MTT法观察DMF致人肝细胞增殖抑制作用
《2024年小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法》范文
《小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法》篇一一、引言在生物医学研究领域，细胞增殖的测定是一项重要的研究工作。
而细胞增殖抑制率的测量则对于药物筛选、毒理学研究及癌症治疗等方面具有至关重要的意义。
其中，MTT法（四甲基偶氮唑蓝法）作为一种常用的细胞增殖检测方法，以其操作简便、结果可靠等特点得到了广泛应用。
在MTT法测定的基础上，IC50（半数抑制浓度）是一个关键性的指标，用于描述药物或其他物质对细胞增殖的抑制程度。
本文将重点探讨在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法。
二、MTT法简介MTT法是一种检测细胞活性的方法，其原理是利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）在活细胞线粒体中的还原作用来反映细胞的增殖情况。
当活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为甲瓒时，可产生蓝紫色结晶物，其量与活细胞数量成正比。
通过测定不同处理条件下的甲瓒生成量，可以间接反映细胞的增殖情况。
三、IC50计算方法IC50是一个重要的药效学参数，用于描述药物或其他物质对细胞增殖的半数抑制浓度。
在MTT法测定的基础上，我们可以通过以下步骤计算IC50：1. 准备数据：首先，需要收集在不同药物浓度下测得的细胞增殖抑制率数据。
这些数据应包括药物浓度、相应的细胞存活率或增殖率等。
2. 数据整理：将数据整理成表格形式，并计算每个药物浓度下的平均值和标准差。
这些数据将用于后续的统计分析。
3. 曲线拟合：使用统计学软件（如GraphPad Prism等）将药物浓度与细胞增殖抑制率进行曲线拟合，通常采用剂量-效应曲线（如Logistic曲线或四参数Logistic曲线）。
4. 计算IC50值：根据拟合曲线的趋势，可以计算出半数抑制浓度（IC50），即引起细胞增殖抑制率达到50%时所需的药物浓度。
一般来说，可以通过读取曲线上对应的药物浓度值来获取IC50。
此外，也可以使用软件自带的计算功能来直接得出IC50值。
四、注意事项在计算IC50时，需要注意以下几点：1. 数据的准确性：确保收集的数据准确可靠，避免误差和异常值对结果的影响。
MTT法在检测细胞增殖方面的探讨
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山西医科 大学学报 （ ｈｎ ｉ ｄＵｎ ）２ ０ ＪＳ ａｘ Ｍｅ ｉ ０ ７年 ３月 ，３ （ ｖ ８ ３
文章编 号 ： １ ０ —６ １ （０ ７ ０ —０ ６ ０ ７ ６ １ ２ ０ ）３ ２ ２—０ ２
ＭＴ Ｔ法在 检 测 细胞 增 殖 方 面 的探 讨
还原 法在 测定 细胞 增殖 活性 中 的作 用 。
１ 材 料 和方 法
２ 结果
选 择 适 当的 细 胞 接 种浓 度 ， 般 情 况 下 ，６孔 一 ９ 培养板 内贴 壁细 胞 长 满 时 约 ５×１ ０ —５×１ 个 细 ０ 胞 ｌ Ｊ经 药物 干 预后 ， 入 二 甲基 亚砜 或 Ｓ Ｓ裂 ， 加 Ｄ 解 液能 溶解 细胞 中 的紫 色结 晶物 ｆｒ ｚｎ 用 酶 标 ｏｍａａ ，
标 仪 （ ｔ ＢＯ—ＲＡ 。 Ｅ本 Ｉ Ｄ）
１ ２ 方 法 ．
１２ １ 接种、 ．． 培养细胞
使用与酶标仪匹配的 ９ ６
此 法 的主要 原 理 是 活 细 胞 线 粒 体 中 的琥 珀 酸 脱氢 酶 能使外 源性 的 ＭＴ Ｔ还 原 为难 溶 性 的蓝 紫结 晶物 ｆｒ ｚｎ 并 沉 积 在 细 胞 中 ， 死 细 胞 无 此 功 ｏｍａａ ， 而
关键词 ： 比色法 ； 细 胞增 殖 ； ＭＴ Ｔ 中图分类号 ： Ｑ一３ １ ３ 文献标识码 ： Ａ
吸光度 值在 ０ ７ ．５—１ ２ ． ５时 ， 这样才 能保 证数 据有线 性关 ＭＴ 比色法 是一种检测 细胞存 活和增殖性 方面有效 Ｔ
系 ， Ｔ比色法才 可灵敏 、 ＭＴ 准确地反映 出细胞数量上 的变化 。 结论
能。
孑 培养板 ， Ｌ 测定细胞增殖每孑体积 ２０ 含约２００ Ｌ ０ ｌ ０
MTT法测定药物对细胞生长抑制作用
