酶联免疫吸附测定法基本步骤
酶联免疫吸附测定法基本步骤
酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。其基本步骤包括固相化免疫反应、酶标记物检测、底物显色和测定结果的分析。
一、固相化免疫反应
固相化免疫反应是ELISA的第一步，通常使用微孔板作为固相载体。首先，在微孔板的孔中添加特定抗原或抗体，使其与孔壁结合形成固相。然后，将孔中的非特异性结合位点封闭，以防止后续步骤中的非特异性结合。此步骤旨在固定待测物质，使其能够与特异性抗体发生免疫反应。
二、酶标记物检测
酶标记物检测是ELISA的关键步骤之一。在这一步骤中，将与待测物质特异性结合的酶标记物加入孔中，并与待测物质发生免疫反应。酶标记物可以是酶抗体复合物，也可以是酶标记的抗原。典型的酶标记物有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。该步骤的目的是通过酶标记物的存在来检测待测物质的存在和浓度。
三、底物显色
底物显色是ELISA的关键步骤之一，用于检测酶标记物的存在。在
这一步骤中，将适当的底物加入孔中，与酶标记物发生化学反应。底物的选择取决于酶标记物的类型，常见的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）和pNPP（对硝基苯磷酸盐）。化学反应的产物可呈现颜色变化，例如TMB底物在酶的作用下会变成蓝色。颜色的强度与酶标记物的浓度成正比，从而可以间接反映待测物质的存在和浓度。
四、测定结果的分析
测定结果的分析是ELISA的最后一步，通过测量底物显色反应的光密度来定量分析待测物质的浓度。通常使用酶标仪或分光光度计来测量吸光度，并将所得数据进行处理和分析。根据标准曲线，可以将吸光度值转化为待测物质的浓度值。ELISA的结果可以是定性的（阳性或阴性），也可以是定量的（浓度值）。
总结：
酶联免疫吸附测定法是一种常用的生物化学分析技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。其基本步骤包括固相化免疫反应、酶标记物检测、底物显色和测定结果的分析。通过这些步骤，可以检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度，广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物开发等领域。ELISA技术的发展和应用将为人类健康和科学研究做出重要贡献。
酶联免疫吸附测定法基本步骤
酶联免疫吸附测定法基本步骤 酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种常用的生物分析技术，主要用于检测生物样本中特定物质的含量。下面将介绍ELISA的基本步骤，包括固相吸附、样品处理、标记物结合、洗涤、底物反应和测定。 1. 固相吸附 酶联免疫吸附测定法首先需要在固相载体上固定特异性抗原或抗体，常用的固相载体有微孔板、磁珠等。将固相载体涂覆抗原或抗体溶液，并在适当的条件下使其吸附在载体表面。这样就形成了固定的抗原或抗体层，用于捕获待测物质。 2. 样品处理 待测样品需要经过一系列处理步骤，以提取或预处理目标物质。这些处理步骤可能包括稀释、加标、离心、洗涤等，以确保样品中目标物质的浓度适宜并且不受其他干扰物质的影响。 3. 标记物结合 经过样品处理后，将待测样品加入固相载体中，并与固定的抗原或抗体发生特异性结合。这样，目标物质就被捕获在固相载体表面上。同时，将与酶结合的二抗或标记物加入到样品中，与待测物质发生结合。标记物可以是酶、荧光物质等，用于标记目标物质的存在。 4. 洗涤
为了去除非特异性结合的物质，需要进行洗涤步骤。通过加入缓冲液并用洗涤缓冲液冲洗固相载体，可以有效去除未结合的物质。洗涤的次数和冲洗的条件可以根据实验要求进行调整，以获得最佳的检测结果。 5. 底物反应 在洗涤后，加入底物反应液。底物与酶结合形成的标记物发生反应，产生可观测的信号。这个信号可以是颜色变化、荧光发射或发光等，用于定量或定性分析目标物质的含量。 6. 测定 使用光谱仪器或其他检测设备测量底物反应产生的信号强度。根据信号强度的大小，可以计算出待测样品中目标物质的浓度或存在与否。 总结： 酶联免疫吸附测定法是一种灵敏、特异性强的生物分析技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究等领域。其基本步骤包括固相吸附、样品处理、标记物结合、洗涤、底物反应和测定。通过这些步骤的有序进行，可以实现对目标物质的高效检测和定量分析。酶联免疫吸附测定法在生物医学领域的应用前景广阔，有助于加深对疾病机制和生物过程的理解，为疾病诊断和治疗提供有力的支持。
elisa的检测原理及步骤
