临床检验技师-寄生虫学及检验(2019)讲义第五章实验检验技术

第五章实验检验技术

一、病原检查

1.粪便检查

（1）直接涂片法：适用于蠕虫卵、原虫检查（活滋养体检查和包囊的碘液检查）。

（2）浓集法

1）加藤厚涂片法。

2）沉淀法：自然沉淀法主要用于蠕虫的检查、离心沉淀法、倒置沉淀法适于比重较大的蠕虫卵检查、汞碘醛离心沉淀法适于原虫滋养体、包囊、蠕虫卵和幼虫的检查；醛醚沉淀法适于蠕虫卵和原虫包囊的检查。

3）漂浮法：饱和盐水漂浮法适于各种线虫卵、带绦虫卵等检查；硫酸锌离心漂浮法适于原虫包囊、多数蠕虫卵等检查；蔗糖溶液漂浮法适于原虫包囊、卵囊或孢子囊检查。

4）尼龙袋集卵法：主要适于血吸虫卵检查。

（3）虫卵计数法

1）改良加藤厚涂片法：适于各种蠕虫卵计数。

2）小管浮聚计数法：适于大多线虫卵计数。

（4）毛蚴孵化法：适于血吸虫病原体检查。

（5）钩蚴培养法：检出率较直接涂片法高7倍。

（6）带绦虫孕节检查法：肉眼可观察。

（7）常用原虫检查染色法：劳氏酸性品红-固绿染色法适于阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫检查、福氏快速苏木精染色法适于阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫滋养体和包囊检查、金胺-酚染色法和改良抗酸染色法适于隐孢子虫卵囊检查。

2.肛门外检查

（1）肛门周围蛲虫虫卵检查：有透明胶纸法、棉签拭子法，适于蛲虫、带绦虫检查。

（2）肛门周围蛲虫成虫检查：在肛门附近发现白色小虫，可进一步鉴定。

肛门周围蛲虫虫卵及成虫检查

3.血液及骨髓检查

（1）检查微丝蚴：①新鲜血片检查法；②厚血膜法；③活微丝蚴浓集法；④离心浓集法。

（2）检查疟原虫：①新鲜血片检查法：采血、制片（薄血膜，厚血膜）、固定、染色；②定量血沉棕黄色层（QBC）检查法；③疟原虫计数法。

4.其他排泄物与分泌物检查

（1）痰液检查：适于肺吸虫卵、溶组织内阿米巴滋养体、蛔蚴等检查，方法有：直接涂片法、消化沉淀法。

（2）尿液和鞘膜积液检查：适于检查班氏微丝蚴，可用离心法。

（3）阴道分泌物检查：适于检查阴道毛滴虫等，可用直接涂片法、悬滴法、涂片染色法。

检查阴道毛滴虫

（4）前列腺液检查：适于检查男性泌尿生殖道的阴道毛滴虫。

（5）十二指肠液检查：十二指肠液检查引流液检查适于粪便检查寄生虫阴性时使用；肠检胶囊法适于蓝氏贾第鞭毛虫。

（6）脑脊液检查：适于弓形虫、溶组织阿米巴大滋养体和肺吸虫卵等检查。

（7）浆膜腔积液检查：适于检查弓形虫、微丝蚴等。

5.活组织检查

（1）皮肤及皮下结节活检：适于检查利什曼原虫、蠕虫、疥螨和蠕形螨；

（2）肌肉活检：适于检查旋毛虫幼虫、猪囊虫、卫氏并殖吸虫成虫等其他蠕虫；

（3）淋巴结活检：适于检查利什曼原虫、弓形虫和丝虫成虫；

（4）肠黏膜活检：适于检查日本血吸虫卵、溶组织内阿米巴。

肌肉活检：适于检查旋毛虫幼虫

6.人工培养与动物接种

当被检者疑为寄生虫病而直接病原体检查阴性时，可做人工培养与动物接种。

常用的有：

①溶组织内阿米巴培养；

②致病性自生生活阿米巴培养；

③杜氏利什曼原虫培养；

④弓形体接种；

⑤阴道毛滴虫培养；

⑥旋毛虫接种；

⑦杜氏利什曼原虫接种。

二、免疫学检查

寄生虫病的免疫诊断，主要是应用免疫学方法检查患者血液循环中或体液中针对寄生虫的抗体或由寄生虫本身分泌排泄的抗原，方法大多较为敏感，可以检出微量存在的抗体或抗原，因之，对临床上疑似的患者，可提供诊断依据，有重要的辅助诊断价值；在寄生虫病防治工作中，可进一步查清病人，监测疫情变化并评价防治工作效果。

