焦磷酸测序地原理及引物设计
(医学PPT课件)pyrosequencing焦磷酸测序
Fast
Simple
Dedicated Software
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
3’TAAGCCGAATG
16
Multiplexing
SNPs located on different fragments…... …..or on the same
17
Principle of multiplexing
Design of sequencing primers and dispensation order
Single nucleotide InDels (e.g. [C]) Multiple nucleotide InDels (e.g. [CGACGGT])
11
CYP2D6 - A2637del (Allele 3)
T/T
Sequence (reverse) : TCC[ T ]GTG
T/-
3
ref
ref
2,5
2
1,5
1
0,5
0 TA GCT G CA CG AT G
18
User creates a SNP/ mutation sequence database
Software calculates theoretical genotyping results
Each DNA fragment is assigned a color
-/-
12
Large deletion
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平，而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。
正是在这样的历史背景下，焦磷酸光化测序技术（pyrosequencing）由瑞典研究人员发明。
焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于通过合成测序原理进行酶促反应的DNA测序方法，通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定，以及DNA甲基化水平变化的分析等。
近年来，随着摄影器材和成像技术的快速发展，这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光，因此，有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。
该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献，首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理，然后介绍该技术的应用，最后讨论其发展前景。
关键词：人类基因组计划; 焦磷酸光化测序; 基因变异; 基因型; DNA甲基化;Abstract：The Human Genome Project（HGP）not only greatly improved the understanding of human genome and related genetic information, but also promoted the development of technologies in life science research. It was under this historical context that pyrosequencing was invented by Swedish researchers. Pyrosequencing is a method of DNA sequencing based on the sequencing by synthesis principle with enzymatic reactions, and relies on light detection based upon a chain reaction when pyrophosphate is released. The application of this technology involved the detection of DNA nucleotide sequences and mutations, the identification of genotypes of single nucleotide polymorphisms, the analysis of changes in DNA methylation levels etc. With the recent rapid development of photographic equipment and imaging technology, this technology is expected to have an increasing sensitivity in signal detection. Based upon the working experiences in Sweden for nearly 30 years and accumulated literature, this review first clarified the basic principles of pyrosequencing, then introduced the applications of this technology, and finally discussed its development prospects in the near future.Keyword：Human Genome Project; pyrosequencing; genetic variation; genotype; DNA methylation;1 、引言本世纪是生命科学的世纪。
焦磷酸测序简介
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
-9-
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
- 10 -
Sample & Assay Technologies
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 30 -
Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 31 -
Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的 & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 25 -
Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
no970922forcpgandlongsequencingrunsemixenzymemixlyophilizedsmixsubstratemixlyophilizeddatps1200ldgtpdctpdttp660l1vialeachpyromarkq24advancedannealingbufferpyromarkq24bindingbuffer引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析仪器设备和试剂3加热器80金属浴振荡器1400rpmpcr仪及相应pcr管离心机24孔pcr板或管及其盖子超纯水182m或相当乙醇70移液枪多个量程的tip头无菌最好有滤芯引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计pyromarkassaydesignsoftware20引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计a菜单栏b分析窗口c分析纵览窗口d引物设置区e可变位点区abcde引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计引物设计pcrpyroq24adv测序的工作流程程序设计样品准备上机运行结果分析引物设计sampleassaytechnologiespcr延伸阶段相识却不同dntp不在反应体系内而是每次加一种互补则延伸并给一份光信号wehavejustseenwhatbelongstothepyrosequencingworkflowandhowtheprincipleofpyrosequencingworksintheory
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
焦磷酸测序名词解释
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
焦磷酸测序专题知识讲座专家讲座
Instrumentation
第6页
Pyrosequencing 系统平台
PyroMarkTM ID
Complete solution for Clinical Microbiology
Assay Design SW Sample Prep
Pyrosequencing
IdentiFireTM SW
Triple Double Single
T GG CC GGG T C A C G A GG CCC TA ...
