点印迹法中的金纳米粒子探针
以金纳米粒子为探针比色法检测顺铂
收稿 日期 ： ０６０ １ ２０ －５ｌ． 基 金 项 日 ：囤 家 自然 科 学 基 金 （ 准 号 ： ０ ７ ００） 助 ． 批 ２６ ５ ８ 资
联 系人简介 ： 王振新 （９ １ １７ 年出生） 男 ， Ｌ 研究员 ， ， 博 ， 博士生导 师，主要从事 高通量分析和生物纳米技 术研究
心纯化 ， 得表 面修饰 多肽／ 获 多肽一 Ｎ Ｄ Ａ的金纳 米粒 子．
１３ 表 面 修 饰 双 链 Ｄ Ａ 的 金 纳 米 粒 子 的 合 成 将 １０ Ｉ ． Ｎ ０ Ｌ Ｌ的 １ ｘ ｏ／ Ｎ 溶 液 、 ０ Ｌ ２ ｉ ＬＬ Ｄ Ａ ｍ ４０ Ｉ Ｌ的 ２４ｎ ｌＬ ． ｍｏ 多肽／ ／ 多肽．Ｎ Ｄ Ａ修 饰金纳 米 粒 子溶 液 与 ５０ Ｉ ０ Ｌ Ｌ的 ０ １ｍ ｌＬ磷 酸 盐 缓 冲溶 液 （ Ｈ ＝ ． ， 、 ｏ ／ ｐ ７ ０ １０ｍ ＬＬＮ Ｃ） 合 ， ． ｏ／ ａ １混 加热 至 ９ Ｏ℃反应 ５ｍｎ后 ， ｉ 于室 温下再 反应 ｌｈ 通 过 ３次 离心纯 化 ， 得表 面 ， 获 修饰双 链 Ｄ Ａ的金纳 米粒 子．并通过 琼脂糖 凝胶 电泳 法表 征不 同组分修 饰 的纳米 粒子 ． Ｎ １４ ｃ ．ｔ ． ｉＰ 与表 面修 饰 双链 Ｄ Ａ 的金纳 米粒 子反 应 将 不 同量 的 ｃ —ｔ ｓ Ｎ Ｐ 加入 到 ５ ０Ｉ ． ｍｏ Ｌ表 ｓ ０ Ｌ ４ ０ｎ ｌ Ｌ ／ 面修饰 双链 Ｄ Ａ金纳 米粒 子的 ０ １ｍ ｌＬ的磷酸盐 缓 冲溶液 （ Ｈ＝ ． ０２ｍ ｌＬＮ Ｃ） Ｎ ． ｏ ／ ｐ ７０， ． ｏ ａ １ 中，反应 ２ｈ ／ 后 ，经 ３次 离心纯 化 ，进行 紫外． 可见光 谱 、 核磁 共振谱 和 ＩＰ质 谱表征 ． Ｃ
14.1 DNA功能化的金纳米粒子及其应用
DNA功能化的金纳米粒子1 DNA功能化的金纳米粒子及其应用用DNA分子修饰无机纳米粒子为其在传感，药物和基因传输，光学和能源领域的应用带来了新的机遇。
同时利用DNA对纳米颗粒间相互作用的控制，基于DNA的平台也能为构建复杂纳米粒子组装结构提供灵活性和多样性。
DNA金纳米粒子复合物(DNA-AuNPs)是一种纳米生物复合物，由内层的纳米粒子和外层的DNA组成，起到了连接生物体系和纳米材料的作用。
上世纪九十年代中期，Mirkin研究组和Alivisatos研究组在他们的开创性工作中，首次报道了DNA功能化的金纳米粒子体系。
Mirkin等人合成了13 nm的金纳米粒子(在溶液中呈现均一的红色，紫外吸收峰波长为520 nm)，然后将末端为巯基修饰的DNA通过S-Au化学键相互作用固定到金纳米粒子表面得到DNA．金纳米粒子复合物(图1．9)，后来他们将这种复合物重新命名为球形核酸(spherical nucleic acid，SNA)。
由于这种DNA修饰的金纳米粒子复合物既具有金纳米粒子的光学和物理化学特性，又具有DNA分子的可编程特性和生物特性，自从Mirkin等人的开创性工作发表以来，DNA功能化的金纳米粒子发展应用迅速，已经被广泛应用于生物传感，离子检测，核酸比色检测，金纳米粒子结晶组装，生物成像等领域。
图1．9 Spherical nucleic acid(SNA) conjugates.1.1 DNA功能化的金纳米粒子在核酸检测中的应用基因突变的检测可以为诊断提供重要的目树，使人们对用于包括癌症在内的许多疾病早期诊断的核酸检测越来越感兴趣。
荧光和放射性检测读出方法(如PCR，PT-PCR，分子印迹法，以及高密度微阵列法等)是传统的核酸检测方法。
金纳米粒子比色法已经被证明是核酸目标链检测方面的一种极具竞争力的检测技术。
在金纳米粒子比色法中，待检测目标物直接或者间接的引发金纳米粒子聚集，并且导致金纳米粒子的吸收波长在可见光区域内发生红移。
3.8 基于金纳米颗粒的荧光核酸探针用于细胞内传感分析