实验报告生命科学中的细胞模型姓名：龙珍学号：201120285院系：药学院专业：药理学提交日期： 2012年3月31日实验一ＭＴＴ法测定药物对细胞生长的抑制作用实验原理：ＭＴＴ比色法原理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的ＭＴＴ还原为蓝紫色的结晶甲臜。
后者结晶产物的量与活细胞数目成正相关，而死细胞或红细胞没有此功能。
结晶用ＤＭＳＯ、无水乙醇、酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长为490ｎｍ进行比色,所检测的吸光值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。
实验步骤：→ →→→1.不同浓度药物的生长抑制率如下浓度吸光度（x±s）抑制率（%）存活率（%）（ug/ml）0 0.594333±0.142028 0 1000.1 0.384333±0.00866 35.3337 64.66630.2 0.505333±0.005774 14.9748 85.02520.4 0.376±0.081984 36.7358 63.26420.8 0.261667±0.004619 55.9731 44.02691.6 0.207667±0.001732 65.0589 34.94112.细胞存活率-药物剂量对数图IC50=679.218ug/ml3.讨论：○1.加药之前细胞贴壁效果不是很好，分布不太均匀，个别孔细胞有点聚集，加MTT之前药物抑制作用明显，尤其体现在是浓度为1.6 mg/ml组。
浓度为0.5 mg/ml 抑制相对明显，其他孔在形态上看不到太明显现象。
○2.加DMSO之后颜色对比明显，并且梯度效果比较好，平行孔间颜色较均匀，而且浓度为0.4ug/ml的颜色和其它孔之间也有区别，能够体现出抑制作用。
○3最后通过酶标仪测得的OD值和上述观察到的现象较吻合。
○4.前面已经说到细胞的贴壁效果不是很好，所以不能够完全判定药物的抑制作用，因为如果孔内的细胞状态不好也有可能导致细胞死亡。
mtt法检测细胞增殖
MTT法检测细胞增殖前言细胞增殖是生物体生长和发育的基本过程之一，也是许多疾病的病理基础。
因此，准确测定细胞增殖的能力对于生物医学研究具有重要意义。
MTT(Methylthiazolyl tetrazolium)法是目前常用的细胞增殖分析方法之一，能够可靠地简单测定细胞增殖的活性。
本文将介绍MTT法的原理和操作步骤，并对其优缺点进行分析。
MTT法原理MTT法是一种基于细胞代谢活动的间接检测方法。
其基本原理是利用细胞对MTT的还原作用，通过测定产生的紫色产物的吸光度来间接反映细胞增殖的活性。
MTT是一种黄色的可溶性化合物，能够通过细胞内氧化还原酶系统还原为紫色的结晶体—formazan。
被还原的formazan会在细胞内积累，并且随着细胞数量的增加而增加。
在MTT法中，细胞被处理后，MTT溶液被加入到培养基中，经过一段时间的孵育后，细胞会将MTT还原为formazan，形成紫色的晶体。
随后，使用溶解剂溶解晶体，使其可溶于溶液中，最后通过光谱仪测定溶液的吸光度。
在MTT法中，吸光度的值与细胞数量成正比，因此可以通过比较不同处理组细胞的吸光度值来评估细胞增殖能力的差异。
操作步骤以下是使用MTT法检测细胞增殖的基本操作步骤：1.准备细胞培养物：将需要进行细胞增殖检测的细胞培养在含有适当培养基的培养皿中。
确保培养皿的表面充分涂覆了细胞，并且培养皿中的细胞密度适中。
2.处理组织/药物/生物活性物质：根据实验设计的需求，将细胞培养在含有需要测试的药物或生物活性物质的培养基中。
如果是对不同处理组进行比较，需要设置对照组。
3.孵育细胞：将培养皿放入恒温培养箱或细胞培养箱中，以维持适当的温度、湿度和气体环境，使细胞进行增殖。
孵育时间根据实验需要而定，通常为24-72小时。
4.添加MTT溶液：取出培养皿，将预先配好的MTT 溶液均匀地加入到培养基中，确保与细胞充分接触。
MTT 溶液的浓度和加入量可以根据实验要求进行调整。
《2024年小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法》范文
《小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法》篇一一、引言细胞增殖抑制率是评估药物或治疗手段对细胞生长的影响程度的重要指标。
