蛋白质的修饰和表达2
蛋白质的修饰和功能调控
蛋白质的修饰和功能调控蛋白质是生命体中最基本的分子组成部分之一，它们参与了细胞的几乎所有生物学过程。
然而，蛋白质单独的氨基酸序列并不能完全解释它们的多样功能。
蛋白质的修饰和功能调控起着非常重要的作用，通过化学修饰以及与其他分子的相互作用，蛋白质的功能可以被调节和扩展。
一、蛋白质修饰的类型及功能1. 磷酸化修饰磷酸化修饰是一种常见的蛋白质修饰方式，通过将磷酸基团共价地添加到蛋白质的特定氨基酸上，如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
这种修饰方式可以影响蛋白质的空间结构和电荷状态，从而改变其功能。
例如，磷酸化可以调节酶的活性，参与信号转导通路，调控细胞增殖和凋亡等过程。
2. 甲基化修饰甲基化修饰是一种将甲基基团共价地添加到蛋白质的氨基酸上的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的亲水性、电荷状态以及相互作用的能力，从而调节蛋白质的功能。
例如，甲基化修饰可以在染色质结构的调控中起到重要作用，调节基因的转录和表达。
3. 乙酰化修饰乙酰化修饰是一种将乙酰基团共价地添加到蛋白质的氨基酸上的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的结构和电荷状态，影响蛋白质的功能。
例如，乙酰化可以调节组蛋白的结构，影响染色质的结构和稳定性，从而调控基因的表达。
4. 糖基化修饰糖基化修饰是一种将糖基团共价地添加到蛋白质的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的结构、稳定性和溶解度，影响蛋白质的功能。
例如，糖基化修饰可以参与细胞黏附、信号转导和免疫应答等重要的生物学过程。
二、蛋白质修饰的调控机制1. 激酶和磷酸酶的作用蛋白质的磷酸化修饰通常是由激酶和磷酸酶调控的。
激酶可以添加磷酸基团到蛋白质上，而磷酸酶可以将磷酸基团去除。
这种激酶和磷酸酶之间的平衡调节，可以使蛋白质的磷酸化状态发生变化，从而影响其功能。
2. 转录调控因子的作用转录调控因子可以结合到蛋白质上，并改变蛋白质的修饰状态，从而调节蛋白质的功能。
通过与转录因子的相互作用，蛋白质可以参与基因的转录和表达调控。
化学生物学中的蛋白质合成与修饰
化学生物学中的蛋白质合成与修饰蛋白质是生物体内最重要的大分子物质之一，参与了生物体内几乎所有的生命过程。
蛋白质的合成与修饰是化学生物学领域的一个重要研究课题。
本文将从蛋白质合成的基本过程入手，探讨蛋白质的合成和修饰在生物学中的重要作用。
一、蛋白质合成的基本过程蛋白质合成是指将氨基酸按照特定的序列连接起来形成多肽链的过程。
蛋白质的合成主要通过翻译过程完成，包括三个主要步骤：转录、转运和翻译。
1. 转录转录是指将DNA模板转录成RNA的过程。
在细胞质中，核糖体RNA（rRNA）和转移RNA（tRNA）起着重要的作用。
在核内，DNA的两条链解旋，其中一个链作为模板合成RNA。
通过与氨基酸配对，RNA链合成一条辅助的RNA链，称为mRNA（信使RNA）。
mRNA包含了氨基酸顺序的编码信息。
2. 转运转运是指将mRNA分子从细胞核转移到细胞质的过程。
mRNA通过核孔复合体运输到细胞质，并在细胞质中定位到核糖体上。
3. 翻译翻译是指通过核糖体将mRNA上的信息转化成氨基酸序列的过程。
翻译过程中，mRNA的信息通过转移RNA（tRNA）上的三个碱基序列（编码子）被翻译成相应的氨基酸。
tRNA携带相应的氨基酸，通过与mRNA的编码子配对，使氨基酸按照指定的顺序连接起来，最终形成多肽链或蛋白质。
二、蛋白质修饰的重要作用蛋白质合成完成后，往往还需要经过多种修饰过程才能发挥其生物学功能。
蛋白质修饰是指通过化学反应在蛋白质分子上加上一些功能团或改变其磷酸化状态、甲基化状态等方式，以改变蛋白质的物理化学性质和功能。
1. 磷酸化修饰磷酸化修饰是蛋白质最常见的一种修饰方式。
通过磷酸化修饰可以改变蛋白质的电荷性质和空间构象，进而调控蛋白质的功能。
蛋白质的磷酸化修饰通常由激酶和磷酸酶等酶催化完成。
2. 甲基化修饰甲基化修饰是指在蛋白质上加上一个甲基团，常常通过甲基转移酶催化完成。
甲基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、DNA结合能力和互作能力，对基因表达和细胞生命活动起着重要的调节作用。
蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要
研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学
途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重
组蛋白质的表达进行讲解。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。 有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。