elisa的检测原理及步骤 ELISA也就是酶联免疫吸附法，是常见的一种免疫学实验技术，广泛应用于疾病诊断、药物检测和基因工程等多个领域。下面对该检测方法的原理和步骤进行详细介绍。 一、原理 ELISA是一种通过酶标记在特定抗原-抗体反应后，通过测定酶活性或者荧光强度来检测特定抗体或抗原的方法。具体原理包括以下几个方面： 1.抗体/抗原的孕育：为了进行ELISA检测，首先需要制备抗体或者抗原，在抗原的孕育过程中，一般采用细胞、细胞质、蛋白质、肝炎病毒核心抗原、抗体等作为抗原。 2.抗原加到板上：将抗原添加到检测板上，用于捕获待测样品中的特定抗体/抗原。 5.辣根过氧化物酶标记抗体加入：将与辣根过氧化物酶标记的抗体加入到检测板上， 抗体与待测样品中的抗原结合。 6.底物加入：将底物（可以是苯基乙酸和过氧化物的混合物）加入到检测板上，通过 酶标记抗体加强底物的催化，产生颜色。 7.读板：用酶标记抗体催化反应的底物生成的颜色强度，表示样品中的相应抗体或抗 原的含量。 二、步骤 ELISA步骤如下： 1.制备捕获抗体：制备捕获抗体，将其吸附到检测板上。 2.将样品加入检测板：向检测板添加待测物质，例如蛋白质或者抗体。 3.洗涤步骤：用缓冲液冲洗检测板上的非特异性结合物质，以减少假阳性反应的出 现。 4.加入探针抗体：加入与待测物质特异性结合的酶标记抗体。 6.底物加入：加入底物，让酶标记物质生成颜色。 7.读板：对反应所生成的颜色进行测量，例如比色法或者发光法等。 三、总结
ELISA检测具有以下优点：非常准确、灵敏性高、易于操作、可产生准确可靠的结果等。其通过测定酶活性成分的存在，展示了其在生物医学领域中的重要应用，帮助人们更好地理解生物分子，并依据该理解开展诸如疾病诊断、药物检测和基因工程等工作。
酶联免疫吸附试验检间接法测igg抗体步骤
酶联免疫吸附试验检间接法测igg抗体步骤 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IgG抗体的间接法步骤如下： 1. 预处理样本：样本可以是血清、血浆或其他生物体液。需要将其离心或过滤去除杂质，并稀释至适当的浓度。 2. 涂覆板子：将抗原（通常是蛋白质）溶解在缓冲盐溶液中，涂覆在96孔板的孔中。将板子放置在4℃冰箱或室温下，有时还需要在孔中加入牛血清白蛋白（BSA）来防止非特异性吸附。 3. 封孔：将板子放在37℃恒温箱中进行2小时封孔，封孔溶液就是用BSA等蛋白质密度较大的液体形成的层，防止样本的IgG抗体直接贴附到孔壁上造成假阳性结果。 4. 添加稀释的样本：加入稀释后的样本到96孔板的各个孔中，并在恒温箱中孵育1小时，让IgG抗体与涂有抗原的板子结合。 5. 洗涤：去除非特异性吸附，将96孔板上多余的物质洗掉。有时需要经过多次洗涤来确保洗涤干净。 6. 加入检测抗体：向96孔板的各孔中加入识别IgG抗体的酶标记二抗，如兔抗人IgG-HRP。这种二抗分子完全地结合到原先样本中的IgG抗体上，好比一
个钩子勾着另一个东西。 7. 再次洗涤：洗掉任何没有连接到IgG抗体的酶标记二抗。 8. 加入底物：加入足够的酶标记底物，恒温孵育一定时间，观测形成的颜色变化。酶标记的酶分子会氧化底物，生成显色的产物，如TMB HRP底物。 9. 终止反应：过多地加酶底物会引起酶反应过程的不可逆转，产生饱和效应，不能单纯地用眼看颜色深浅。所以，加入适当类型的液体停止反应，最常用的停止剂是盐酸。 10. 测定光密度：用ELISA分析仪读取各表格的光密度。 11. 分析数据：将各样本的光密度计算出来并比较参比标准，根据公式计算IgG 抗体的相对含量。 需要注意的是，ELISA检测IgG抗体的间接法可以很好地确定是否发生了特定病原体的感染，但不能确定感染的病程时间或某个时刻的IgG抗体水平。此外，某些药物、疫苗等因素可能对结果造成干扰。
酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附（ELISA）实验具体步骤及详细说明 酶联免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位。（2）研究抗酶抗体的合成。（3）显现微量的免疫沉淀反应。（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。 本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。 具体步骤 一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。 二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。 三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。