基于金纳米颗粒的荧光核酸探针用于细胞内传感分析DNA本是生命体中的重要物质之一，它在各种生命活动中起着重要的作用。
近年来，由于DNA分子具有独特的碱基配对特性、容易体外合成且保持性质稳定、设计灵活等优势，借助于现代化学技术，科学家们开始将DNA引入到各种检测方法的设计中来。
随着研究的发展，一系列基于DNA的检测方法被相继报道：如比色法，电化学检测法和荧光检测法等，并已经逐步在生物分析、环境监测、药物筛选、疾病诊断与治疗等领域得到广泛应用。
在这些分析技术中，荧光分析因其检测快速、操作简单、灵敏度高等优点，常被科学家们用作检测手段。
同时，DNA能够很容易地修饰上荧光基团，且荧光信号稳定，因此科学家们研制出了许多类型的DNA荧光探针，如TaqMan探针、阴阳探针、分子信标等。
DNA荧光探针通常是在DNA上分别标记荧光基团和淬灭基团，在没有目标物存在时，荧光基团与淬灭基团互相靠近，荧光被淬灭，当有目标物存在时，荧光基团远离淬灭基团，荧光得以恢复。
而金颗粒具有很好的荧光淬灭特性，因此它能替代淬灭基团使用，同时金纳米颗粒的比表面积大、表面功能化易于控制，使得巯基化的DNA很容易的通过Au-S键修饰到金颗粒上。
因此，利用DNA和金纳米颗粒可以构建各种具有特定功能的荧光探针。
基于金纳米颗粒的荧光核酸探针在体外已经被广泛应用于离子、蛋白质、核酸等的检测中。
同时，金纳米颗粒的直径在1-100 nm之间，是一种理想的介导材料，可以实现探针的细胞内输送。
因此，基于金纳米颗粒的荧光核酸探针可以进入生物组织内部，探测各种生物分子的生理功能，在分子水平上揭示生命奥秘。
1 基于金纳米颗粒的荧光核酸探针用于细胞内传感的基础当我们要实现活细胞内目标分子检测之前，有两个重要的问题必须得到解决：第一、如何克服细胞膜的屏障，将探针输送至细胞内并保持细胞与探针的活性；第二、如何在活细胞内这样复杂的生物系统中保持探针的稳定性。
基于金纳米颗粒的荧光核酸探针在上述两个方面展现了独特的优越性，如易于进入细胞、保护DNA抗酶切、生物相容性好等，而这些优势也成为其能够被用于复杂的细胞内环境中对各种生命物质进行检测与成像的重要基础。
一种可视化金纳米粒子探针的制备方法和应用[发明专利]
![一种可视化金纳米粒子探针的制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/347dc7b13c1ec5da51e2705a.png)
专利名称：一种可视化金纳米粒子探针的制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：朱瑞琦,周影,宋金萍,双少敏,董川
申请号：CN201710147335.X
申请日：20170313
公开号：CN106970032A
公开日：
20170721
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种可视化金纳米粒子探针的制备方法和应用，本发明是以腺苷适配体和MUA 共同组装在金纳米粒子表面上，组装后的金纳米粒子呈网状结构，溶液呈蓝色。
腺苷的加入会导致核酸适配体结构的变化，使腺苷适配体从金纳米粒子表面解离下来，同时金纳米粒子由网状结构变为自由分散结构，溶液由蓝色变为红色。
向溶液中加入Cr，利用Cr与MUA中‑COOH的络合作用，可将分散后的粒子重新聚集，溶液颜色又从红色变为蓝色。
本发明具有双重顺序检测腺苷和Cr的功能，且灵敏度高，选择性好，不需大型仪器，可实现原位快速检测，检测结果直观，可裸眼观察。
可应用于实际生物样品中腺苷和Cr的检测。
申请人：山西大学
地址：030006 山西省太原市小店区坞城路92号
国籍：CN
代理机构：山西五维专利事务所(有限公司)
代理人：张福增
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金纳米颗粒聚集以及金纳米探针 微阵列技术研究进展