（二）定向进化 在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重 组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。 需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的。
（一）巯基的化学修饰 由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般 是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前， 常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。 其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯 基。 N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修 饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随 光吸收的变化。
5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前 最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很 强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
蛋白质翻译后修饰包括磷酸化乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能
蛋白质翻译后修饰包括磷酸化乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能蛋白质是构成细胞的重要组成部分，它们在细胞内执行各种功能。
然而，在合成蛋白质的过程中仅仅翻译出氨基酸链还不足以确保完成蛋白质的结构和功能。
事实上，蛋白质在翻译后还需要经历修饰的过程，其中包括磷酸化、乙酰化和泛素化等多种修饰方式。
这些修饰过程不仅可以调节蛋白质的表达水平，还能调控其功能。
一、磷酸化修饰磷酸化是指通过酶类将磷酸基团添加到蛋白质的特定氨基酸上，通常是赖氨酸、苏氨酸或酪氨酸。
磷酸化修饰在细胞信号传导、细胞周期调控和基因表达等生物过程中起着重要的作用。
磷酸化能够改变蛋白质的电荷分布，从而调节蛋白质的结构和功能。
例如，磷酸化可以导致蛋白质的构象变化，从而改变蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，磷酸化还可以介导蛋白质的定位和降解，以及参与细胞信号传导的级联反应等。
二、乙酰化修饰乙酰化是指在蛋白质上添加乙酰基团，通常是赖氨酸残基。
乙酰化修饰通过乙酰转移酶进行，在细胞代谢、细胞周期调控和染色质结构维持等生物过程中发挥着重要的作用。
乙酰化能够调节蛋白质的功能和稳定性。
通过乙酰化，蛋白质的电荷分布和空间结构发生改变，从而影响蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，乙酰化还能够调控蛋白质的定位和降解，参与细胞信号转导和基因表达的调控等重要生物过程。
三、泛素化修饰泛素化修饰是指在蛋白质上添加泛素分子，通常通过泛素连接酶（E3酶）介导完成。
泛素化修饰在细胞质调控、蛋白质降解和细胞凋亡等生物过程中发挥着重要的作用。
泛素化修饰能够标记蛋白质，使其被泛素酶体降解并确保细胞内的蛋白质质量控制。
此外，泛素化还可以调节蛋白质的定位和活性，影响其与其他分子的相互作用。
综上所述，蛋白质翻译后的修饰过程如磷酸化、乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质的表达水平和功能。
这些修饰对于细胞内各种生物过程的调控起着重要的作用。
什么是蛋白质表达如何进行蛋白质表达
什么是蛋白质表达如何进行蛋白质表达蛋白质是生物体内重要的分子，参与了许多生命活动。
蛋白质表达则是指基因信息通过转录和翻译过程，转化为蛋白质的过程。
本文将详细介绍蛋白质表达的定义、基本过程以及常用的蛋白质表达方法。
一、蛋白质表达的定义蛋白质表达是指基因编码的蛋白质合成的过程，它涉及到两个关键步骤：转录和翻译。
转录是将DNA模板上的基因序列转录成mRNA的过程，而翻译则是将mRNA的信息转化为具有特定功能的氨基酸序列。
蛋白质表达是生物学中一个极为重要的过程，它决定了细胞的功能、个体的特征以及整个生物体的生理和生化过程。
了解蛋白质表达的机制对于我们理解生物的内部机制以及研究疾病治疗具有重要意义。
二、蛋白质表达的基本过程蛋白质表达的基本过程包括转录和翻译两个阶段，下面将详细介绍这两个步骤。
1. 转录转录是指将DNA模板上的基因序列转录成mRNA的过程。
在细胞核内，DNA双链解开，RNA聚合酶与DNA模板特定区域结合形成转录起始复合物。
