加

5mL 无血清培养基，1000rmp,5min

（每次转移时，将之前的离心管洗涤，去上清，再加5mL 有血清培养基，转移至培养瓶中。

并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。）

③将培养瓶放入培养箱中培养。

细胞的传代：

℃，每次使用一管，避2mL，冻存于-20 将0.25%的胰