蛋白质的修饰和表达精品课件
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蛋白质的结构及功能课件.ppt
蛋白质的结构及功能课件
2. 侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中 性氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
3. 侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
4. 侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
5. 侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性 氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
3. 氧化供能
蛋白质的结构及功能课件
第一节
蛋白质的分子组成
The Molecular Component of Protein
蛋白质的结构及功能课件
蛋白质的元素组成 主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量P或金属元素Fe、
Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还 含有 I 。
蛋白质的结构及功能课件
蛋白质的结构及功能课件
第三节
蛋白质结构与功能的关系
The Relation of Structure and Function of Protein
蛋白质的结构及功能课件
一、蛋白质一级结构与功能的关系
（一）一级结构是空间构象的基础
二
硫
键
牛核糖核酸酶的 一级结构
蛋白质的结构及功能课件
去除尿素、 β-巯基乙醇
蛋白质的结构及功能课件
生物化学与医学
• 生物化学的理论与技术已渗透到医学科 学的各个领域
• 生物化学在生命科学中占有重要的地位 • 生物化学的发展促进了疾病病因、诊断
和治疗的研究
蛋白质的结构及功能课件
本课内容简介（一）
• 蛋白质的结构与功能 •酶 • 生物氧化 • 糖代谢 • 脂类代谢 • 氨基酸代谢
几种特殊氨基酸
Gly：无手性碳原子。 Pro：为环状亚氨基酸。 Cys：可形成二硫键。
2. 侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中 性氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
3. 侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
4. 侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
5. 侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性 氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
3. 氧化供能
蛋白质的结构及功能课件
第一节
蛋白质的分子组成
The Molecular Component of Protein
蛋白质的结构及功能课件
蛋白质的元素组成 主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量P或金属元素Fe、
Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还 含有 I 。
蛋白质的结构及功能课件
蛋白质的结构及功能课件
第三节
蛋白质结构与功能的关系
The Relation of Structure and Function of Protein
蛋白质的结构及功能课件
一、蛋白质一级结构与功能的关系
（一）一级结构是空间构象的基础
二
硫
键
牛核糖核酸酶的 一级结构
蛋白质的结构及功能课件
去除尿素、 β-巯基乙醇
蛋白质的结构及功能课件
生物化学与医学
• 生物化学的理论与技术已渗透到医学科 学的各个领域
• 生物化学在生命科学中占有重要的地位 • 生物化学的发展促进了疾病病因、诊断
和治疗的研究
蛋白质的结构及功能课件
本课内容简介（一）
• 蛋白质的结构与功能 •酶 • 生物氧化 • 糖代谢 • 脂类代谢 • 氨基酸代谢
几种特殊氨基酸
Gly：无手性碳原子。 Pro：为环状亚氨基酸。 Cys：可形成二硫键。
蛋白质泛素化修饰的技术路线PPT课件
感染性疾病治疗中的泛素化修饰研究
针对感染性疾病的治疗，一些研究关注利用泛素化系统来抑制病毒或细菌的复制。通过 调节泛素化修饰相关信号通路，可以抑制感染进程并改善疾病预后。
04
泛素化修饰的干预手段
药物干预
01
02
03
靶向药物
针对特定蛋白质的泛素化 修饰，开发靶向药物，以 调节蛋白质的稳定性、定 位或功能。
开发泛素化修饰相关药物
基于对泛素化修饰机制的理解，开发能够调节泛素化修饰的药物，用于治疗相关疾病。
THANK YOU
抑制酶活性
通过抑制泛素化修饰相关 酶的活性，调控蛋白质的 泛素化水平，进而影响其 生物学功能。
激活酶活性
激活泛素化修饰相关酶的 活性，增加特定蛋白质的 泛素化修饰，以调节其生 物学行为。
基因治疗
基因敲除
通过基因敲除技术，消除 与泛素化修饰相关的基因， 从而调控蛋白质的泛素化 状态。
基因过表达
过表达与泛素化修饰相关 的基因，增加特定蛋白质 的泛素化修饰，以调节其 生物学功能。
泛素化修饰在神经退行性疾病中的作用
泛素化修饰可以调控神经元的生长、突起和凋亡等过程。在神经退行性疾病中，异常的泛 素化修饰可能导致神经元功能障碍和死亡。
神经退行性疾病治疗中的泛素化修饰研究
针对神经退行性疾病的治疗，一些研究关注调节泛素化修饰相关信号通路。通过抑制某些 泛素化酶的活性或调节相关信号通路，可以延缓神经元死亡和疾病进展。
蛋白质泛素化修饰的技术路线ppt 课件
目录
• 泛素化修饰概述 • 泛素化修饰的检测技术 • 泛素化修饰相关疾病研究 • 泛素化修饰的干预手段 • 展望与未来研究方向
01
泛素化修饰概述
泛素化修饰的定义
针对感染性疾病的治疗，一些研究关注利用泛素化系统来抑制病毒或细菌的复制。通过 调节泛素化修饰相关信号通路，可以抑制感染进程并改善疾病预后。
04
泛素化修饰的干预手段
药物干预
01
02
03
靶向药物
针对特定蛋白质的泛素化 修饰，开发靶向药物，以 调节蛋白质的稳定性、定 位或功能。
开发泛素化修饰相关药物
基于对泛素化修饰机制的理解，开发能够调节泛素化修饰的药物，用于治疗相关疾病。
THANK YOU
抑制酶活性
通过抑制泛素化修饰相关 酶的活性，调控蛋白质的 泛素化水平，进而影响其 生物学功能。
激活酶活性
激活泛素化修饰相关酶的 活性，增加特定蛋白质的 泛素化修饰，以调节其生 物学行为。
基因治疗
基因敲除
通过基因敲除技术，消除 与泛素化修饰相关的基因， 从而调控蛋白质的泛素化 状态。
基因过表达
过表达与泛素化修饰相关 的基因，增加特定蛋白质 的泛素化修饰，以调节其 生物学功能。
泛素化修饰在神经退行性疾病中的作用
泛素化修饰可以调控神经元的生长、突起和凋亡等过程。在神经退行性疾病中，异常的泛 素化修饰可能导致神经元功能障碍和死亡。
神经退行性疾病治疗中的泛素化修饰研究
针对神经退行性疾病的治疗，一些研究关注调节泛素化修饰相关信号通路。通过抑制某些 泛素化酶的活性或调节相关信号通路，可以延缓神经元死亡和疾病进展。
蛋白质泛素化修饰的技术路线ppt 课件
目录
• 泛素化修饰概述 • 泛素化修饰的检测技术 • 泛素化修饰相关疾病研究 • 泛素化修饰的干预手段 • 展望与未来研究方向
01
泛素化修饰概述
泛素化修饰的定义
蛋白质翻译及翻译后修饰课件.ppt
1.3 核糖体（ribosome）与核糖体rRNA
核糖体是rRNA 与几十种蛋白质的复合体，有大、小两个亚基构成。含有 合成蛋白质多肽链所必需的酶、起始因子（IF）、延伸因子（EF）、释放 因子（RF）等。
原核的核糖体（70S）= 30S小亚基 + 50S大亚基 30S小亚基: 16S rRNA + 21种蛋白质 50S大亚基: 23S，5SrRNA + 34种蛋白质
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNA的结构—“四环一臂”
倒L形的三级结构
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNA的功能是解读mRNA上的密码子和搬运氨基酸。 tRNA上至少有4 个位点与多肽链合成有关：即3’CCA氨基酸接受位
点、氨基酰-tRNA合成酶识别位点、核糖体识别位点和反密码子位点。 每一个氨基酸有其相应的tRNA携带, 氨基酸的羧基与tRNA的 3’
反应如下：
A A t R N A A T P 氨 酰 基 - t R N A 合 成 酶 A A - t R N A A M P P P i
氨基酸的羧基与tRNA 的3’端CCA-OH 以酯键相连，因此其氨基是自 由的。
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNAfmet fMet-tRNA合成酶
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
