海藻糖在血细胞冻干保存中的应用

海藻糖在血细胞冻干保存中的应用石　釧1,韩俊领1,2(1.协和干细胞基因工程有限公司,天津300384; 2.中国医学科学院、北京协和医学院,血液学研究所,血液病医院,天津300020)中图分类号:R457.1 文献标识码:A 文章编号:100622084(2008)1922908204 摘要:海藻糖是目前血细胞冻干保存中最常用的保护剂,作为一种稳定的非还原性双糖,它在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用并显露出在血细胞冻干保存中的广阔应用前景。

本文主要就冻干对血细胞损伤机理,海藻糖对血细胞冻干过程中的保护机制及海藻糖在血细胞冻干保存中的研究现状进行综述。

关键词:海藻糖;冻干保存;血细胞Appli ca ti on of Treha lose i n L yoph ili za ti on of Blood Cells　SH I Chuan1,HAN Jun2L ing1,2.(1.U2 nion S te m Cell&Gene Engineering L i m ited Co m pany,Tianjin300384,China;2.Institute of He m atolo2 gy and B lood D isease Hospital,Peking U nion M edical College,Chinese A cade m y of M edical Sciences, Tianjin300020,China)Abstract:Trehal ose is regarded t o be a p referred p r otectant for lyophilizati on of bl ood cells.Treha2 l ose,as a nonreducing disaccharide,p lays a r ole in p r otecti on of the cyt oactivity when the cells is freez2 ing,drying or lyop ilizati on,and shows br oad app licati on p r os pect on lyophilizati on of bl ood cells.This paper revie wed the da maged effect of lyophilizati on on bl ood cells,the mechanis m of trehal ose p r otec2 ti on and the experi m ental studies on trehal ose.Key words:Trehal ose;Lyophilizati on;B l ood cells 目前,红细胞、血小板和造血干细胞的保存仍主要采用常温下短期保存和深低温下长期保存两种方法。

均存在需要笨重存储设备、保存费用昂贵、运输不便等限制,远远不能满足临床应用。

由于冻干血细胞能在常温下保存,保存时间长,性能比较稳定,输注方便,保存费用低廉,便于运输等优点,尤其能够满足战时需要,血细胞的冻干保存已成研究热点。

血细胞的冷冻干燥过程一般包含预冻、初级干燥、次级干燥3个步骤。

在此过程中,细胞的生存条件、物理状态均发生变化,构成细胞的膜蛋白及磷脂存在一定程度的变性,影响细胞器的功能活动,细胞的生活力下降。

如何最大限度的抑制细胞成分的变性,保持细胞原有的活力,一直是血细胞冻干保存研究的重点。

海藻糖是一种非还原性双糖,在自然界广泛存在,由于其具有在脱水、干旱、高温、冷冻及高渗透压等严酷环境条件下保护生物体的组织和大分子的功能,引起了人们的广泛关注[1,2]。

近年研究显示,海藻糖是低温生物领域最佳的保护剂。

现就海藻糖在血细胞冻干保存中的作用机制及应用现状综述如下。

1　冷冻干燥对血细胞的损伤机制在液体冷冻保存中时,血细胞冷冻过程的损伤主要是由机械效应和溶质效应引起。

血细胞在预冻过程中,当细胞外溶液的温度降到其平衡冻结点以下并达到一定的过冷度后,细胞外溶液首先结晶,水的冻结使细胞间隙内的液体逐渐浓缩,电解质浓度显著增加,渗透压增高,pH值改变。

如果冷却速度较慢,细胞会因为长时间暴露于高浓度的溶液中而产生蛋白质变性和脱水性死亡,这就是所谓的溶质效应;当细胞内的水分结冰时,体积膨大,细胞内冰晶对细胞膜和细胞器膜就产生机械剪切破坏,谓之机械效应。

一般认为,冷却速率越快,机械损伤就越大。

血细胞干燥过程的损伤主要是膜的融合以及脂质的相转变。

在正常的生理环境下,细胞膜中磷脂的极性基团通过与水分子的结合而在空间上相互隔开,当水分子被除去后,极性基团的聚合密度增大,产生分子间的强相互作用,它们用极性基团间的氢键结合来弥补损失的与水分子的氢键结合,导致细胞膜大片融合、破损,内容物外溢[3];其次,血细胞在冻干过程中,细胞膜、细胞器膜经历液相向固相的相变过程,即膜脂质的物理状态的改变,磷脂双层除去氢键键合的水,将使丙烯酰基拉近,增加范德华力,结果脂类可以从液晶态转变成凝胶态[4]。

