蛋白多肽类药物药代动力学分析方法研究进展

蛋白多肽类药物药代动力学分析方法研究进展

作者：张琪王广基

摘要通过查阅近期国内外有关文献10余篇，综述了现代分析方法在蛋白多肽类药物代谢动力学研究中的应用，重点介绍了生物检定法、同位素标记法、免疫学、色谱等方法的原理、特点、及发展状况。

关键词蛋白质；多肽；药物动力学；生物检定法；同位素标记法；免疫学；色谱文章编号：1005-8915(2000)02-0126-03

The Progress of the Analysis Method of Protein Polypeptide Drug Pharmac

okinetics

Zhang Qi Wang Guangji

(Center of Pharmacokinetics, China Pharmaceutical University,Nanjing 210009) Abstract A review of application of modern analysis methods in studying the pha rmacokinetics of protein polypeptide drug is presented with 16 references. The paper emphasizes the principle, characteristic, and progress of bioassay, radioi odination, immunoassay, and chromatography.

Key Words Protein, Polypeptide, Pharmacokinetics, Bioassay, Rad ioiodination, Immunoassay, Chromatography

在国家确定的发展高新技术计划中，生物技术产品一直作为优先开发的领域之一。蛋白多肽类药物在实现产品的产业化过程中，受到诸多因素的制约，其中药物动力学的研究面临着更高的要求。其主要原因是蛋白多肽类药物的结构特殊、用药量很小、生物体内有大量相似物质的干扰，这一切都使得该类药的分析方法不同于传统药物，大大增加了检测的难度。本文就目前进行该类药药物代谢动力学过程中所使用或发展中的几种分析方法做一概述。

1蛋白多肽类药物的分析方法

1.1生物检定法

由于蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结构，

与二、三级结构亦密切相关，故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的方法。生物检定法有两个目的，直接测定体液中药物浓度及鉴定标记药物的生物活性。其方法主要可分为两大类。

1.1.1在体分析常规的有胰岛素的小鼠血糖法等，另外还有根据各类蛋白多肽的生物活性不同而建立的各异的方法，如根据IL-8可将大量中性粒细胞从骨中动员出的性质［1］而建立的IL-8动员中性粒细胞家兔体内实验。这类方法最直观地反映生物活性，但涉及整体动物，费时费力，灵敏度不高，变异较大。

1.1.2离体组织（细胞）分析如NGF刺激鸡背根神经节增长，缩宫素的大鼠离体子宫法等。随着分子生物学的发展，许多特异性强，灵敏度高的依赖细胞株被建立，细胞培养已是最常用的方法。根据蛋白多肽与细胞相互作用的机理不同，具体的操作亦有多种。如细胞增殖法（Proliferation assays），快速灵敏，但特异性稍差；抑制增殖法(Antiproliferation assays)，检测系统简单、灵敏而专一；减少细胞损伤法(Cytopathic effect reduction assays ) [ 2］，则是依据具有抗病毒活性的药物如干扰素，保护细胞不受病毒损伤，方法直观灵敏，但可能会受到多肽亚型的干扰。以上的方法都是以细胞数目的增减为量效指标，计数方法有直接计数法和间接计数法，后者包括MTT法，同位素（3H，14C）掺入法等。此外，还有根据蛋白多肽与细胞间接作用进行检测，如与免疫检测联用的抗体诱导法［3］，结合酶反应的酶诱导分解法［4］等。

总的说来，细胞培养法多具有灵敏特异，客观可靠的优点，但其不足也显而易见。

∙首先，生物检定法无法定量失去活性的小代谢物，无法示踪它们的体内动态；

∙其次，样品多存在于人或动物血清中，血清中内源物质的干扰以及可能存在的内源因子的交叉反应，影响了方法的专属性；

∙再者，启动生物过程常需阈量细胞因子从而降低了方法的灵敏度；

∙依赖株细胞长期培养易发生变异而影响检测的特异性。

1.2免疫学方法

免疫学方法是利用蛋白多肽药物抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检药物，再以放射计数，比色等方法予以定量，即将特异的抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。常用的方法有三种。

1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）该法是被测药物（Ag ）,标记药物（多为125I-Ag）与抗体（Ab）的竞争性结合反应，方法的特异性取决于抗原抗体的亲和力及标记药物的纯度，与生物检定法相比，有简明，易于控制的优点。

1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）该法中被测药物依然是Ag，它先与固定相上的Ab形成Ab∶Ag复合物，再与标记抗体125I-Ab结合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夹心状。由于Ag需有两个Ab来识别，这就大大增加了方法的特异性，是一灵敏而低变异的方法，只是对标记抗体的纯度要求很高。

1.2.3酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理与IRMA相似，只是第二个抗体不是用碘标，而是用可以与底物发生显色反应的酶如HRP 来标记，与上述两法相比，ELISA具有使用寿命长，重复性好，无辐射源的优点，并且已有不少实验证明，它与生物检定法具有一定的量效关系［4］及相关性［5］，提示它可部分地反映药物的生物活性。

免疫学方法的缺点在于：

∙它测定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；

∙不能同时测定代谢物，且具有抗原决定簇的代谢片段可能增加结果误差；

∙不同来源的抗体与相同的蛋白多肽反应可能有较大的差别；

∙还可能受到内源物质的干扰。

但免疫法毕竟是一种迅速，灵敏，适于批处理的方法，已有数十种蛋白多肽被开发成能满足药物动力学研究的商品药盒。目前临床药动学领域，免疫法已逐渐取代生物检定法。

1.3同位素标记示踪法

放射性同位素标记技术是研究蛋白多肽在生物体内处置的一种最常用的方法。所使用的同位素有125I，99mTc，3H，14C，35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期适宜，标记制备简单而最为常用。标记方法有两种，一是内标法，即把含有同位素的氨基酸加入生长细胞或合成体系，该法对生物活性地影响可能较小，但由于制备复杂而限制了其广泛应用；二是外标法，常用化学方法如氯胺T或Iodogen法将125I 连接于大分子上，因相对简单而被首选。