实验1 叶绿素提取试验

实验1 叶绿素提取试验

实验一绿色植物色素的提取及分离

一、实验目的与要求

1、通过绿色植物色素的提取与分离，了解天然物质分离提纯的方法。

本原理及操作技术，加深了解微量有机物色2、学习薄层色谱和柱色谱分离的基

谱分离、鉴定的原理。

二、实验原理

绿色植物(如菠菜)叶、茎中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和叶黄素(黄)等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(CHONMg)557254和叶绿素b(CHONMg)，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代而形成557064 了叶绿素b。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。也是使用的绿色色素，可用于糕点、饮料水中，添加于胶姆糖中还可以消除口臭。植物中叶绿素a的含量通常是叶绿素b的三倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

胡萝卜素(CH)是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即α-胡4056 萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最多，约占胡萝卜素的78%，也最重要。在生物体内，β-胡萝卜素受酶催化氧化可转化成维生素A。目前，β-胡萝卜素已进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。

叶黄素(CHO)是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝40562 卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

本实验先根据各种植物色素的溶解度情况将胡萝卜素(橙)、叶黄素(黄)、叶绿素a和叶绿素b从菠菜叶中提取出来，然后根据各化合物物理性质的不同用色谱法进行分离和鉴定。薄层层析时，上述化合物的展开速度不同;柱层析时，流出速度有差异，可被极性不同的溶剂洗脱。

R

NN 2+Mg NN

CH 叶绿素a(R=CH) 32OCOOCHCH叶绿素b(R=CHO) 23

C

OO

R

R

β-胡萝卜素(R=H) 叶黄素(R=OH)

CHOH2

维生素A

色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法。其分离原理是利用混合物中各个成分的物理化学性质的差别，当选择某一个条件使各个成分流过支持剂或吸附剂时，各成分可由于其物理性质的不同而得到分离。与经典的分离提纯手段(重结晶，升华，萃取和蒸馏等)相比，色谱法具有微量、快速、简便和高效等优点。按其操作不同，色谱可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱和高压液相色谱等。

1、薄层色谱(TLC)，又称薄层层析。属于固-液吸附色谱。样品在薄层板上的吸附剂(固定相)和溶剂(流动相)间进行分离。由于吸附剂对各种化合物的吸附能力不同，在展开剂上移时，它们进行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。薄层

层析是一种微量、快速和简单的色谱方法，用于分离、纯化和鉴定有机化合物，还可以跟踪反应进程、检验化合物纯度等。

溶质最高浓度中心至原点中心的距离 ,Rf溶剂上升前沿至原点中心的距离

2. 柱色谱:在色谱柱内装有固体吸附剂(固定相)如氧化铝或硅胶。液体样品从柱顶加入，当样品溶液流经吸附剂时，填装在柱中的吸附剂将混合物中各组分先从溶液中吸附到其表面上，溶剂流经吸附剂时发生无数次吸附和脱附的过程。由于各组分被吸附的程度不同，吸附强的组分移动得慢留在柱的上端(后流出)，吸附弱的组分移动得快在柱的下端(先流出)，分段接收，再分别进行鉴定，以达到分离、提纯的目的。

三、实验仪器与试剂

(1)仪器

布氏漏斗研钵分液漏斗载玻片毛细管层析柱( 20×10 cm ) 仪器:天秤

(2)试样与试剂

新鲜菠菜、石油醚、甲醇、乙酸乙酯 ( 化学纯) 、丙酮、硅胶G、无水硫酸钠、中性氧化铝等。

四、实验步骤

1、薄层板的制备

薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。方法:在烧杯中放入2g硅胶G，逐滴加入5,6mL0.5%(质量分数)羧甲基纤维素钠水溶液(提前配制)，调制成均匀的糊状，用玻璃棒倾注到洁净干燥的载玻片上，用食指和拇指拿住载玻片轻轻前后左右摇晃，并不时转动方向，使其表面均匀平滑，制成薄厚均匀、表面光洁平整、无气泡的薄层板，厚度为0.25,1.0mm。在室温下自然晾干(注意:室温放置必须使玻板干透，否则会出现断裂现象)，放入105,110?烘箱中进行活化30min，取出后冷却，放入干燥器中备用(提前一天铺板)。 2、菠菜色素的提取

把新鲜菠菜洗净晾干或用滤纸吸干，称取5g菠菜叶，用剪刀剪碎后放入研钵，再加入20mL甲醇搅匀，加入少量SiO，研磨5min后，用布氏漏斗抽滤菠菜2 汁，弃去滤液。将菜渣和菜叶放回研钵，用10mL石油醚-甲醇(3:2体积比)混合液萃取两次，每次需研磨充分并且抽滤。把两次滤液合并，转入分液漏斗中。用10mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇和水溶性杂质(洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化)。分液后，弃去水-甲醇层，石油醚层转入干燥的锥瓶中用无水硫酸钠干燥30min。干燥后的液体在旋转蒸发仪上蒸发石油醚浓缩至体积约2,3mL左右。取一半做柱层析分离，其余留作薄层层析分析，石油醚回收。

注意:因石油醚易挥发，抽滤时先倒少许清液浸润滤纸，抽滤时真空度不要太大。 3、薄层色谱分析

将上述浓缩液在预制的硅胶G板上点样，分别用石油醚-丙酮(8:2体积比)混合液和石油醚-乙酸乙酯(6:4体积比)混合液两种溶剂系统展开，经过显色后，观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的R值的大小次序，f 计算比移值。(注意更换展开剂时，须干燥层析瓶，不允许前一种展开剂带入后一系统，比较不同展开剂系统的展开效果)

4. 柱色谱分离色素

取15,20g中性氧化铝进行湿法装柱。填料装好后，将菠菜色素浓缩液用滴管小心加到层析柱顶部。加完后打开下部活塞，让液面下降到柱面以下1mm左右关闭