然后，RNA聚合酶沿模板链将新的RNA链合成，其中基因信息由DNA转录成mRNA。
转录可分为三个阶段：起始、延伸和终止。
起始阶段包括转录起始复合物的形成，聚合酶开始链合成。
延伸阶段是RNA链的延伸过程，该过程直到遇到特定的终止序列才停止。
终止阶段包括终止复合物形成和RNA链的释放。
转录生成的mRNA将带有一段非翻译区（5'末端和3'末端），这些非翻译区在成熟的mRNA中起调节功能。
2. 翻译翻译是将转录形成的mRNA的信息转化为氨基酸序列的过程。
翻译发生在细胞的核糖体内。
核糖体是由rRNA和蛋白质组成的细胞器，它可以识别mRNA上的密码子，并将其翻译成相应的氨基酸。
翻译的步骤包括起始、延伸和终止。
起始阶段是核糖体与mRNA上的起始密码子结合，并帮助tRNA带有初始氨基酸进入核糖体A位的过程。
延伸阶段是通过核糖体移动到mRNA的下一个密码子位置，并将带有特定氨基酸的tRNA聚集进核糖体A位，使氨基酸逐渐连接成多肽链。
蛋白质修饰的功能与调控
蛋白质修饰的功能与调控蛋白质修饰是指在蛋白质分子上添加一些化学基团，或者去掉蛋白质分子上原有的一些基团，从而改变蛋白质分子的性质和功能。
蛋白质修饰是细胞中广泛存在的生物化学过程，为维持生命活动提供了重要的调控途径。
在细胞分裂、分化、凋亡等情况下，蛋白质修饰的作用不可忽略。
一、蛋白质修饰的分类常见的蛋白质修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化、葡萄糖基化、泛素化、糖基化等。
这些修饰与蛋白质相结合后可以影响蛋白质分子的构象、功能和互作等。
下面我们就分别来简要阐述一下这些常见的蛋白质修饰方式。
1、磷酸化：指在蛋白质分子上添加磷酸基团的过程，通常由蛋白激酶来催化。
磷酸化可以引起蛋白质构象的变化，从而调节蛋白质的活性和功能。
磷酸化常见于信号转导和细胞周期等过程中。
2、甲基化：指在某些氨基酸侧链上加入一个甲基基团的过程，通常由甲基转移酶来催化。
甲基化可以影响蛋白质相互作用的方式和特异性，从而调节蛋白质的生物学功能。
甲基化在基因转录、细胞分化和异质核糖体组装等过程中发挥重要作用。
3、乙酰化：指在蛋白质分子上添加乙酰基团的过程，通常由乙酰转移酶来催化。
乙酰化可以影响蛋白质核心区域的电荷环境和空间结构，从而调节蛋白质的结构和功能。
乙酰化在基因转录、蛋白合成和细胞凋亡等过程中发挥着重要作用。
4、葡萄糖基化：指在蛋白质分子上加入葡萄糖基团的过程，通常由糖转移酶来催化。
葡萄糖基化可以影响蛋白质的稳定性、折叠和互作方式，从而调节蛋白质的功能和生物学特性。
葡萄糖基化在免疫反应和疾病发生机制中发挥重要作用。
5、泛素化：指在蛋白质分子上加入泛素基团的过程，通常由泛素连接酶来催化。
泛素化可以引起蛋白质的降解、调控和定位，从而影响细胞的生理活动。
泛素化在蛋白降解、DNA修复和细胞周期中起着重要作用。
6、糖基化：指在蛋白质分子上加入糖基团的过程，通常由糖转移酶来催化。
糖基化可以影响蛋白质再折叠和保护、感知和信号传递等方面的功能。
糖基化在免疫反应、肿瘤转移和糖尿病等疾病的发生机制中起着重要作用。
蛋白质修饰及其功能
蛋白质修饰及其功能蛋白质修饰是细胞生命活动中的重要机制之一，可通过改变蛋白质分子的化学性质来调节蛋白质功能。
在细胞内，各种酶和蛋白质可以通过化学修饰的方式来改变蛋白质结构和功能，例如磷酸化、乙酰化、葡萄糖基化等。
这些修饰可以影响蛋白质的稳定性、亚细胞定位、蛋白质相互作用及酶催化能力等，从而调节细胞信号传导、代谢途径、细胞周期及分化等生命活动。
本文将介绍蛋白质修饰及其在细胞生命活动中的功能。
一、磷酸化修饰磷酸化是蛋白质修饰中最常见的一种，可通过激酶酶催化水解ATP而形成的磷酸酯键来实现。
磷酸化可影响蛋白质的结构及功能，如可调节酶催化活性、影响蛋白质的稳定性和可溶性、改变分子识别及与其他分子的相互作用等。
作为细胞信号传导的重要机制，磷酸化修饰可调节蛋白质的功能及其在细胞中的位置，是细胞调节功能的一种重要方式。
二、乙酰化修饰乙酰化是蛋白质修饰中较为新近的一种，最早在组蛋白上被发现。
乙酰化是一种非常小的修饰，即在蛋白质分子的特定氨基酸残基上添加一个乙酰基。
乙酰化可影响蛋白质的稳定性、亚细胞定位、招募信号分子、改变蛋白质及其间的相互作用等。
此外，乙酰化也能直接影响DNA的包装结构及其转录活性。
三、糖基化修饰糖基化修饰是一种常见且广泛存在于蛋白质上的修饰，其类型种类繁多，包括N-糖基化和O-糖基化两种。
N-糖基化主要发生在凝集素样序列上的天然蛋白质上，而O-糖基化主要发生在细胞外基质蛋白和一些膜蛋白上。
糖基化可影响蛋白质的稳定性及可溶性、亚细胞定位、招募信号分子、影响蛋白质相互作用及酶催化能力等。
四、蛋白质修饰的功能随着对蛋白质修饰的研究深入，越来越多的功能被揭示。
首先，蛋白质修饰在细胞信号传导中起到重要的角色。
例如，在细胞凋亡中，磷酸化修饰可激活蛋白激酶，促进凋亡信号的传递；在细胞增殖中，磷酸化修饰可作为细胞周期调节的信号传导机制，控制细胞的分裂。
其次，蛋白质修饰在代谢途径中也扮演着重要角色。
例如，糖基化修饰可以控制葡萄糖吸收和代谢，影响动脉硬化、糖尿病等代谢性疾病的发生和发展。