四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。 五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。 六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。 七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。 八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。 九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。 注意事项 1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法 肝纤维化指标的检测一直以来都是肝脏疾病的重要检测项目之一，主要包括肝纤维化指标α2-MG和ALT等，其中，酶联免疫吸附测定法（ELISA）已经成为肝纤维化指标检测的首选方法。 酶联免疫吸附测定法是一种利用特异性抗原抗体对特异宿主物质（如肿瘤酶，血清蛋白等）的特异性结合作用，再用活性抗体对特异物质的抗体进行检测，从而测定样品中某特异物质的浓度的实验技术。 酶联免疫吸附测定法的实验流程主要分为七个步骤。摘要： 第一步：将 Elisa 的板子放在石英培养皿里，用微量移液器从管内取出特异宿主物质（如肿瘤酶，血清蛋白等），将其缓慢移液至 Elisa 板子上（有多种不同形式的Elisa 板，根据測试物质的种类和浓度来决定板子的类型），使得每个池中均有特定数量的特异宿主物质。 第二步：用抗宿主物质抗体制备样品，将样品中的宿主物质与板中的宿主物质结合，产生免疫复合物。 第三步：用抗免疫复合物抗体，将免疫复合物增强，更好地复合到抗体上。 第四步：在抗免疫复合物抗体与免疫复合物的结合上加入适量的碳酸钠溶液，将特异宿主物质从免疫复合物中沉淀出来。 第五步：在强酸性溶液中，将沉淀出来的特异宿主物质，用标准物质进行校准，以确定当前特异宿主物质的浓度。 第六步：加入酶襵显剂，将样品中的特异宿主物质評估出来，再将其与标准物质的浓度做比较，可以得出结果。 第七步：通过计算、整理得出最终结果。 总之，酶联免疫吸附测定法是一种可靠而且高效的肝纤维化指标检测方法，其简便易行的实验流程、灵敏度高和结果准确精确。应用范围广，且常用于癌症诊断，肝纤维化活性变化诊断，以及肝纤维化指标的检测等等。
酶联免疫吸附试验检间接法测igg抗体步骤
酶联免疫吸附试验检间接法测IgG抗体步骤 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的实验技术，用于定量或定性检测特定抗原或抗体。其中，酶联免疫吸附试验检间接法是一种用于检测IgG抗体的常用方法。本文将详细介绍酶联免疫吸附试验检间接法测量IgG抗体的步骤。 步骤一：制备诊断试样 首先，我们需要获得待测的诊断试样。这可能是一种血液样品，如血清或血浆。需注意的是，样本应严格遵循安全操作规程进行采集和储存。 步骤二：涂覆固相抗原 在这一步骤中，我们将使用具有高亲和力的抗原（可能是蛋白质或多肽）来涂覆固定在试验板上的固相。常见的抗原固相材料有微孔板或磁珠。涂覆过程包括以下几个步骤： 1.准备1x涂层缓冲液，pH值通常在8.0-9.0之间。加入适量的缓冲液到微孔 板的孔中，使每个孔完全涂覆。 2.在每个涂层孔中加入一定浓度的抗原。一般来说，我们可以通过实验确定最 佳的抗原浓度。孔中的抗原应覆盖整个孔底，并允许在温和的条件下孵育一 段时间，以实现抗原的吸附和固定。 3.抗原吸附完成后，将板孔转至4℃的冰箱中，在适当的条件下储存板孔，以 防止抗原降解。 步骤三：阻断非特异性结合位点 在进行酶联免疫吸附试验时，我们希望检测到的信号仅来自于特定的抗体与抗原结合。然而，试样中存在的非特异性成分可能与固相抗原结合，导致干扰或错误结果。因此，在进行特异性结合之前，我们需要阻断非特异性结合位点。这一步骤的目的是减少背景信号。 1.将非特异性结合位点涂覆孔中的样品排除。 2.溶液的组成可以包括蛋白质、牛血清白蛋白（BSA）或牛血清。 3.将阻断溶液加入涂覆孔中，孵育一段时间以实现充分的结合。 4.之后，将孔排空，可用洗涤缓冲液冲洗孔。
酶联免疫吸附试验过程
酶联免疫吸附试验过程 一、什么是酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的免疫学检测技术。它通过利用酶标记的抗体或蛋白质与待测物或已知的抗原/抗体结合反应，在底物的作用下产生可定量检测的颜 色反应，从而确定待测物的含量。 二、酶联免疫吸附试验的基本原理 酶联免疫吸附试验主要涉及以下几个关键步骤： 1. 固相抗原/抗体的固定 将待测物（如抗原或抗体）吸附于固相材料（如微孔板或磁珠）表面，形成固定点。一般采用非特异性吸附（如通过静电相互作用或亲和力学吸附）将蛋白质固定于固相材料上。 2. 样品或标准品的加入 将含有待测物的样品或已知浓度的标准品加入至固相材料上，使待测物与固相抗原/抗体产生特异性结合。 3. 特异性抗体的结合 加入与待测物特异性结合的酶标记抗体（如HRP标记的抗体），使其与待测物（抗原或抗体）形成复合物。 4. 用底物发生化学反应 加入底物（如TMB或ABTS）作用于酶标记的抗体，使其发生特异性的化学反应， 产生可定量检测的颜色反应。