MTT法（四甲基偶氮唑蓝比色法）是生物学研究中常用的方法之一，它能够快速且有效地检测细胞增殖及活性的变化。
而IC50（半数抑制浓度）则是描述药物或抑制剂在细胞增殖抑制率达到50%时所需的浓度，是评估药物效果的重要参数。
本文将就如何在MTT法中计算IC50进行小议。
二、MTT法的基本原理与步骤MTT法是一种基于细胞代谢活性的检测方法。
其基本原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶活性将外源性黄色染料MTT还原为蓝色甲瓒结晶并沉积在细胞内，进而通过检测结晶物的形成来评估细胞的活性及增殖情况。
具体步骤如下：1. 细胞培养与处理：将待测细胞进行培养，并按照实验需求进行药物或抑制剂处理。
2. MTT溶液的制备：将MTT粉末溶解于PBS或培养基中，制备成MTT溶液。
3. 细胞与MTT溶液的共孵育：将处理后的细胞与MTT溶液共孵育一定时间，使MTT被活细胞还原为甲瓒结晶。
4. 结晶物的溶解与检测：通过加入溶解剂（如异丙醇等）使结晶物充分溶解，然后通过酶标仪等设备检测溶解液的光密度值。
三、IC50的计算方法在得到不同药物或抑制剂浓度下的细胞增殖抑制率后，可以通过统计分析的方法来计算IC50值。
具体步骤如下：1. 数据整理：将不同药物或抑制剂浓度下的光密度值（OD 值）与对照组OD值进行比值计算，得到细胞存活率或增殖抑制率。
然后按照药物或抑制剂浓度的对数值进行整理。
2. 绘制剂量-效应曲线：以药物或抑制剂浓度的对数值为横坐标，以细胞存活率为纵坐标，绘制剂量-效应曲线。
通常采用Logit曲线或回归曲线来拟合数据。
3. 计算IC50值：通过剂量-效应曲线上的曲线变化规律来估算IC50值。
通常使用曲线拟合软件进行自动计算或通过插值法来手动计算IC50值。
IC50值即表示当细胞增殖抑制率达到50%时所需的药物或抑制剂浓度。
MTT法检测细胞存活率或抑制率详细步骤SOP14
Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:MTT法检测细胞存活率或抑制率●基本原理:MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethyl thiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可用DMSO（分析纯）来溶解。
利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
●试剂配制：MTT溶液：用pH=7.4的PBS配制成5mg/ml浓度的溶液，避光保存)●MTT法检测细胞存活率或抑制率详细步骤1接种细胞：用含10％胎/小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔103-105个细胞接种到96孔板，每孔体积100-200μl.2:培养细胞：同一般培养条件，培养1-2天（原代细胞不同，可根据试验目的和要求决定培养时间，神经元7-10天，心肌细胞8-14天）。
3 吸去原培养基，每孔加入以无血清培养基配制的不同浓度药物（原代细胞例外）。
4培养24或48h后，每孔加MTT溶液（5mg/ml，用pH=7.4的PBS配制，避光保存)10-20μl.（每孔培养基为100μl，加10μl，每孔培养基为200μl，则加20μl）。
5 37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液（对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液）。
6每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
7比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线。
某药物对细胞迁移和增殖的影响实验
某药物对细胞迁移和增殖的影响实验一、实验背景和目的细胞迁移和增殖是细胞生物学中的重要过程，也是很多疾病的发生和发展过程中不可或缺的环节。
因此，探究药物对细胞迁移和增殖的影响具有重要意义。
本实验旨在研究某药物对细胞迁移和增殖的影响。
二、实验材料和方法1. 实验材料（1）人类肝癌细胞株（HepG2）；（2）DMEM培养基；（3）FBS；（4）PBS；（5）某药物。