蛋白质的修饰和表达
定向进化的应用
目标酶
所需功能
方法
结果
实施菌种
卡那霉素核苷基 转移酶
枯草杆菌蛋白酶
β-内酰胺酶 对硝基苯酯酶
胸苷激酶 β-半乳糖苷酶 砷酸脱毒途径
热稳定性
作用于有机溶 剂
作用于新底物
有机溶剂中的 底物特异性和
活性 第五特异性 基
因理疗 底物特异性
砷酸抗性
定位诱变+选择 易错PCR+选择
DNA改组+选择 易错PCR+重组
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反响条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件
• 2、pH值得变化：决定了具有潜在反响能力 的基团所处的可反响和不可反响的离子状 态。
• 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，
但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
•
• 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个 人造〔或化学修饰〕的多肽相缔合
Amps
Tetr
Tetr
Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，到达有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
5’ 3’
5’
3’ 3’
• 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反响可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。
• α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
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三、哺乳动物细胞表达系统不足 之处
哺乳动物细胞在培养条件等方面要求
使用传代细胞可能存在潜在的致癌因子
等不安全因素
白质 在酵母细胞中的表达
一、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)表达系 统
真菌界的单细胞真核生物，有16个染色体。它的全基因组 已在1996年测定。
第三节 重组蛋白质的表达
重组蛋白质在大肠杆菌中的表达
重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达
重组蛋白质在酵母细胞中的表达
表达载体的一般特点
(1) (2) (3) (4) (5) (6) 复制起始点 选择性基因 强的、可诱导的启动子 强的转录终止序列 核糖体结合位点 合适的多克隆位点
重组蛋白质 在大肠杆菌中的表达
盐析现象：随着盐浓度的继续升高，例如，达到饱 和和半饱和的程度，蛋白质的溶解度逐渐变小， 彼此之间相互凝聚而发生沉淀，此现象称作盐析 (satting-out) 。
特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。
应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯 化。
3. 凝胶过滤层析法
原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，
30000 的外源蛋白几乎不分泌 , 使下游纯 化复杂化
不适于高密度发酵,难于产业化生产
四、毕赤酵母 表达系统
高稳定。表达载体整合在染色体上，构建
的菌株十分稳定。
高表达。细胞生长速度快，醇氧化酶启动
子很强，导致外源蛋白产量很高。
高分泌。分泌信号（如α因子）已被应用
于该表达系统。
外源蛋白的分泌表达及翻译后修饰
第四章 蛋白质的修饰和表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质修饰的化学途径
一、功能基团的特异性修饰 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰
一、功能基团的特异性修饰
天然氨基酸侧链中，约有一半可以在足够 温和的条件下产生化学取代而不使肽键受 损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生 有用的取代。
任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可 能出现不止一次，如果用化学的方法对 氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相 关的氨基酸侧链都要被取代。 尽管处在侧链上和末端的氨基和羧基基团 的pK值有差别，但在化学上很难将肽链 的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或 羧基相区别。
