一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011..
一种植物病原菌物的纯化分离方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810124852.X(22)申请日 2018.02.07(71)申请人 四川农业大学地址 611130 四川省成都市温江区惠民路211号(72)发明人 杨春琳 许秀兰 刘应高 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246代理人 夏艳(51)Int.Cl.C12N 1/02(2006.01)(54)发明名称一种植物病原菌物的纯化分离方法(57)摘要本发明公开了一种植物病原菌物的纯化分离方法，分离材料主要有：纯培养菌物、植物组织样品两种，采用微型吸取管或者微型挑孢针，基于PDA培养基、WA培养基和无菌浮载液进行纯化分离，本发明结合以往单孢分离方法基础上进行了改进与优化，该方法更具有实用性，且器具简单易获得、成本低廉、操作便捷、成功率较高。
权利要求书4页 说明书9页 附图4页CN 108359605 A 2018.08.03C N 108359605A1.一种基于纯培养菌物的植物病原菌物的纯化分离方法，其特征在于，采用微型挑孢针，包括以下步骤：步骤1、培养纯培养菌物单孢：取纯培养菌物，利用接种针挑取菌块接种于PDA培养基中，接种1-3皿，转移至恒温培养箱中，25℃恒温培养，1-7d，待其产孢；在纯培养菌物培养过程中，定时显微观察，若已产孢，即可进行下一步，若未产孢继续培养，若长时间培养均未产孢，需考虑更换培养基，重复上述步骤，直至产孢；步骤2、挑取单孢前期准备：取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净，镊子夹取一块WA培养基，置于载玻片中央待用；步骤3、于WA培养基上，滴1-2滴无菌浮载液，用接种针在产孢菌落组织中轻微晃动，避免挑取菌丝，将接种针针头黏附的孢子置于无菌浮载液中，释放孢子于无菌浮载液中，使用接种针轻微扰动，在不破坏WA培养基的基础上，使孢子尽量分散开来；放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于200μm为宜；将载玻片放置于无菌培养皿中，室温放置数分钟，直至WA培养基上的无菌浮载液蒸发完全，备用；步骤4、使用微型挑孢针挑取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型挑孢针缓慢接近单孢，轻微碰撞单孢使其黏附于针头尖端；若针头尖端难以黏附单孢时，事先将针头浸没于无菌浮载液中；步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至PDA培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验
植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验1、病原菌的分离培养及保存1.1材料：（1）病害组织（2）分离培养基（PDA培养基）：20%土豆煮汁，2%琼脂条，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌（3）次氯酸钠（4）试管斜面培养基：成分为PDA培养基，121℃高温灭菌1.2方法：剪取作物病害部位，将病害部位用次氯酸钠表面消毒后，置于分离培养基上，然后放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，通过菌落形态和孢子镜检挑选出所要分离的病原菌转接试管斜面，然后将斜面放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，包好放于4℃冰箱内低温保存。
2、病原菌摇瓶菌丝体的培养及菌液的制备2.1材料：（1）试管斜面孢子（2）摇瓶培养基：20%土豆煮汁，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌。
2.2方法：将试管斜面孢子转接到摇瓶培养基，然后将摇瓶放到220转/分的摇床上培养，2—3天后，摇瓶菌丝体长到一定的成熟状态（不同真菌菌丝体不同）后，取下摇瓶，放于4℃冰箱内低温保存，待需要做抑菌圈实验时，将摇瓶从冰箱内取出，用组织捣碎机将摇瓶菌丝体高速捣碎2分钟左右，至菌液状态。
3、供试药剂的抑菌圈实验3.1材料：（1）打碎的病原菌菌液（2）底层培养基：2%琼脂粉、蒸馏水，121℃高温灭菌。
（3）上层培养基：成分同PDA培养基，121℃高温灭菌。
（4）链霉素溶液：2400U/mL3.2方法：（1）融化底层培养基，待温度降至70℃，倒入测定木盘，放平至凝固。
（2）融化上层培养基，待温度降至54℃，用无菌移液管加入1mL链霉素溶液以防杂菌干扰；继续降温至48℃，用无菌移液管加入6—12mL的病原菌菌液后迅速晃匀后，倒入测定木盘，放平，待凝固后，即做成抑菌圈实验所用的测定盘。
（3）稀释供试药剂到制定浓度。
（4）在测定盘内摆放牛津杯。
（5）用P型移液器将稀释好的药剂滴入牛津杯内，滴液量为0.26mL/杯，然后盖上玻璃板，放置于28℃恒温培养箱内培养，培养时间为16—18小时。
一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011
4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子 的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。 就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水 洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的 组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭 菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉 酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间 较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间 可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
病原物的分离培养和纯化
病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。
该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。
设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。
长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。
在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。
关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。
通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。
1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。
1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。
植物病原真菌的分离培养精选文档
植物病原真菌的分离培养精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
植物病原菌的分离和培养
实验三植物病原菌的分离和培养一、实验目的在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。
通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。
二、内容、材料和方法(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
(二)分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
分别以玉米大斑病、小麦根腐病和梨褐腐病为试材进行。
(1)叶斑病类病原菌的分离（玉米大斑病病菌的分离）取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。
用10%漂白粉（次氯酸钙）溶液消毒（漂白粉溶液现用现配）3-5min，时间长短依病组织不同而异，然后直接移至PSA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，倒置于20—25℃室温下，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PSA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，弱仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
(2)种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟（处理时间可自30秒至30分钟不等），然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。
病原菌分离培养总结（合集五篇）
病原菌分离培养总结（合集五篇）第一篇：病原菌分离培养总结病原菌的分离培养方法一、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。
最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
二．病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）1.分离的准备工作（1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。
背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。
（2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板； （3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。
（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。
2.组织分离法（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。
（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；（3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。
（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。
腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
）（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—0.1%升汞—无菌水—无菌水—无菌水），将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
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Tips: 实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，