寄生虫病免疫诊断的价值，主要根据以下几个指标：所用的方法需有足够的敏感性，能查出绝大多数的病人；有较好的特异性，对其他寄生虫病很少发生交叉反应，健康人无假阳性；能用于疗效考核，病人经有效治疗后阴转较快；能反映病情，可以定量；方法简便易行、经济，可以在基层推广。

寄生虫病的免疫诊断，主要是应用已知的抗原检测患者血液中或其他体液中相应的抗体。

有些虫种，如血吸虫病、疟疾、丝虫病、华支睾吸虫病，并殖吸虫病和猪囊虫病等的诊断中已应用特异的多克隆抗体或单克隆抗体（McAb）进行循环抗原的检测研究，并成功地试用于现场流行病学调查。

免疫诊断用的抗原，可以是寄生虫生活史中的任何一个阶段，例如血吸虫的虫卵，毛蚴、尾蚴以及成虫均可用作诊断抗原。诊断用的抗原，可以是整虫，虫体的石蜡切片或冷冻切片，有不少方法是应用寄生虫的不同发育阶段的组织匀浆或提取物——可溶性抗原，也有使用寄生虫的排泄分泌物作为抗原（代谢抗原）。

例如血吸虫病诊断用的环卵沉淀试验和尾蚴膜试验是采用完整的虫卵及尾蚴；间接免疫荧光试验，既可用整虫，也可用虫体的切片；而在皮内试验、免疫电泳、对流免疫电泳、间接血细胞凝集试验以及酶联免疫吸附试验等方法中所用的则都是寄生虫的可溶性抗原。

应用于寄生虫病诊断的免疫学检查方法，简单介绍如下：

1.皮内试验（ID）

（1）原理：寄生虫变应原刺激宿主后，机体产生亲细胞性的IgE抗体和IgG4抗体当同样抗原与抗体结合后，可引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放活性介质，使注射部位局部出现红肿。

（2）应用：ID多用于蠕虫病的诊断及某些螨虫所致的变态反应的诊断。可用于多种寄生虫病的检测，如血吸虫病、肺吸虫病、肝吸虫病、囊虫病、棘球蚴病、丝虫病、幼虫移行症等。皮内试验可用作：

①过筛方法，先作皮试，阳性者再作进一步检查；

②临床辅助诊断；

③考核预防效果，用作检查新感染的方法，特别对儿童。

2.尾蚴膜反应（CHR）

（1）原理：血吸虫尾蚴抗原与患者血清特异性抗体在体外共同孵育后，在尾蚴体表面形成折光性套膜。

（2）应用：早期诊断血吸虫病，有较高的特异性和敏感性。

3.环卵沉淀试验（COPT）

环卵沉淀试验（COPT）是以血吸虫整卵为抗原的特异免疫血清学试验，卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出与检测血清内的特异抗体结合，可在虫卵周围形成特殊的复合物沉淀，在光镜下判读反应强度并计数反应卵的百分率称环沉率。COPT可作为诊断血吸虫病的血清学方法之一及临床治疗病人的依据；可用于考核治疗和防治效果；并可用于血清流行病学调查及监测疫情。

4.间接血凝试验（IHA）

间接血凝试验（IHA）是以红细胞作免疫配体的载体，并以红细胞凝集读数的血清学方法。最常用的红细胞为绵羊或人（O型）红细胞，来源方便。目前均用醛化红细胞，可保存半年而不失其免疫吸附性能。

可分为间接血凝（IHA），反向间接血凝（RIHA）、间接血凝抑制试验（IHAI）和反向间接血凝抑制试验（RIHAI），可以检测抗原或抗体，有较高的敏感性和一定的特异性。单克隆抗体的应用使敏感性和特异性有所提高。

IHA操作简便，敏感性高，适于现场使用，可用于辅助诊断及流行病学调查。可在多种寄生虫感染中应用，如血吸虫，疟疾、猪囊虫、旋毛虫、肺吸虫、阿米巴、弓形虫和肝吸虫等。有些已制成商品诊断药盒。不足之处是不能提供检测抗体的亚型类别，容易发生异常的非特异凝集。另外抗原的标准化和操作方法规范化有待解决，以提高其诊断效果和可比性。