金纳米颗粒聚集以及金纳米探针-微阵列技术研究进展逄键涛 文思远 王升启#（军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850）摘 要 金纳米颗粒（GNP ）探针正引起科学家们越来越多的兴趣。
本文主要综述了基于GNP 自组装聚集反应的生物检测和微阵列-金标银染检测的最新进展，对GNP 在电化学等其他领域的研究前沿也进行了探讨。
引用文献41篇。
关键词 金纳米颗粒，微阵列，生物检测，评述2005-08-10收稿；2005-12-03接受本文系国家863资助项目（No.2004BA519A46）1 引 言金纳米颗粒（GNP ）是直径为0.8～250nm ［1］的缔合胶体，具有纳米表面效应、量子效应、宏观量子隧道效应。
按粒子尺寸和聚集情况，GNP 可显示不同的颜色，已被广泛用于光学、电学、电子显微镜检测的生物分子标记［2］。
单个纳米颗粒的尺寸和颗粒间的组装形式，使胶体Au 溶液表现出不同的整体特征。
生物分子可参与到GNP 的聚集和组装过程中，从而干扰GNP 的原始组装方式。
通过胶体Au 溶液最终的物理状态（如颜色、吸光度等）可得到参与组装的生物分子的“质、量”特征，达到检测的目的。
另外，GNP 逐渐在生物芯片检测中显现出应用前景。
生物芯片技术本身是纳米尺度的分子操作和组装技术，芯片诊断、纳米检测等技术可以在此得到良好的融合。
本文着重就GNP 自组装以及GNP 探针-微阵列技术进展作一综述。
2 生物分子辅助的GNP 聚集和组装2.1 DNA-GNP 探针灵敏度高、特异性强、快速简单、低成本是生物检测的重要指标。
基于GNP 聚集反应的分子诊断方法能满足这些要求。
Mirkin 发现DNA 特异杂交可使DNA-Au 颗粒自组装为复合结构，开创了GNP 用于生物检测的新领域［3］。
GNP 经巯基修饰的短链DNA 修饰成为编码探针［4］，溶液中加入目标互补DNA 后，纳米颗粒发生有序、可逆的聚集反应［5］。
聚集后溶液颜色发生红7桃红7紫色变化，几小时出现桃灰色沉淀（DNA-胶体金沉淀）。
金纳米探针——精选推荐
【摘要】 由于金纳米粒子（AuNPs ）具有与大小、形状和聚集程度相关的物理和化学特性，被广泛应用于各种生物分析和生物医学检测技术中，并技术中，并发展发展成具有高选择性、高灵敏度的生物分析检测手段。
以AuNPs 为探针的分析方法通常具有简单、快速、灵敏度高的优点，并能应用于实际样品检测. 【关键词】 金纳米粒子；探针；合成与修饰； 1 引言 纳米技术与化学、生物学、纳米技术与化学、生物学、物物理学和医学等领域的结合，对分析和医学等领域的结合，对分析科学科学和生命科学领域的超灵敏检测和成像方法的发展起着越来越重要的作用。
由于AuNPs 具有独特的光学性质（表面等离子体吸收和共振光散射）、易进行表面修饰以及良好的生物相容性（通常认为裸AuNPs是无生物毒性的，而修饰后的AuNPs 的生物毒性由其配体决定），因此功能化AuNPs 的应用领域不断被拓宽，特别是其在生物分析和生物医药等领域的应用引起了人们广泛关注[2，3]。
本文综述了生物分子修饰的AuNPs 探针的合成及其在检测金属离子、小分子、DNA 、蛋白质和细胞内分析等方面的新进展，以若干应用实例突显一些技术突破及发展趋势。
2 金纳米粒子的合成、稳定性和功能化2.1 金纳米粒子的合成方法 金纳米粒子的制备方法可分为化学法和物理法。
化学法是以金的化合物为原料，在还原反应生成金纳米粒子时控制粒子的生长，使其维持纳米尺度。
化学合成法包括氧化还原法、电化学法、晶种法、模板法、微乳液法、微波合成法和光化学法等，其中最具代表性并被广泛应用的有：（1）Turkevich-Frens法，即在100 ℃下，通过改变还原剂（柠檬酸钠）和三价金的化合物（氯金酸或氯金酸钠）的比例来控制AuNPs 粒径的大小，从而获得粒径在10~60 nm范围内且分散性较好的AuNPs。