只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）
含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避
免使用。
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2、植物组织和煎汁
许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以 放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即 能做培养基使用。 植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微 生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养 液，如加琼脂即能制成固体培养基。 当然，必须灭菌后才能使用。
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采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可 以采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织 作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等 发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用 得较多的是植物病原细菌的分离。
引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属 (Phytophthora) 的真菌，用这种方法分离的效果也很好。
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2）制作步骤
•马铃薯洗净，去皮称200g切块/条，
•1000ml水煮沸30min，
•用双层纱布滤去薯块，
•加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖，
•待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤， •补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中， •塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。
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自然pH； 调pH值， 也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH 为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。
方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应在 水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部， 用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼 烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正 好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。
注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
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二、真菌分离
植物病原菌的 分离培养，是植物 病理实验室工作中 的基本技能。
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真菌的分离---就是将所需要的真菌与其它杂菌 分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯
培养。
一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气 等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件， 即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种
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3、培养基的分装
根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管
或三角瓶中。
试管分装时，使用玻璃漏斗。 装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的
分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时， 容量不宜超过容积的1/3----1/2。
注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾 湿棉塞而引起污染。
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4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
第一章、植物病原真菌的分离、
培养及纯化技术
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一、真菌学研究中常见的培养基的制作和灭菌
1、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基 马铃薯葡萄糖琼脂：potato dextrose agar, 简称PDA； 马铃薯蔗糖琼脂： potato sucrose agar, 简称PSA。
1）材料：
马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml
1.2 若限于条件实验只能在普通房间进行时，必 须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。 地上多洒些水，以消除室内尘埃，工作台上铺好 湿毛巾，点燃酒精灯。
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•1.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，
放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过 程中频繁走动，破坏环境带来杂菌； •1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；
此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生 态，或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯 培养物是必要的。
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（二）、真菌分离的程序 1．分离前的准备工作 分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下 进行。
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为了保证无菌操作，应注意下面几点：
1.1 清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行， 无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。
抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长
的环境，从而得到纯菌株。
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（一）目的意义
观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出诊断。
同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能 断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面 生长的腐生性真菌。 因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培 养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病 性。
•1.5 无菌操作前还要用70％酒精擦手；
•1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不 要说话等。
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2．分离材料的选择
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。 • 病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、 器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。 • 最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材 料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活 跃，容易分离成功。
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滤膜孔径主要有 0.22 µ m 和 0.45µ m 两种。过 滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。
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5、斜面、平板培养基的制作
试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条， 然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5， 冷凝后即成斜面培养基。 三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板 培养基。
分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，
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从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部 分病害都是适用的。
例如： •果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。
•根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较 远的部分分离。
•值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌 局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到 病菌的。当然，这类病害是比较少的。