分泌型蛋白质在翻译过程中通过信号肽协助转入内质网的机制
信号肽（signal peptide）是在新生的多肽链中，可被细胞识别系统识别的 特征性氨基酸序列，在蛋白质翻译过程中或翻译后的定位发挥引导的作用。
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
本章结束
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
氨酰基tRNA进入A位
新的氨基酸-tRNA的进位依赖Tu-Ts因子和GTP的协助
高中生物精品课件：蛋白质
CH COOH CH2COOH
② H2N CH2 COOH
③ H2N CH CH2 COOH
H
④ O NH2 C
H2N C COOH H
3、蛋白质的基本组成单位：氨基酸
氨基酸约20种：
甘氨酸、组氨酸、
谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸
缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、 色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸 异亮氨酸、甲硫氨酸
现有1000个氨基酸，共有氨基1020个。
羧基1050个，由它们合成含有4条肽链
蛋白质中，肽键、氨基、羧基的数目分别
是
996 、24、54
先求R基上的羧基数 目1050-1000=50
1000-4
再求总羧基数目
先求R基上的氨基数 目1020-1000=20
50+4=54
再求总氨基数目 20+4=24
蛋白质是生命活动的主要承担者。
煮熟的蛋白质改变了结构，变得松散，易于消化。
蛋白质
胃蛋白酶 胰蛋白酶
多肽
肠肽酶
氨基酸
7、蛋白质的变性
➢正确的三维结构是蛋白质表现其特有的生 物学活性所必需的。
蛋白质的空间结构并不稳定，随着各种条件 的变化，空间结构也会发生改变，蛋白质 就会失去生物学活性。
➢热变性：如温度的变化，一般当温度超过 40～50℃时，大部分的蛋白质的生物活性 会完全丧失。
CH2CH2COOH
甘氨酸
丙氨酸
谷氨酸
氨基酸的结构通式：
R
(1)R基不同、氨基酸不同(约20种)。
(2)每个氨基酸分子至少都含有一个氨
基(-NH2)和一个羧基(-COOH)，并且 都有一个氨基和一个羧基连在同一
个碳原子上。
蛋白质组学及技术介绍PPT通用课件.ppt
拖尾"point streaking") 。
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
《蛋白质技术》课件
ABCD
蛋白质免疫学鉴定
利用抗体与抗原的特异性结合，对蛋白质进行定 性和定量分析的技术。
蛋白质结晶学技术
通过蛋白质结晶和晶体衍射技术，解析蛋白质三 维结构的技术。
蛋白质纯化与鉴定的实例
血红蛋白的纯化与鉴定
利用凝胶过滤色谱法和亲和色谱法纯 化血红蛋白，通过质谱分析和免疫学 鉴定技术确定其一级结构和分子量。
《蛋白质技术》ppt课件
CONTENTS
目录
• 蛋白质技术概述 • 蛋白质的提取与分离 • 蛋白质的纯化与鉴定 • 蛋白质的修饰与改造 • 蛋白质技术的未来展望
CHAPTER
01
蛋白质技术概述
蛋白质的定义与功能
总结词
蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有多种生物学功能，如催化反应、细胞信号转导、免疫防御 等。
挑战
蛋白质结构的复杂性、蛋白质功能的多样性和蛋白质相互作用的动态性等，给 蛋白质技术的研究和应用带来了巨大挑战。
机遇
随着科技的不断进步，蛋白质技术的研究和应用领域也在不断拓展，为解决人 类面临的健康、环境、能源等问题提供了新的机遇。
蛋白质技术的创新与发展趋势
创新
蛋白质技术的创新主要表现在蛋白质设计和改造、蛋白质相互作用研究、蛋白质 组学和蛋白质芯片等领域。
蛋白质修饰与改造的实例
酶的改造
通过化学修饰和基因工程技术改 造酶，提高其催化效率和稳定性
。
抗体药物的改造
通过基因工程技术改造抗体，提高 其亲和力、特异性和药代动力学性 质。
细胞因子的改造
通过基因工程技术改造细胞因子， 以降低其毒副作用和提高治疗效果 。
CHAPTER
05
蛋白质技术的未来展望
蛋白质技术的挑战与机遇
生物化学课件之蛋白质(共119张PPT)
缬氨酸 valine Val V
亮氨酸 leucine Leu L
异亮氨酸 isoleucine Ile I
苯丙氨酸 phenylalanine Phe F
脯氨酸 proline Pro P
目录
2. 极性中性氨基酸
色氨酸 tryptophan Try W
丝氨酸 serine
Ser S
酪氨酸 tyrosine Try Y
第一节 蛋白质是生命的物质基础
一、什么是蛋白质?
蛋白质(protein)是由许多氨基酸 (amino acids)通过肽键(peptide bond)相连 形成的高分子含氮化合物。
二、蛋白质的生物学重要性
1. 蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：
普遍存在于生物界，动物、植物、微生物主要是由 蛋白质构成。
蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。
由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只 要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式 推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
1/16%
二、氨基酸 —— 组成蛋白质的基本单位
赖氨酸 lysine Lys K
精氨酸 arginine Arg R
组氨酸 histidine His H
目录
几种特殊氨基酸
• 脯氨酸
（亚氨基酸）
半胱氨酸
+
-HH
二硫键
胱氨酸
（二）氨基酸的理化性质
1. 两性解离性质 2. 紫外吸收性质 3. 茚三酮反应
1. 两性解离及等电点
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的 酸碱度。
蛋白质的修饰和表达课件
蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联 到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成 固定化蛋白质。
蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。 酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可 回收及重复使用的一类技术。 优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一 些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤， 简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
（二）光亲和标记
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
（二）氨基的化学修饰
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺 类。
二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被 修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分 子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结 合部位、酶的活性部位等位点的专一性， 一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专 一性，而且具有对被作用部位的专一性。 这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或 专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂 也被称为位点专一性抑制剂。
（一）亲和标记
蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。 酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可 回收及重复使用的一类技术。 优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一 些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤， 简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
（二）光亲和标记
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
（二）氨基的化学修饰
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺 类。