该方法制备程序简单，且包裹在AuNPs表面的柠檬酸根容易被其它配体置换（如巯基修饰的DNA等）；（2）Brust-Schiffrin 法，即在两相（液/液）体系或单相体系中，以四正辛基溴化铵（TOAB）为相转移剂，将三价金的化合物（氯金酸或氯金酸钠）转移到有机相中，以烷基硫醇为稳定剂，NaBH4为还原剂，制备粒径为1~8 nm的AuNPs；硫醇/金盐的比例越大、加入还原剂速度越快，冷却溶液可以制得尺寸更小和单分散性更好的粒子，进一步通过配体交换反应改变AuNPs表面的配体而实现其功能化；（3）聚合物保护法：通常以含有聚乙二醇、硫醇或硫醚基团的聚合物为配体，以NaBH4为还原剂，制备水溶性或具有疏水性的粒径小于10 nm的AuNPs。
金纳米探针检测DNA序列
金纳米探针检测DNA序列2016-06-21 13:34来源：内江洛伯尔材料科技有限公司作者：研发部金电极放大电化学检测示意图DNA作为一种生命基本遗传物质,现在已经广泛应用于生物传感中,电化学的DNA生物传感器是尤其有发展前途的传感器. 文献报道了寡核苷酸上连接有纳米金属微粒能够提高方法本身的灵敏度和序列的选择性,纳米粒子嵌入的DNA生物传感器研究已经日益深入. 二茂铁具有特殊的夹心结构,这种结构使其具备了芳香性、氧化还原可逆性以及稳定、低毒等特性,它的氧化还原电化学活性被广泛应用于DNA传感体系中,因此,近年来二茂铁及其衍生物仍是化学家研究的热点.电化学方法与传统方法(例如荧光、化学发光和生物素标记、放射性同位素标记)相比,具有仪器简单、价格低廉、测定快速准确和方法灵敏度高,无需复杂仪器及操作等优点,并且避免了放射性污染等弊端,无毒害作用. 有关DNA杂交的电化学测定一般基于以下条件:靶点DNA或者核苷酸上的氧化还原性标记物的电化学反应;双螺旋蛋白酶等结构上的标记物产生的电活性产物;指示剂分子如金属阳离子配合物等. 不过,基于纳米金属微粒的DNA双链结构的直接、放大的伏安检测,文献报道很少或者不够深入.北京师范大学化学系胡劲波等人用冠以大量二茂铁的纳米金微粒/抗生蛋白链菌素结合物为标记物,将其标记于生物素修饰的寡聚核苷酸片段上,制成了具有电化学活性和纳米金放大作用的DNA电化学生物传感器. 首先采用巯基DNA和巯基烷烃混合自组装膜制备了金修饰电极,将探针DNA分子固定在了电极表面,运用杂交原则结合靶点分子在电极表面形成了双螺旋的DNA链,然后借助抗生蛋白链菌素和生物素之间的强亲和作用,引入了功能化的纳米金. 通过伏安法测定了修饰在纳米金上的二茂铁的氧化还原电流,可以识别和测定溶液中互补的靶点DNA , 172mer 靶点DNA 的浓度在0.001～10nmol/L范围内有线性关系,检测限可达0.75×10-12mol/L.。
纳米金粒子的制备及其在生物传感器中的应用
纳米金粒子的制备及其在生物传感器中的应用纳米金粒子是指金属黄金在100纳米以下的微小颗粒，因其独特的光学、电学、磁学和化学等性质而引起研究者的极大兴趣。
在近年来的科学研究中，纳米金粒子被广泛应用于医学、电子、光电、生物传感、光学传感、热传感等领域。
其中，纳米金粒子在生物传感器中的应用具有广阔的应用前景。
一、纳米金粒子的制备纳米金粒子的制备方法有多种，如物理气相沉积、化学气相沉积、溶液法、微反应系统等。
其中，溶液法是制备纳米金粒子最为常用的方法之一。
通过选择不同的还原剂、保护剂、模板等条件，可以制备出晶体形貌不同的纳米金粒子，如球形、棒形、八面体形等。
此外，纳米金粒子亦可通过激光蚀刻法等方法制备。
二、纳米金粒子在生物传感器中的应用在生物传感器中，纳米金粒子作为生物反应器、识别元素和信号放大器等重要角色。
其具有以下应用：1. 生物传感器纳米金粒子在生物传感器中可以作为载体搭载生物分子，例如抗体、DNA探针、酶等，来检测特定物质。
当前，基于纳米金粒子的免疫传感技术被广泛应用于免疫识别、抗菌药物检测、酶活性测定等领域。
2. 生物成像利用纳米金粒子的高度表面增强拉曼散射效应，可以普及成像领域，例如在细胞成像、分子成像等方面有广泛应用。