2. 实验方法（1）培养HepG2细胞：将HepG2细胞株接种于含10% FBS的DMEM培养基中，在37℃下孵育24小时。
（2）制备实验液：将某药物加入DMEM培养基中，使其浓度为0、10、20、30、40μM。
（3）MTT法检测细胞增殖：将上述不同浓度的实验液加入孵育好的HepG2细胞中，孵育24小时后加入MTT试剂，孵育4小时后加入DMSO，测定OD值。
（4）Transwell法检测细胞迁移：将上述不同浓度的实验液加入孵育好的HepG2细胞中，孵育24小时后将细胞收集并重新悬浮于DMEM培养基中，然后将其移植至Transwell上室中，下室中加入含10% FBS的DMEM培养基，孵育24小时后观察并计数迁移的细胞数。
三、实验结果和分析1. 实验结果（1）MTT法检测细胞增殖：随着药物浓度的增加，HepG2细胞的增殖能力逐渐降低。
当药物浓度为40μM时，HepG2细胞的增殖率最低。
（2）Transwell法检测细胞迁移：随着药物浓度的增加，HepG2细胞的迁移能力逐渐降低。
当药物浓度为40μM时，HepG2细胞的迁移率最低。
2. 结果分析从实验结果可以看出，某药物对HepG2细胞具有明显的抑制作用。
随着药物浓度的增加，细胞的增殖和迁移能力逐渐降低，说明该药物可以有效地抑制HepG2细胞的生长和转移。
这为药物在肝癌治疗中的应用提供了实验依据。
四、实验结论本实验结果表明，某药物可以有效地抑制HepG2细胞的生长和转移。
随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强。
MTT法测定药物对细胞生长抑制作用
MTT法测定药物对细胞生长抑制作用MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用是一种常用的细胞毒性测定方法。
该方法基于细胞内巯基苯并噻唑(MTT)的还原反应，通过检测细胞生长所需的线粒体呼吸功能的活性来评估药物对细胞的毒性。
以下是关于MTT法测定药物对细胞生长抑制作用的详细内容。
首先，MTT是一种无色的化合物，被存活的细胞吞噬并在细胞的线粒体中还原为产生紫色的可溶性四氧化换硫基苯并噻唑盐 (formazan)。
这种紫色的产物能够通过溶解作为代表细胞数量的指标，用于测定细胞的代谢活性和增殖情况。
MTT法的步骤如下：1.培养细胞：首先，需要选择适当的细胞系，并进行培养。
细胞培养应保证细胞处于良好的生长状态，并且细胞数量要足够用于实验。
2.制备实验组：将药物溶解或稀释到适当的浓度。
根据实验需要，设计不同的药物浓度梯度。
一般来说，浓度梯度从高到低分别为100%、50%、25%、12.5%等。
3.预处理细胞：将细胞分装到含有培养基的孔板中，每个孔中的细胞数量要相同，以便结果的可比性。
4.细胞暴露：将预处理好的药物加入到细胞孔中。
同时，在其他孔中加入适当的阳性对照和阴性对照。
5.孔板孵育：将装有药物和细胞的孔板放入CO2培养箱中，在37℃的恒温条件下孵育适当的时间，通常为24-72小时。
6. MTT添加：将MTT添加剂加入每个孔中，使其浓度达到0.5mg/ml 至1.0mg/ml。
MTT添加剂一般是MTT溶解在无菌培养基中。
7. 孔板孵育：继续将孔板放回CO2培养箱中，在37℃的恒温条件下孵育2-4小时。
期间，MTT会被还原为紫色的formazan产物。
8. 溶解formazan：去除培养基，加入适当的溶剂(例如二甲基亚砜)溶解formazan产物，使其溶解彻底。
9. 分析：利用比色计或酶标仪检测每个孔中formazan的光密度。
光密度与细胞的数量成正比，因此可以通过光密度的变化来评估药物对细胞生长的抑制效果。
通过MTT法测定药物对细胞生长抑制作用，可以为药物筛选提供有关药物毒性和抑制效力的信息。
细胞增殖实验(MTT assay)
MTT实验一．实验原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。
三．实验步骤1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。
2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。
（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。
