反相高效液相色谱法测定环境有害物质酚酞含量的研究2012

反相高效液相色谱法测定环境有害物质—酚酞含量的研究谭丙文 1 罗志焕1(1立创（中山）检测技术服务有限公司，中山，528415摘要(Abstract)：本文研究并建立采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC-DAD)测定环境有害物质——酚酞含量的方法。

酚酞采用色谱纯甲醇常温超声萃取，色谱分离柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18分析柱(4.6mm*250mm*5μm)，以色谱纯甲醇(100%)为单一流动相等度洗脱测定。

紫外检测波长λ=276nm(定量波长)/229nm(辅助定性波长)，TCC柱温箱温度设置为30℃。

标准曲线线性范围1μg/mL～100μg/mL，线性方程A=27.35039C－1.96508*10-2，相关系数0.9999，最低检出限0.37μg/mL，平均回收率101.1%，相对标准偏差RSD为0.06%(n=10)。

该方法简单、灵敏、准确、快速，为我国应对REACH SVHC产品检测及质量控制提供了一个实用便捷的分析方法。

关键词(Key Words): 反相高效液相色谱法(RP-HPLC-DAD) 等度洗脱(Isocratic Elution) 酚酞(Phenolphthalein) 超声萃取(Ultrasonic Extraction)前言(Preface)：酚酞，英文学名：Phenolphthalein，分子式C20H14O4，分子量318.33，美国化学文摘社标准CAS号为：77-09-8。

学名：2-［双-（4-羟苯基）甲基］苯甲酸。

无色或微黄色晶体。

熔点257～259℃。

密度 1.277g/cm3。

溶于甲醇、乙醇、乙醚和碱液，难溶于水。

溶于碱液或碱金属的碳酸盐溶液而呈现红色。

在浓碱溶液中则生成无色的三金属盐，红色褪去。

可由邻苯二甲酸酐与苯酚混合后和硫酸共热制得。

化学结构式及标准EI质谱图谱如下图所示：酚酞在实验室中经常用作酸碱滴定的专用指示剂，变色范围pH8.2～10.0，由无色变红。

医药上用作轻泻剂，能刺激肠壁，引起肠的蠕动促进排便，因此目前在一些医用减肥产品或减肥类食品、保健食品常加入酚酞。

已有研究指出：过量服用该类含有酚酞的减肥产品会对人的身体存在极其严重的副作用，建议消费者不要盲目地使用该类产品以保证身体的健康。

而REACH法规则是欧盟规章《化学品注册、评估、许可和限制》(Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals)的简称，是欧盟于2007年6月1日起就开始实施的化学品监管体系，其目的在于进一步加强对人类健康和环境的保护，保持和提高欧盟化学工业的竞争力。

最近在2011年12月19日，酚酞被REACH主管部门欧盟化学品管理局(ECHA)公布为第六批20种高度关注物质(SVHC)清单中的一种。

当产品中所含此类物质大于0.1%，企业必须向欧盟化学品管理局申请授权或通报，并且必须向采购商和消费者进行公示。

更新至目前REACH法规公布的限制SVHC物质共六批73项。

作为第三方检测机构实验室，开发出快捷、灵敏、准确的分析检测方法以便更好地服务于生产企业，更是刻不容缓。

本文作者开始研发时采用GC-FID（气相色谱-氢火焰离子化电离检测器）及GC-Q-MSD （气相色谱-单四级杆质谱检测器）尝试气相条件下气化并分离酚酞(Phenolphthalein)，从而打碎酚酞分子，依次辨别特征碎片离子。

但实验结果反馈的实际情况是：标样浓度点10μg/mL （色谱纯甲醇溶解酚酞标准品并定容），FID色谱峰形很难辨别清晰，MSD做Full-Scan全扫描，无法见到如上图的标准EI质谱图的特征离子碎片，TIC图峰形也难以辨别清楚。

进样100μg/mL也只能勉强辨别一点点色谱峰或质量色谱峰。

正如前文所述，酚酞分子熔点相对较高，气化较难，气相色谱技术应用在酚酞测定上很难开展，于是很自然的想到了应用HPLC技术来分离高沸点热不稳定化合物（这正是高效液相色谱技术的强项！）。