5.免疫荧光技术

免疫荧光技术（IFA）是用荧光素标记的抗体检测抗原或抗体的免疫学标记技术，常用于病原体感染的荧光抗体染色主要有直接法与间接法。

（1）直接法：用于检测抗原，其缺点是每查一种抗原必须制备与其相应的荧光标记的抗体。目前很少应用。

（2）间接法：也称间接荧光抗体法。本法的优点是制备一种荧光标记的抗体，可以用于多种抗原-抗体系统的检查，既可用于测定抗原，也可测定抗体。可用于检测组织内的寄生虫，如利什曼原虫、阿米巴、疟原虫、弓形虫、血吸虫、华支睾吸虫、并殖吸虫、丝虫、囊虫、包虫、旋毛虫等。

IFA的抗原可用虫体或含虫体的组织切片或涂片，经充分干燥后低温长期保存备用。一张载片可等距置放多个抗原位点，同时检测多个样本或确定滴度；也可将多种抗原底物放在一起切片，用以过筛。

6.酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）简称酶联试验，已广泛用于多种寄生虫感染的宿主体液（血清，脑脊液等）以及排泄分泌物（尿，乳，粪便等）内特异抗体或抗原微粒的检测。根据检测要求，试验可分多种类型，常用者有：用于检测抗体的间接法；检测IgM的双夹心法、检测抗原的双抗体夹心法、以固相抗体检测抗原的竞争法以及竞争抑制法等。

ELISA为高灵敏检测技术，结果可定量表示，可检测抗体、抗原或特异性免疫复合物，微量滴定板法消耗样本试剂少，能供全自动操作，适用批量样本检测，因此在寄生虫感染的研究和诊断领域乃至血清流行病学均被广泛应用。国内外有多种寄生虫感染的ELISA试剂盒出售，包括有血吸虫病、弓形虫病、阿米巴病、丝虫病、肺吸虫病、棘球蚴病、隐孢子虫病、卡氏肺孢子虫病、囊虫病、蛔虫病、旋毛虫病和犬蛔虫病等。

三、单克隆抗体在寄生虫病诊断中的应用

单克隆抗体的特异性高，但敏感性常不及多克隆抗体。目前，已有应用于疟原虫抗原、疟原虫循环抗原、血吸虫循环抗原、血吸虫虫卵抗原检测，以及丝虫病、囊虫病、弓形虫病等寄生虫病的诊断。

四、DNA探针技术在寄生虫病诊断中的应用

DNA探针技术（分子杂交技术）在寄生虫病诊断中的应用主要有两个方面：一是进行种、株鉴定等分类学研究；二是用于寄生虫病的诊断及流行病学研究。由于是直接检测寄生虫DNA片段，因而比免疫血清学方法可靠、稳定。

目前已用DNA探针技术作为诊断工具的寄生虫病有：疟疾、弓形虫病、利什曼病、血吸虫病、丝虫病等。

经典例题

检查疟原虫及丝虫时，常用的标本是

A.血液

B.大便

C.尿液

D.骨髓

E.唾液

『正确答案』A

『答案解析』检查疟原虫及丝虫时，常采用厚血膜法。

染色实验用于检查

A.肝吸虫

B.肺吸虫

C.疟原虫

D.弓形虫

E.血吸虫

『正确答案』C

『答案解析』疟原虫检查常用血涂片吉姆萨或瑞氏染色镜检法（厚、薄血膜法）、血涂片吖啶橙染色法等。

阴道毛滴虫的检查方法，错误的是

A.生理盐水涂片法

B.涂片后染色

C.血涂片

D.尿沉渣涂片

E.前列腺分泌物涂片

『正确答案』C

『答案解析』阴道毛滴虫主要寄生于女性阴道和尿道内，也可寄生于男性尿道和前列腺内，引起滴虫性阴道炎、尿道炎或前列腺炎。

确诊寄生虫病的主要实验室检查方法是

A.病原学检查

B.免疫学检查

C.分子生物学技术

D.活组织检查

E.动物接种

『正确答案』A

『答案解析』确诊寄生虫病的主要实验室检查方法是病原性诊断。

A.肛拭子

B.血液及骨髓

C.分泌物

D.粪便

E.活组织

1.适用蛲虫检查的是

『正确答案』A

『答案解析』根据蛲虫在肛周产卵的特性，检查虫卵应在肛门周围皮肤上取材。

2.适用猪囊虫检查的是

『正确答案』E

『答案解析』肌肉活检适于检查旋毛虫幼虫、猪囊虫、卫氏并殖吸虫成虫等其他蠕虫。