Caspase-3参与白花败酱草皂苷诱导Hela细胞凋亡

基金项目： 黑龙江省自然科学基金项目（ No. D2007-77） 通讯作者： 田黎明（ 1962-） ，男，硕士，教授，主要从事药物抗肿瘤研究。 第一作者： 张 涛（ 1964-） ，女，博士，教授，主要从事植物药抗衰老与抗
肿瘤研究。
1. 2. 2 细 胞 培 养 Hela 细 胞 培 养 于 含 10% 新 生 牛 血 清 的 RPMI-1640培养液，置于 37℃ ，50 ml / L CO2 、饱和湿度恒温培养 箱中孵育，每 2 ～ 3 d 传代。 1. 2. 3 指标检测 1. 2. 3. 1 噻唑蓝（ MTT） 法测定细胞增殖抑制作用 水提物终 浓度分别为 0. 20，0. 40，0. 80，1. 20 mg / ml； 皂苷终浓度分别为 0. 05，0. 10，0. 15，0. 20 mg / ml。另设未加药物只加细胞的对照 组，每个浓度设三个复孔，诱导 48 h。细胞生长抑制率 = （ 1 － 实验组平均 OD 值 / 对照组平均 OD 值） × 100% 。根据各组药 物对细胞的抑制率，运用 SPSS10. 0 软件计算出药物半数抑制 浓度（ IC50 ） 。 1. 2. 3. 2 光 镜 观 察 Hela 细 胞 凋 亡 的 形 态 学 特 征 皂 苷 0. 15 mg / ml，水提物 1. 20 mg / ml，阴性对照组培养 48 h 后，磷酸 盐缓冲液（ PBS） 漂洗，4% 多聚甲醛固定，4℃ 过夜。苏木素-伊 红（ H-E） 染色，光镜观察拍照。 1. 2. 3. 3 电 镜 观 察 Hela 细 胞 超 微 结 构 的 变 化 用 皂 苷 0. 15 mg / ml处理 Hela 细胞 48 h 和 72 h 后，树脂包埋，烘烤 24 h 固化成硬块，切成超薄切片（ 50 nm） ，醋酸铀-枸橼酸铅双重染 色后，透射电镜观察细胞超微结构。 1. 2. 3. 4 Hela 细 胞 Caspase-3 活 性 的 检 测 皂 苷 终 浓 度 为 0. 15、0. 20 mg / ml，水提物终浓度为 0. 80、1. 20 mg / ml，每个浓 度设 3 个复孔，同时设阴性对照，按试剂盒说明书操作，酶标仪 测定 OD405 值，通过计算 OD 给药组 / OD 阴性对照的倍数来确 定各组 Caspase-3 的活化程度。 1. 3 统计学方法 应用 SAS9. 13 软件分析，实验数据以 x ± s 表示，组间差异的显著性先方差分析，再采用 Dunnet't 检验。
2结果 2. 1 白花败酱草皂苷和水提物对 Hela 细胞生长的抑制作用
总 皂 苷 和 水 提 取 物 的 IC50 值 分 别 是 59. 2 μg / ml 和 199. 9 μg / ml。根据 美 国 国 家 癌 症 中 心 （ NCI ） 标 准： IC50 ≤ 230 μg / ml可作为抗肿瘤药物，说明白花败酱草总皂苷和水提 物对 Hela 细胞有明显的细胞毒作用。见表 1，表 2。 2. 2 白花败酱草总皂苷诱导 Hela 细胞的形态学变化 2. 2. 1 HE 染色光镜观察结果 光镜下可见对照组的 Hela 细
1 材料与方法 1. 1 细胞株与主要试剂 人宫颈癌 Hela 细胞株由哈尔滨医 科大学微生物教研室赠送； RPMI-1640 干粉培养基（ 美国 Gibco 公司） ； 新生牛血清（ 杭州四季青公司） ； AB8 大孔吸附树脂购 于天津南开大学化工厂。 1. 2 方法 1. 2. 1 实验药材与处理 白花败酱草购于秦皇岛市民乐医药 公司，由安国市昌达中药材饮片有限公司提供。 1. 2. 1. 1 白花败酱草水提物的制备〔3〕 白花败酱草粉碎后加 适量水，浸泡 3 h，煮沸提取 60 min，收集药液，经旋转蒸发仪 50℃ 减压回收得白花败酱草水提液，真空干燥箱 55℃ 干燥，得 败酱草水提物固体干粉。 1. 2. 1. 2 白花败酱草总皂苷的制备 取干燥的白花败酱草 4 kg，粉碎，按 1∶ 10 用 70% 食用酒精浸泡 4 h，加热回流提取 2 次，合并滤液减压回收乙醇，得白花败酱草乙醇粗提物。此粗 提物加入石油醚脱脂，用 AB8 大孔吸附树脂层析分离总皂苷。 白花败酱草醇提物上层析柱后用蒸馏水洗脱至洗脱液中无糖 为止（ Molish 反应阴性） 。再分别用 30% 、50% 和 70% 乙醇洗 脱，收集洗脱液，至各洗脱液 Liberman-Burchard 反应阴性为止。 洗脱液减压 回 收 乙 醇，真 空 干 燥 得 淡 黄 色 粗 提 物，终 重 量 为 25. 2 g，白花败酱草总皂苷的提取率约为 0. 63% 。皂苷鉴定∶ 取少量干燥提取物，与浓硫酸-醋酐（ 1∶ 20） 反应显蓝绿色，证明 提取物为甾体皂苷〔3〕。
Caspase － 3 参与白花败酱草皂苷诱导 Hela 细胞凋亡
Байду номын сангаас
张 涛 田黎明 朱贵明 任继秋 张 宇 田丽华 （ 佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007）
〔摘 要〕 目的 研究白花败酱草总皂苷对人宫颈癌 Hela 细胞的抑制作用及其机制。方法 采用 MTT 法观察白花败酱草水提液和总皂苷对 Hela 细胞生长增殖的抑制作用； 光镜和透射电镜观察总皂苷和水提物诱导 Hela 细胞发生凋亡的情况； 观察总皂苷和水提物对 Hela 细胞半胱天冬酶 （ Caspase-3） 活性的影响。结果 白花败酱草总皂苷在体外剂量依赖性地抑制 Hela 细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，并通过对凋亡关键酶 Caspase-3 的 激活，实现其促进 Hela 细胞凋亡的作用，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。结论 Caspase-3 参与白花败酱草皂苷诱导 Hela 细胞凋亡的作用。
〔关键词〕 白花败酱草； 皂苷； 细胞凋亡； Caspase-3 〔中图分类号〕 R737. 33 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（ 2012） 11-2321-03； doi： 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 11. 050
白花败酱草是败酱科草本植物的根茎及带根全草，在中国 的华东、华中、华南及西南各地均有分布，是一种常用植物药。 白花败酱草具有清热利湿、解毒排脓、活血化瘀、清心安神、改 善肝功能、抑菌和抗病毒等作用。关于黄花败酱体内抗肿瘤， 体外诱导人乳腺癌（ MCF-7） 细胞凋亡的作用曾有报道〔1〕，但白 花败酱草及其总皂苷在抗肿瘤方面的作用，较少报道〔2〕。