二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被 修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分 子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结 合部位、酶的活性部位等位点的专一性， 一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专 一性，而且具有对被作用部位的专一性。 这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或 专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂 也被称为位点专一性抑制剂。
（一）亲和标记
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2
影响化学修饰的主要因素有两方面：
1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之 间的氢键和静电作用等，基团之间的的空 间阻力。
2、修饰剂的反应活性。
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3
一、蛋白质侧链的化学修饰
在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和 的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基 和羧基特别容易产生有用的取代。
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12
3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基的 强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰 反应，但可以和二羰基化合物发生反应。
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13
4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被 氧化裂解。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以 使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一
性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反 应。
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24
蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。 酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可 回收及重复使用的一类技术。 优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一 些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤， 简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
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25
酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋 法、共价结合法去实现。
1、交联法
是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、 酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进 行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来， 形成网络结构的固定化酶。
常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺 -2， 2-二磺酸。
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需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
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37
1、制造突变体
（1）易错PCR 基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某
些组分的数量或质量，随机引入原来的模版质粒来 源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对 DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的 质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的 转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
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36
（二）定向进化
在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重 组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。
2）反应必须在温和pH、中度离子强度和低 温缓冲液中进行
3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的 其他功能基团副反应尽可能少
4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少 载体的空间位阻对酶活力的影响。
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29
第二节 蛋白质的分子生物学改造
蛋白质的分子生物学改造主要有基因突变、 基因融合和掺入非天然氨基酸等方法。
还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解。
修饰后，分子量增加，肾小球滤过减少。
这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的 延长。
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22
修饰时，先对PEG进行活化，活化的PEG 可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反
应而与蛋白质相偶联，蛋白质分子上与 PEG进行偶联的基团主要是氨基、巯基和 羧基。
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19
（二）光亲和标记
这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的 特点外，还具有一个光反应基团。
反应一般分两步进行：第一步，试剂先与 蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性 结合；第二步，光照，试剂被光激活后， 产生一个高度活泼的功能基团，与活性部 位的侧链基团发生反应。
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20
三、蛋白质的聚乙二醇修饰
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27
2、共价结合法
是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面 上的反应基团之间形成化学共价键连接， 以固定酶的方法。
常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂 糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚 氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）
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28
影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定 的机械强度和稳定性，同时具备在温和条 件下与酶结合的功能基团
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41
噬菌体展示技术