3. 传感器信号放大器纳米金粒子在生物传感器中作为信号放大器，可以增强传感器的灵敏度和快速响应。
近年来，许多人体检测设备和检测仪器中采用了这一技术。
4. 气体传感器纳米金粒子在气体传感器中可以自身吸附气体，如H2，CO和NO2等。
当吸附的气体只有实际质量的0.01%时，其性质发生了明显改变，可以用作气体传感器探测吸附的气体。
三、纳米金粒子存在的问题尽管纳米金粒子在生物传感器中有着广泛的应用前景，但同时也存在一些问题。
首先，纳米金粒子人工制备过程中可能存在产生有害化合物的风险，例如使用还原剂亚硫酸钠和棕榈酸钠等。
其次，纳米金粒子的使用需考虑是否对人类健康有副作用，例如纳米金粒子可能被身体吸收进入人体，对人体器官造成损伤。
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点印迹法中的金纳米粒子探针
2016-09-04 12:17来源：内江洛伯尔材料科技有限公司作者：研发部
金纳米粒子探针
这种分析方法主要利用金纳米粒子本身具有颜色，对白色基底（如硝化纤维膜）上点样点处的待检测物，进行染色定量分析。
金纳米粒子表面需要修饰上，特定可以和待检测物结合的探针分子；待检测物通过吸附或其他方法附着固定在基底上，形成含有不同量待检测物的点样点。
基底上样品点之外部分进行了封闭，尽量减少金纳米粒子在表面的非特异性吸附造成的干扰。
将点样点在分散有修饰探针分子的金纳米粒子溶液中进行孵育，充分结合后取出，此时依据点样点上所固定的待检测物的量多少，结合了相应数量的金纳米粒子。
再将点样点浸泡在银离子溶液中，银离子会在金纳米粒子表面沉积，使原有的颜色进一步加深，而结合的金纳米粒子越多，银沉积的也越多，有利于进一步增加信号灵敏度。
台湾国立台北大学Chun－Yen Huang等人利用点印迹法进行了免疫检测。
他们合成了表面修饰有可以结合待检测分子的抗体（即探针分子）的金纳米粒子。
检测时，将一定体积含有待检测分子的溶液滴在白色硝化纤维膜上，待检测分子可以吸附固定于膜表面；然后将膜在含有修饰了探针分子的金纳米粒子溶液中孵育，通过待检测分子－抗体的结合将金纳米粒子连接固定到膜表面。
膜上金纳米粒子颜色越深，则该点样点处待检测分子越多，由此可以实现定量检测。
为了进一步增加检测灵敏度，他们在金纳米粒子表面沉积银，放大检测信号。
实验比较表明，通过银沉积放大，可以将检测灵敏度提高1000倍（从100 amol 到100 zmol）。
这个方法可以扩展到很多免疫检测上，只要在金纳米粒子表面修饰合适的抗体作为探针分子。
长春应用化学研究所汪尔康小组通过点印记阵列的方法，实现了对蛋白质凝血酶的简便、快速和灵敏的检测。
该工作的一个特点是使用点印记法，另一个特点为采用适配子作为蛋白质检测探针。
适配子一般是指具有特定序列，能特异性结合生物分子，如蛋白质或者小分子的单链DNA。
蛋白质与对应适配子的结合，具有可以比拟“抗原-抗体结合”的特异性和结合常数，而适配子的合成、纯化非常简单，因此近年来适配子被普遍应用于蛋白质的检测。
Wang等首先合成了粒径约13nm的金纳米粒子，再将其表面修饰上凝血酶的适配子。
检测时，将含有待检测物凝血酶的溶液滴在硝化纤维膜（nitrocellulose membrane）上。
凝血酶通过静电、疏水作用而固定在硝化纤维膜表面，再将膜上空余部分用10%牛血清白蛋白（BSA）封闭，减少其后金纳米粒子的非特异性吸附。
然后，将硝化纤维膜浸泡在含有适配子修饰的金纳米粒子溶液中孵育。
此时金纳米粒子便会和硝化纤维膜表面的凝血酶结合，凝血酶越多，结合的金纳米粒子越多，则该处颜色越深。
经过银沉积到金纳米粒子上，可以进一步增加检测灵敏度。
他们还检测了模拟实际样品的凝血酶含量，发现含有低于8%的血浆不会明显降低检测效果，但是10%以上的血浆会干扰检测。
以上点印迹法的检测灵敏度有了很大提高，但是仍需要训练有素的专业人员进行检测操作。
为了进一步提高方法的实用性，有必要简化操作过程，降低复杂程度，以便日常家庭中的使用。