5. 反应终止 通过加入反应终止剂（如酸溶液或碱溶液）停止底物的反应。终止后，颜色反应的强度与待测物的浓度呈正相关。 6. 光密度的测定 使用酶标仪或分光光度计测定底物发生反应后的光密度值，通过比较标样/标准曲线，确定待测物的浓度。 三、酶联免疫吸附试验的优点和应用 酶联免疫吸附试验具有以下优点： 1.高灵敏度：能够检测到非常低浓度的待测物，通常在ng/mL至pg/mL的范围 内。 2.高特异性：通过特异性抗体的配对，能够准确鉴定待测物与特定抗原/抗体 的结合。 3.高通量性：在微孔板上可以同时检测多个样品，提高了检测效率。 4.易操作性：试验步骤相对简单，不需要复杂的仪器设备。 5.可定量性：通过与标准曲线比较，能够准确测定待测物的浓度。 酶联免疫吸附试验在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用： 1.免疫学研究：可用于研究各类抗体的水平、亲和力、免疫反应动力学等，揭 示免疫系统的功能和机制。 2.生物药物研究与开发：可用于监测药物代谢过程中的抗体产生、血药浓度分 析等。 3.临床诊断：可用于检测病毒、细菌、药物、激素等在人体内的水平，辅助诊 断和治疗监测。 四、酶联免疫吸附试验的改进和发展 随着科学技术的不断进步，酶联免疫吸附试验不断改进和发展，出现了许多衍生的技术和新方法： 1.双抗体夹心法（sandwich ELISA）：通过同时使用两个特异性抗体，将待测 物“夹”在抗体的中间，提高了检测的特异性和灵敏度。 2.反应物固定法（direct ELISA）：将待测物直接固定在固相材料上，无需使 用第二抗体或酶标记抗体，简化了试验步骤。
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤 酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 实验步骤 1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟. 10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。 12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/
酶联免疫的操作方法
酶联免疫的操作方法 酶联免疫是一种常见的免疫测定方法，常用于检测抗原或抗体的存在和浓度。其操作方法如下： 1. 抗原包被：首先，将待检测样品中的抗原加入到含有特异性抗体的孔或固相载体表面，通过吸附或共价键结合的方式，将抗原固定在孔或固相载体上。这样做是为了使抗原与特异性抗体充分结合，形成抗原-抗体复合物。 2. 洗涤：将包被好的板子或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物，减少误差的发生。 3. 反应：将与抗原-抗体复合物结合的二抗（或识别抗体）加入孔或固相载体中，与复合物发生特异性结合。该二抗预先被连接上与酶（通常是辣根过氧化物酶HRP）结合的分子，因此称之为辣根过氧化物酶标记的二抗。 4. 洗涤：将孔或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物。 5. 底物添加：将染色底物加入孔或固相载体中，底物在酶的作用下，发生可见的颜色反应。该底物通常是染色体底物或亚硝酸4-硫酸钠。 6. 反应停止：通过加入酸或碱，停止底物的反应，并阻止底物继续发色。
7. 反应评估：测量底物反应产生的颜色强度或发光强度，使用光度计或发光仪等设备进行测定。 酶联免疫方法优点如下： - 高灵敏度：酶标记可提供较强的信号，使检测到的目标物浓度可达到可靠的程度。 - 特异性：通过使用具有特异性的抗体或抗原，酶联免疫能够准确检测目标物。- 简单易行：操作相对简单，无需复杂的实验条件和设备。 - 可量化：根据底物反应的强度，可以定量测定目标物的含量。 - 高通量：酶联免疫可同时处理多个样品，提高工作效率。 然而，酶联免疫也有一些局限性，例如： - 检测范围受限：传统的酶联免疫方法通常只能在较低至中等浓度范围内进行可靠的检测，对于高浓度的目标物可能不敏感。 - 受干扰物影响：某些样品中可能含有干扰物质，如脂质、乳糖、硫醇等，它们可能影响酶的活性或干扰底物的测定。 - 特异性限制：一些高度相似的抗原或抗体可能导致交叉反应，从而降低特异性。 总的来说，酶联免疫是一种常用的免疫测定方法，通过将抗原或抗体固定在固相载体上，并利用酶的催化反应使其产生可见的颜色或发光信号，从而实现对目标物的检测和定量。该方法操作简单，具有高灵敏度、特异性和可量化等优点，广
组织elisa步骤
组织elisa步骤 一、简介 ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体在生物样本中的存在量。ELISA具有高灵敏度、高特异性和较低的成本，广泛应用于医学、生命科学和生物技术领域。 二、实验原理 ELISA的原理是利用酶标记的抗体或抗原与待检测物相互结合，通过酶的催化作用使染色底物发生可见的颜色反应，从而间接或直接测定待检测物的含量。ELISA可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等多种形式。 三、实验步骤 1. 准备实验材料：包括酶标板、洗涤缓冲液、试剂盒中的各种试剂、待检测物样本等。 2. 涂覆抗原或抗体：将待检测物的抗原或抗体溶液加入酶标板孔中，使其吸附在孔壁上，形成抗原或抗体的固相。 3. 阻断非特异性结合：加入阻断缓冲液，阻断酶标板上的非特异性结合位点，减少假阳性结果。 4. 加入标记抗体或抗原：将与酶标记的抗体或抗原溶液加入酶标板孔中，使其与待检测物结合形成复合物。 5. 洗涤：用洗涤缓冲液反复洗涤酶标板孔，去除未结合的抗体或抗