是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣 壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。
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39
2、筛选
（1）表型观察选择和筛选 菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的琼脂平
板上产生清晰的水解圈。
在高温并有蓝色木聚糖底物存在的条件下， 根据菌落周围地物的颜色变化来筛选耐高 温的木聚糖酶。
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（2）高通量筛选方法
噬菌体展示技术、细菌展示技术、酵母菌 展示技术、核糖体展示技术、酵母双杂交 系统等。
具有突变率高、简单易行、重复性好的特 点。
野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光 激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对 其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现 在的GFP能在可见光的波长范围被激发，而 且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现 了绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。
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1、重叠延伸PCR技术
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另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
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交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在 酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量 有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3） 吸附交联法：先将 酶吸附在硅胶、皂土、
氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子 交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联。4）载体交联法：用多功能试剂的一部 分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中 的另一部分功能集团偶联酶蛋白。
关键在于选择适当的突变频率。一般目标 基因内有1.5-5个碱基发生碱基替换时，诱变 结果最理想。
由于一轮易错PCR往往很难获得满意的结果， 因此常用连续易错PCR方法。
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DNA shuffling allows accelerated evolution of genes
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四、蛋白质的化学交联和化学偶联
化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基 之间，也可以发生与蛋白质分子与分子之 间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间， 也可发生于多个分子之间，而形成网状交 联。交联剂为含有双功能基团的化学试剂。 如戊二醛
蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联 到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成 固定化蛋白质。
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2、快速定点突变 首先准备质粒：必须是从常规E.coli中经纯化试剂
盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。 然后，设计一对包含突变位点的引物（正、反
向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循 环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版 延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反 复加热褪火延伸的循环。)正反向引物的延伸产物 退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原 成游离的巯基，再通过巯基修饰的方法对 其进行修饰，如经过羧甲基化处理，以防 止重新氧化成二硫键。
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（五）其他侧链基团的修饰
1、组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的 烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。
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2、酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修 饰，也可以是芳香环上的取代反应。
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5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前
最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
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（二）氨基的化学修饰
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要 研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学 途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重 组蛋白质的表达进行讲解。
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第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。
有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
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（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺 类。
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（四）二硫键的化学修饰
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5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核 性所引起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧 化。
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二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被 修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分 子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结 合部位、酶的活性部位等位点的专一性， 一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专 一性，而且具有对被作用部位的专一性。 这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或 专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂 也被称为位点专一性抑制剂。
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