1分子dNTP掺入，释放出1分子PPi，生成1分子ATP ，产生单位强度光信号
焦磷酸测序专题知识讲座
第29页
Pyrosequencing： Quantitative Accuracy Test
焦磷酸测序专题知识讲座
第33页
Pyrosequencing焦磷酸测 序系统卓越表现：
99.998% accurate
(based on analysis of 100,000 wells
with known genotype)
焦磷酸测序专题知识讲座
第34页
Integrated Software Package
C
T AG T A GA G
T/T
E
S
G
C
Байду номын сангаас
T AG T A GA G
C/T
Since Pyrosequencing shows polymorphisms
with sequence context, you can
always trust the validity of the
data.
E
S
G
基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]
![基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]](https://img.taocdn.com/s3/m/6f61366fb84ae45c3b358c72.png)
a/g C T G C C T A/G Heterozygote Single height ref peaks 单个高度的参考峰 Double height ref peak两倍高 度的参考峰
Genotype:基因型 2 half height peaks 两个半高峰
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only
- 15 -
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序流程
实验设计 测序 PCR 试样预处理， 获得单链模板
结果分析
1-2h /96 sample
SNP: 10min/96 sample SQA:35 min/96 sample 15 min/96 sample
Homozygous G 纯合子G
GCTGCCT --------CGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A
G
C
T
A
G
Heterozygous A/G 杂合子A/G
ACTGCCT --------TGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A G C T A G
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only -6-
Reference Peaks参考峰
Sample & Assay Technologies
Pyro技术原理
Pyrogram™ 的产生
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
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Pyrosequencing RCR
1.实验原理：焦磷酸测序采用生物素标记的引物进行PCR扩增，将PCR产物纯
化并变性为单链后，向其中加入四种酶的混合物：DNA聚合酶（合成DNA双链，释放dNTP的焦磷酸基团，释放出来的焦磷酸基团的量与和模板结合的dNTP的量成正比）、ATP硫酸化酶（在adenosine 5´ phosphosulfate存在的情况下催化焦磷酸基团形成ATP）、荧光素酶（在ATP介导下使荧光素转化为氧化荧光素，氧化荧光素能释放与ATP量成正比的可见光信号）及三磷酸腺苷双磷酸酶（降解未参入新链的dNTP及ATP，猝灭荧光）。
在测序过程中，每次加入一种类型的dNTP，若该dNTP能与模板链互补配对，则在四种酶的作用下发生一系列的反应，最终将荧光信号转换成电信号体现出来，显示为一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数成正比。
反之，当dNTP不能与模板链结合时，将直接被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，相应的将不会显示峰值。
如下图所示：
2.引物设计
焦磷酸测序的模板也是经亚硫酸盐修饰后扩增，故其引物设计原则与BSP引物设计基本一致：1）引物长度在18~24碱基；
2）避免引物间互补或自身形成发卡结构
3）引物中G/C – A/T的分配比例相当，使Tm在62-65°C之间其主要区别在于：1）Pyrosequencing的一条引物的5' 端需使用生物素标记，以和磁珠或琼脂糖beads结合，另一条引物不要
标记
2）由于游离的生物素将会和生物素标记的PCR产物竞争
结合联霉亲和素（beads）而降低信号水平，须使用HPLC
纯化生物素标记的引物。
3）要确保PCR产物目标量大，且没有非特异性条带，也
没有引物二聚体。
PCR完成后使用电泳鉴定PCR产物。
4）PCR循环数须足够，以保证完全消耗掉引物。
Pyrosequencing 的引物设计可以直接使用PyroMark Assay Design 2.0软件进行设计。
使用该软件时，只需将目的基因序列输入，该软件便可自动设计反应需要的引物，并会将CpG位点一一罗列出来，与常用的引物设计软件一样，也会有一个评分，建议使用评分在九十分以上的引物，当最高得分仍较低时，可考虑将BSR引物的其中一条进行生物素标记后使用。
PS：PyroMark Assay Design 2.0软件对目的基因的片段长度有限制，建议PCR的目的片段控制在300bp以内，测序片段控制在100bp，这样得到的结果会更加准确可靠。