原。 6. 加入底物：加入底物溶液，使酶催化底物发生可见的颜色反应。 7. 反应停止：加入反应停止液，停止底物的反应，防止颜色的进一步发展。 8. 检测结果：使用酶标仪或目视观察，根据颜色的发展程度判断待检测物的含量。 四、实验注意事项 1. 实验操作应严格按照实验步骤进行，避免交叉污染和误操作。 2. 实验室环境应保持清洁、整齐，并避免灰尘和杂质的干扰。 3. 实验材料和试剂应符合质量要求，并按照规定保存和使用。 4. 实验过程中应控制实验温度和时间，以确保实验结果的准确性和可靠性。 5. 实验结果应根据标准曲线或参照值进行解读，避免主观判断和误判。 五、实验结果分析 根据实验结果，可通过比较待检测物样本与标准曲线或参照值的相对浓度，来定量分析待检测物的含量。ELISA的结果通常以光密度或颜色反应的强度表示，强度越高表示待检测物的含量越高。 六、应用领域 ELISA广泛应用于医学诊断、药物研发、生物技术等领域。在医学诊断中，ELISA可用于检测病原体、肿瘤标志物、药物残留等；在
免疫吸附法
免疫吸附法 免疫吸附法 概述 免疫吸附法（immunoassay）是一种利用抗体与抗原结合的特异性反应，检测物质的方法。它是一种常见的生物分析技术，广泛应用于医 学诊断、药物筛选、食品安全检测等领域。 原理 免疫吸附法的原理基于免疫学中抗体与抗原结合的特异性反应。该方 法通过将待测物质与标记有特定抗体或抗原的固相材料接触，使其发 生特异性结合，并通过检测标记物质的信号来确定待测物质的存在量。分类 根据检测方法和使用的标记物质不同，免疫吸附法可以分为多种类型，包括酶联免疫吸附法（ELISA）、放射性免疫分析法（RIA）、荧光免 疫分析法（FIA）等。
酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法是一种常用的免疫分析技术。它通过将待测物质与标记有特定抗体或抗原的固相材料接触，使其发生特异性结合，并通过检测标记物质的酶活性来确定待测物质的存在量。 步骤 酶联免疫吸附法包括以下步骤： 1. 固相涂布：将抗体或抗原与固相材料（如微孔板）接触，使其吸附在固相材料表面。 2. 标记反应：将待测物质与标记有特定抗体或抗原的标记物质接触，使其发生特异性结合。 3. 洗涤：用缓冲液洗去未结合的标记物质和其他非特异性结合物质。 4. 反应检测：加入适当的底物，使标记物质发生可检测的酶反应，并通过光度计等设备检测反应产生的信号强度。 优点
酶联免疫吸附法具有以下优点： 1. 灵敏度高：可以检测非常低浓度的待测物质。 2. 特异性强：通过特定抗体或抗原与待测物质发生结合，具有很强的特异性。 3. 可自动化操作：可以通过机器自动完成操作，提高检测效率和准确性。 应用 酶联免疫吸附法广泛应用于医学诊断、药物筛选、食品安全检测等领域。例如，可以用于检测病毒、细菌、药物残留等物质。 放射性免疫分析法 放射性免疫分析法是一种利用放射性同位素标记的抗体或抗原来检测待测物质的方法。该方法通过检测放射性同位素的放射线强度来确定待测物质的存在量。 步骤
酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明 酶联免疫吸附(ELISA )可以:(1)免疫酶染色各种细胞内成份的定位o(2)研究抗酶抗体的合成。(3 )显现微量的免疫沉淀反应。(4 )定量检测体液中抗原或抗体成份。 本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体Z经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合Z经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定Z底物降解的量即为欲测抗原的量。 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位,因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用Z而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS 的测定。 具体步骤 —、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1 ~ 10 ug /ml),每凹孔加0.3 ml , 4°C过夜Z或37。C水浴3小时,贮存冰箱。 二、洗涤：移去包被液Z凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20 )洗3次，每次5分钟。 三、每凹孑I J加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37°C作用1~ 2小时。