当再水化时,在室温为凝胶态的干膜又转变成液晶态,造成膜通透性增加[5]。

2　海藻糖的生物学特性及其在冻干保存中的作用机制2.1　海藻糖的生物学特性　海藻糖具有特有的物理和化学性质,这些特有的性质包括:①特强水合能力。

Kawai等[6]研究显示,以每个葡萄糖单位周围的不冻水分子数计算,海藻糖的不冻水分子是糖类最多的。

Magazù等[7]比较了海藻糖/水和蔗糖/水在玻璃化相转变附近的振动性质,认为海藻糖抗冷冻脱水的能力更强。

②独特的玻璃化转变及晶型转变特性。

海藻糖的玻璃化相变温度(Tg)是120℃,远高于其他双糖体系。

高的Tg可使样本在干燥时及以后的保存中有更高的稳定性[8]。

此外,高浓度的海藻糖溶液比其他糖类更不容易形成冰晶。

Sussich等[9]研究发现,细菌脱水时获得的休眠状态不仅与海藻糖较高的Tg导致黏度增加有关,还与水分失去时晶型分子排列的变化有关。

他们发现了一种无水晶态海藻糖分子。

这种晶态的化合物具有独特的可逆性吸收水分,转化成二水化合物,而不改变主要结构特性的作用。

这种可逆的过程在海藻糖对生物细胞抗脱水能力的保护上起了非常重要的作用。

③抗高温潮湿作用。

Leslie等[10]报道,在有海藻糖存在的条件下冻干后的细菌具有高度的存活率。

进一步发现,用海藻糖作为冻干保护剂时,将冻干样品(细菌)长时间暴露在潮湿的高温条件下,细菌仍保持了高度活性。

2.2　海藻糖在冻干保存中的作用机制　海藻糖对细胞的保护机制一直是众多研究的热点,目前主要有以下两种观点。

2.2.1　水替代学说　生物体中的蛋白质、糖、脂肪和其他大分子物质均被一层水膜保护着。

在干燥过程中,水分逐渐消失,导致这些大分子物质发生不可逆的变化,如蛋白质分子的空间结构的变化。

Cr owe 等[11]认为,当蛋白质结构水失去时,海藻糖可在失水部位以羟基和分子形成氢键,及时形成新的保护膜以替代原先失去的结合水膜,这使得分子在缺水条件下仍能保持其原有结构,而不丧失活性。

脱水过程中,海藻糖一方面能和磷脂形成氢键,抑止膜泡聚合,另一方面在高温下能有效降低膜相变温度,防止再水化时发生吸水破坏。

2.2.2　玻璃态学说　多数研究者认为,海藻糖的玻璃化状态在长时间保存细胞活性中发挥了重要作用。

玻璃化状态对细胞膜的保护作用有以下几个方面:①玻璃化抑止降温时冰晶的形成,避免了深低温保存时细胞受到的冰晶伤害和由于局部离子浓度过高而造成的化学伤害[3];②玻璃化则可以降低解链温度(T m),尽可能地保持胞膜的流动状态。

在冻干脂质体的研究中,当有海藻糖的存在时,脂质体的T m在干燥状态时降低到-20℃,从而使脂质在干燥状态下仍能保持液晶态,再水化过程中也不出现脂质的相位转化[12]。

3　血细胞负载海藻糖的研究研究显示,只有当海藻糖分子分布于细胞膜两侧,且每个细胞内达到>10个分子时,才能起到在冻干过程中保护细胞膜完整性的作用[4]。

但海藻糖不具有渗透性,因此如何在不影响细胞结构的前提下将海藻糖有效地载入到细胞内,是首先要解决的问题。

国内外学者对将海藻糖导入血细胞的方法进行了深入的研究。

Wolkers等[13]对海藻糖导入人的血小板进行了研究,他们在37℃下将血小板与海藻糖负载缓冲液孵育4h,使海藻糖的负载率达到>50%。

该方法利用细胞内吞作用,不仅简单,而且载入的海藻糖在血小板内均匀分布。

Wolkers等[13]还发现,37℃孵育,胞外海藻糖浓度在0～35mmol/L 时,血小板对海藻糖的吸收率成直线上升。

当胞外海藻糖浓度达到75mmol/L时,海藻糖的摄取率反而下降,提示人血小板对海藻糖的摄取具有浓度依赖性。

N ie等[14]在海藻糖负载缓冲液中加入磷酸盐,在37℃下负载4h,结果显示海藻糖和磷酸盐浓度都为45mmol/L时其导入血小板效率最高。

周新丽等[15]的研究表明,在细胞外海藻糖浓度为50mmol/L、负载温度37℃、负载时间4h的条件下,血小板能有效地吸收海藻糖,细胞内海藻糖浓度达到>15mmol/L。

对负载后的血小板进行形态观察、血液学分析和膜联蛋白V结合活化分析的结果显示,血小板的形态和功能正常。

Shirakashi等[16]在海藻糖负荷研究中,对哺乳动物细胞施行电打孔术。

尽管海藻糖可较容易的进人细胞内,但打孔后的细胞常常渗透脆性增加,不适合进一步冻干保存; Wolkers等[17]研究显示,红细胞对海藻糖的摄取明显依赖于孵育温度,而后者能影响红细胞胞膜的流动性。

4℃条件下,红细胞对海藻糖的摄取率很低, 37℃时,摄取率明显增加。

红细胞对海藻糖最大的摄取量(胞内海藻糖浓度大约为55mmol/L)发生在37℃,此时的红细胞膜磷脂处于液晶态;Sat pathy 等[18]研究发现,当胞外海藻糖浓度<600mmol/L 时,红细胞对海藻糖没有明显的摄取。

这说明其摄取机制可能并不是易化扩散,因为易化扩散可以在很低的胞外介质浓度时发生。

但当胞外海藻糖浓度>600mmol/L时,红细胞对其的摄取开始增加,似乎又表明海藻糖的跨膜转运能量有部分是来源于细胞内外的渗透压差,增加细胞内外海藻糖的浓度梯度看来是海藻糖跨膜转运中首先出现的推动力。

随后他们等采用了一种有效的、温和的方法将海藻糖导入人红细胞。

这种方法基于红细胞胞膜的热性质并提供红细胞对海藻糖在37℃足够的吸收时间(7h)。

数据表明,通过细胞内外渗透压不平衡和磷脂相变的联合作用可使红细胞内海藻糖浓度达到50mmol/L[18]。

4　海藻糖在血细胞冷冻干燥保存中的研究进展4.1　在血小板冻干保存中的应用　Wolkers等[19]利用血小板在37℃对海藻糖高效率吸收的特点,将载入海藻糖浓度>15mmol/L的血小板冻干至残余水含量为3%～5%。