）3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。
《2024年小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法》范文
《小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法》篇一一、引言细胞增殖抑制率的研究在生物医学领域具有重要价值，常用于药物筛选、疾病治疗等方面。
MTT法（四甲基偶氮唑蓝比色法）作为一种常用的细胞增殖检测手段，能准确、快速地测定细胞增殖情况。
其中，IC50（半数抑制浓度）是评估药物或其他化合物对细胞增殖抑制效果的重要指标。
本文将重点讨论在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法。
二、MTT法简介MTT法是一种通过测定细胞线粒体代谢活性来评估细胞增殖的常用方法。
该方法利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）的黄色可溶性衍生物，在活细胞线粒体内脱氢酶的作用下，生成蓝色结晶状甲瓒颗粒，通过测定甲瓒颗粒的数量来反映活细胞的数目。
三、IC50计算方法IC50是指在一定时间内，对细胞增殖产生50%抑制作用的药物浓度。
在MTT法中，计算IC50的步骤如下：1. 准备数据：首先，需要收集不同浓度药物处理下的细胞增殖数据，包括各浓度下的吸光度值（OD值）和相应的药物浓度。
2. 绘制曲线：以药物浓度为横坐标，以各浓度下的OD值为纵坐标，绘制剂量-效应曲线。
通常采用非线性回归分析方法进行拟合，如Logistic曲线或剂量-效应曲线模型等。
3. 确定IC50值：根据剂量-效应曲线，找到使细胞增殖抑制率达到50%时的药物浓度，即为IC50值。
可以通过直接从曲线上读取或使用相关软件进行计算。
四、注意事项1. 实验条件控制：在进行MTT法实验时，应严格控制实验条件，如细胞密度、培养时间、药物作用时间等，以确保实验结果的准确性。
2. 数据处理：在计算IC50值时，应采用合适的统计方法和软件进行数据处理和分析，以确保结果的可靠性。
3. 重复性实验：为了确保结果的准确性，应进行多次重复性实验，并取平均值作为最终结果。
五、结论IC50是评估药物或其他化合物对细胞增殖抑制效果的重要指标，其计算方法在MTT法中具有重要价值。
通过本文的介绍，我们了解了IC50的计算步骤和注意事项，为进一步研究药物或其他化合物对细胞增殖的影响提供了有益的参考。
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・论著・MTT 法观察DMF 致人肝细胞增殖抑制作用房云1 杨锦蓉2 王菁13 【摘要】目的 观察不同染毒剂量二甲基甲酰胺(DMF )对正常成人离体肝细胞的增殖抑制作用。
方法 用MTT 比色法观察细胞生长变化,分别以1156mm ol/L 、6125mm ol/L 、25mm ol/L 、100mm ol/L DMF 为染毒剂量,以6h 、12h 、24h 为染毒时间对人肝细胞进行培养。
比较在不同时间下,不同染毒剂量组与阴性组的细胞生长率。
结果 同一染毒时间组内,不同剂量组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(F =27141、23186、111122,P <0101),以100mm ol/L DMF 组细胞增殖率为最低,但不同染毒剂量组细胞生长变化率未见明显剂量2效应关系,染毒6h 和12h 25mm ol/L 组的细胞生长变化率高于其他浓度组;同一染毒剂量组内,各不同染毒时间组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(F =27180、29179、42147、28188,P <0101),以24h 组细胞增殖率为最低。
结论 与阴性组比较,DMF 对细胞增殖有抑制作用;但不同染毒剂量组细胞生长变化率的剂量2效应关系不明显;随染毒时间延长,同一染毒剂量组内细胞增殖活性变化率有下降趋势,有一定染毒时间2效应关系。