更
适合用于医药蛋白
外源蛋白在毕赤酵母中获得分泌表达的最大好处 就是得到的蛋白质翻译后加工，包括二硫键的形 成、蛋白质折叠及糖基化等。与啤酒酵母等其他 一些真核表达系统相比，毕赤酵母对外源蛋白糖 基化更接近于哺乳动物的糖基化。
五、提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表
达量的途径
优化基因内部结构 改造分泌信号
选择高表达的启动子
筛选高拷贝转化子
调整甲醇浓度和诱导时间 选择合适的培养温度
阻止外源蛋白降解
选择合适的酵母菌生长密度
六、其他表达系统
昆虫表达系统
卵母细胞表达系统
无细胞表达系统
第四节 重组蛋白的分离纯化
重组蛋白的分离纯化
1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法 6.反相色谱和疏水色谱
二、两个主要的哺乳动物细胞表达系 统
瞬时表达系统
稳定表达系统
瞬时表达系统是一个简单、有效的外源 蛋白表达手段，其表达水平最高可以达 到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整 合的、不复制的质粒DNA产生的，这样 使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h 到7天。
稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株， 需要1～2个月的时间，在稳定转化的细 胞中，DNA被整合到染色体中，这使得 重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。
进行盒式突变的两个关键问题： 1. 在目标基因序列中，要有适当的限制性 内切酶识别位点，使得用以取代天然 DNA序列的盒式突变序列可以有效的 插入目标基因中。 2. 各种适合的，用以取代目标基因中特定 DNA片段的突变DNA的得到 。
二）基因融合
1. 基因融合技术表达外源基因的缘由和方式
2．蛋白质分子嵌合体设计
3．蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连
接
4.融合蛋白标签和报告分子 5.tRNA介导的蛋白质工程
利用基因融合技术表达外源基因
基因融合策略，主要是有利于外源基因 的表达、表达产物的分离、纯化以及细 胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用 这些策略对蛋白质分子中的特定序列、 结构元件乃至结构域通过基因剪接来进 行操作。
经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时
间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝
2．二硫键与嵌合蛋白质的形成 3．嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键
4．融合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键
5．通过非肽键形成嵌合蛋白质
第二节 蛋白质改造的分子生物学途径
一、概述
分子生物学改造蛋白质的主要途径是基因 突变。 基因突变:在基因水平上对其编码的蛋白 质分子进行改造，在其表达后用来研究 蛋白质结构功能的一种方法。可分为位 点特异性突变和随机突变。
四、大肠杆菌表达体系的应用
外源蛋白质的分子量小于70kD
不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于
3～4个，
不需要翻译后修饰而能保持其生物活性
的蛋白质
重组蛋白质 在哺乳动物细胞中的表达
哺乳动物细胞表达体系的优点 两个主要的哺乳动物细胞表达系统
一、哺乳动物细胞表达体系的优点
具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以 及二硫键在合成和分泌过程中自然而然 的正确形成 哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完 全生物活性的蛋白质。
功能基团特异性修饰的途径
1．多位点取代 2．单一的或限制性取代 3．次级取代
1．多位点取代 (1) 常规的氨基保护 (2) 亚氨代乙酰基
(3) 其他的侧链取代
2．限制性取代
(1)-异硫氰酸苯酯对-氨基的选择性 (2) 羰基二酰肼的亲核取代 (3) 蛋白醛 (4) 通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和 肽的-酰胺 (5) 蛋白醛—由糖的化学氧化产生
二、蛋白质改造的分子生物学途径
一）基因突变技术 二） 基因融合
一） 基因突变技术
1.编码基因的专一性位点突变 2．区域性定向突变
1.编码基因的专一性位点突变