四、洗涤：移去包被液Z凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20 ）洗3次，每次5分钟。 五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液,37。C作用1 ~ 2 小时或由预试实验确定作用时间。 六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20 ）洗3次，每次5分钟。 七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔（OPD或OT）,室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）O 八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml o 九观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm ）OD值。 注意事项 L可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式,这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖甘、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELlSA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。 2.包被所用的抗原必须是可溶性的,而且要求是优质和稳定的制剂,纯度和免疫原性
酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序
酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序 第一节间接ELISA试验 一用可溶性抗原的ELISA： 1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml； 2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中； 3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h； 4、PBST洗三次； 5、每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h； 6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用） 7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清； 8、37（度）孵育2h 9、PBST洗5次，每次5min 10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP 标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体； 11、37（度）孵育2h 12、PBST洗5次，每次数5分钟； 13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul 14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD 底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；
16结果判定： （1）P/N≥2.1 为阳性 (2) P≥N+3SD 为阳性 成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。 二、用全菌抗原的ELISA法 （一）GA法 1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。 注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液； 2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时 3、蒸馏水洗5次; 4、加细菌悬浮液,50ul/孔; 5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h) 6、加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭； 7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用； 8、以下步骤同一。 （二）MA法 1、细菌悬液（1X10（6））50ul/孔；