【关键词】二甲基酰胺;肝细胞毒性;噻唑兰实验中图分类号:R -332 文献标识码:A 文章编号:100720931(2006)1120001203I nhibitory E ffect of DMF on Cell Proliferation of H um an H ep atocyte Determined by MTT AssayF ANG Yun ,WANG Jing ,Y ANG Jin 2rong.(The Institute o f Occupational and EnvironmentalH ealth ,Zhejiang University ,Hangzhou ,Zhejiang ,310006,China )【Abstract 】Objective T o explore the inhibitory effect on cell proliferation of human hepatocyte by N ,N 2dimethylformamide(DMF )in vitro.Methods The human hepatocytes were exposed to DMF with dose of 0mm ol ΠL ,1156mm ol ΠL ,6125mm ol ΠL ,25mm ol ΠL and 100mm ol ΠL respectively and each dose group was exposed to DMF for 6h ,12h and 24h.M ethylthiaz oltetraz olium assay (MTT assay )was performed to com pare cell proliferation rate am ong these groups.R esults At same point of exposure time ,cell proliferation rates am ong different dose groups had statistically significant difference (P <0101),of which 100mm ol ΠL DMF group was lowest.But the dose 2effect relationship could not be observed.The hepatocyte proliferation rates in 25mm ol ΠL DMF group with exposure time for 6h and 12h were higher than other groups.In same dose groups ,cell proliferation rates am ong different exposure time groups had statistically significant difference (P <0101),of which exposure for 24h was lowest.Conclusions C om pared with control group ,DMF has inhibitory effect on cell proliferation.H owever ,a dose 2dependent relationship between cell proliferation and DMF concentration is not obvious.Cell proliferation rate declines with the prolongation of exposure time to DMF ,and time 2effect relationship exists.【K ey Words 】N ,N 2dimethylformamide ;Hepatotoxicity ;M ethylthiaz oltetraz olium assay浙江省医药卫生科学研究基金;编号:2005B019作者单位: 1.浙江大学医学院劳动卫生与环境卫生研究所; 2.浙江省疾病预防控制中心 3通讯作者 二甲基甲酰胺(N ,N 2dimethylformamide ,DMF )是无色带有鱼腥味的液体,一种用途广泛的化工原料和溶剂,被广泛应用于萃取、有机合成、染料、纤维、皮革、制药等工业。
随着现代化工业的发展,DMF 的应用范围不断扩大,但最近几年不断有接触DMF 导致中毒的报道[1、2]。
DMF 对作业人群职业安全存在很大的隐患。
国内外对DMF 致职业人群健康影响的流行病学调查已有较多报道,但是目前DMF 致肝细胞抗毒的抗剂尚未见报道,本实验以正常人体外培养肝细胞为观察对象,研究不同DMF 染毒剂量及不同染毒时间对肝细胞生长变化的影响,探讨DMF 致肝细胞损伤机制。