专一性位点突变又称特异性位点突变。这 类突变都是在含有突变序列的寡核苷引 物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸 介导的位点特异性突变。这种突变的方 法从问世至今不断更新，特别是PCR技 术出现后变得更高效。
PCR技术的出现为基因的突变，基因的 剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的 道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋 白质编码的基因序列上产生插入、缺失、 取代等突变。
基因突变分两类：
位点特异性突变和随机突变 位点特异性突变分三种类型：
通过核寡苷酸介导的基因突变 盒式突变或片段取代突变
利用聚合酶链反应（PCR），以双链DNA 为模板进行的基因突变
盒式突变法：利用目标基因中所具有的适 当的限制性内切酶位点，用具有任何长 度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片 段来置换或取代目标基因上的一段DNA 序列。又称片段取代法。
盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的 突变或突变家族，在这些突变体中各种不同 的序列被集中在目标基因的一个特定区域， 从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构 域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。
D. 引物与模板DNA的比率
E. 模板DNA的退火和引物延伸条件
F. DNA聚合酶的选择
(2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法
A. Kunkel 突变法 B. 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 C. 基于去除特定限制酶切位点的突变
D. 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 a.利用常规PCR方法在基因5`末端区域或3` 末端区域产生取代,插入,缺失的突变 b.利用重叠延伸PCR技术对基因中心区域 片段进行取代突变,插入突变,缺失突变
2．区域性定向突变
基因工程技术不但可使基因产生特异性位 点突变，也可以产生区域性的突变。
用途：产生各种特异性的突变或突变家族， 在这些突变体中各种不同的序列被集中在 目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋 白质特定结构区段或特定结构域的结构和 功能提供了一个切实可行的方法。
常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)， 又称片段取代法(DNA fragment replacement)。
一、大肠杆菌表达体系
大肠杆菌(Escherichia coli)是研究得最为详尽的一 个模式生物。这种只有1.6微米长的、可以迅速繁 殖的单细胞原核生物，已经成为实验室和基因工 程的重要工具。
大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一 个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选 体系。
二、大肠杆菌表达体系优点:
3．次级取代
(1)与蛋白醛偶联—亲核取代物
(2) 与蛋白质活性亲核物偶联—醛取
代物
二、基于蛋白质片段的嵌合修饰
通过非共价键相互作用、二硫键、常规肽
键(通过化学法或酶法产生)或其他非肽共
价键，可以将较小的肽段连在一起，这就
是通过半合成对蛋白质进行工程操作的原
则。
方法：
1．通过非共价缔合系统产生嵌合蛋白质
遗传学和生理学背景清楚
容易培养，特别是高密度发酵
外源基因经常可以达到高效表达。
三、大肠杆菌表达体系缺点:
不能进行典型真核细胞所具有的复杂 的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷 酸化、特异性的蛋白水解加工等 二硫键的形成以及外源蛋白质组装成 多亚基复合体的能力也受到限制。
外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性 的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时， 作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白 质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特 性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异， 当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中 表达时，有时不能得到足够的产物。