材料与方法1 试剂和仪器 二甲基甲酰胺(DMF ),AMRESC O 公司;新生牛血清(F BS ),杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶,AMRESC O 公司;噻唑蓝(MTT ),AMRESC O 公司;二甲基亚砜(DMS O ),浙江杭州双林化工试剂厂;谷氨酰胺,AMRESC O 公司;丙酮酸钠,上海康捷生物科技发展有限公司;RP Ml 1640培养基,美国GI BC O 公司;Olympus光学显微镜,日本Olympus公司;Synergy(Bio-T ek)酶标仪,美国;NIK ON数码摄像机,日本。
2 细胞培养 实验用肝细胞系正常成人肝细胞,购于中科院上海细胞库,代号为H L-7702。
将购置的细胞放入5% C O2、37℃培养箱中培养并进行传代、消化、种瓶、换液。
3 MTT实验[3] 把处于对数增长期的细胞制备成密度约5×105cell/ml细胞悬液,将其接种于96孔板上,每孔200μl,放入培养箱中培养24h后,各染毒组每孔加RP MI1640培养液180μl、不同浓度的DMF溶液20μl,使DMF终浓度为1156mm ol/L、6125mm ol/L、25mm ol/L、100mm ol/L[4];阴性组加RP MI1640培养液180μl;空白组不加任何试剂。
染毒后放入培养箱中继续培养并开始计时。
每组设置12个平行孔。
各剂量组均设置3个染毒时间,分别为6h、12h、24h。
染色时阴性组、染毒组、空白组各孔均加RP MI1640培养液180μl,20μlMTT染液,MTT染液终浓度为015mg/m1。
染色后置培养箱中继续培养4小时,培养结束后将各孔中液体吸净,加入150μl DMS O,在酶标仪中振荡10min,致紫色结晶全部溶解,570nm波长处测定其吸光度值。
4 细胞形态学变化 把处于对数增长期的细胞进行DMF 染毒处理,方法同MTT实验,染毒结束后在显微镜下观察细胞形态改变。
5 细胞生长变化率[3] 记录每个观察时间下各组的吸光度值,比较在各染毒时间下不同剂量染毒组及阴性组之间的细胞增殖情况,以细胞生长变化率表示。
以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制细胞增殖曲线图。
6 统计方法 运用spss1115统计软件包处理数据,对结果进行单因素方差分析。
结 果1 不同染毒剂量及不同染毒时间细胞生长变化率 各剂量组与阴性对照组生长变化见表1。
表1 不同染毒时间和剂量组细胞生长变化率比较(x±s)浓度组mm olΠL6h12h24h F P阴性组1100±01001100±01001100±0100--11560188±01100176±01110165±0111271800100 61250184±01070175±01130159±0109291790100 250189±01110178±01130158±0109421470100 1000175±01080170±01130152±0109281880100F2714123186111122P010********* 从表1可见:同一染毒时间组内,不同剂量组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(P<0101)。
以100mm ol/L DMF组细胞增殖率为最低,但染毒6h和12h时间组内,25mm ol/L DMF组细胞增殖变化率为最高,24h时间组内, 1156mm ol/LDMF组细胞增殖变化率为最高;同一染毒剂量组内,各不同染毒时间组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(P<0101),以24h组细胞增殖率为最低。
2 不同染毒时间各染毒剂量组细胞增殖活性变化趋势 各染毒剂量组细胞生长变化率均小于阴性组。
在各个染毒剂量组内,表现为随染毒时间增加,细胞生长变化率有一定程度下降,但培养6h和12h后25mm ol/L组出现上升趋势。
在各个染毒时间段内,随DMF剂量增高细胞生长变化率出现时间2效应关系,但未见细胞生长变化率随染毒时间延长出现明显下降趋势。
3 细胞形态学比较 400倍荧光显微镜下观察,正常成人肝细胞,细胞形状呈梭形、菱形、多角形等多种形态。