本文作者分析酚酞分子含有两个极性基团—OH，可采用紫外检测器（VWD/MWD/DAD）或ESI-MS/MS （电喷雾离子化-三重串联四级杆质谱检测器）来检测分析酚酞含量。

在综合衡量了成本、效益、灵敏度等因素的“色谱分离三角”后，本文作者主攻选用反相高效液相色谱—光电二极管阵列检测器(RP-HPLC-DAD)来测定酚酞含量，优化色谱分离条件后，方法检出限MDL 满足我司检测要求，且该方法简单、灵敏、准确、快速，为我国应对REACH SVHC产品检测及质量控制提供了一个实用便捷的分析检测方法。

1 实验部分(Experiment Part)1.1仪器、试剂与标准品美国安捷伦公司Agilent 1260 Infinity HPLC，配DAD光电二极管阵列检测器。

KQ5200DB型超声波仪（昆山市超声仪器有限公司制造，40KHZ，功率：200W）。

甲醇（HPLC色谱纯）,德国默克公司Merck制造。

酚酞标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司制造，纯度：98.0% ，带标准物质证书。

1.2标准储备溶液的准备根据标物证书纯度标示，准确称取0.1021g酚酞标准品于干净烧杯中，加入10mL色谱纯甲醇，超声助溶，转移至100mL容量瓶中，甲醇润洗烧杯几次转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，即成1000μg/mL标准储备液，依次稀释成1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL系列标准曲线使用溶液。

本文采用10μg/mL浓度点进行方法开发的源头。

1.3样品前处理取代表性的样品，剪碎至2mm×2mm，混匀。

称取样品1.0g（精确至0.001g）样品，置于50mL具塞试管中，加入10mL甲醇溶液，密封好塞子，在超声清洗器中室温提取60min。

然后过0.45μm过滤头过滤至2mL样品瓶中，上HPLC测试。

1.4高效液相色谱条件色谱分离柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18分析柱(4.6mm*250mm*5μm)；流动相：甲醇（100%）为单一流动相等度洗脱，流动相流速：1 mL/min；紫外检测波长λ=276nm(定量波长)/229nm(辅助定性波长)，带宽：4nm，狭缝：2nm；TCC柱温箱温度：30℃；进样量：20μL；DAD光谱扫描波长λ：190nm～400 nm，步进值：1 nm。

2 结果与讨论(Analytical Results & Discussion)2.1流动相及色谱分离条件的优化选择据查文献，多数文献报导推荐使用甲醇/水流动相体系，比例有的60%：40%，有的70%：30%，有的添加了1%磷酸(H3PO4)缓冲盐，有的添加了0.5%冰醋酸(HAc)，如此等等。

本文作者方法开发思路为：在力求保证分离度、灵敏度、分析速度的“色谱分离三度”的大前提下，尽量简化流动相的配比组分，因此项目组分较为单一简单，先不采用缓冲盐，而采用甲醇/水流动相体系进行分离，若调试后仍不能满足“三度”，则再配制缓冲盐进行优化调试。

另外可通过DAD紫外光谱扫描功能，确定酚酞(Phenolphthalein)的最佳吸收波长λ。

方法开发第一针的摸索条件：甲醇：水=60%：40%，流动相流速：1mL/min，紫外检测波长λ=？未知，只能在紫外区间任意设置一个。

得出的第一张HPLC谱图如下图：初步确定该图示的色谱峰为酚酞(Phenolphthalein)，打上标记，查阅该色谱峰顶的3D光谱图为下图：通过查阅酚酞(Phenolphthalein)紫外吸收光谱图，确定该色谱峰为目标化合物色谱峰，光谱图完全匹配。

从光谱图确定229nm为第一特征灵敏度吸收峰，276nm为第二特征灵敏度吸收峰。

查看两条谱线的HPLC色谱图比较得出，虽然λ1=229nm灵敏度是λ2=276nm灵敏度的将近6倍，但λ1=229nm HPLC色谱图明显杂质峰较多，λ2=276nm HPLC色谱图杂质峰较少，干扰较少，故选择λ2=276nm谱线作为定量波长，选择λ1=229nm谱线作为辅助定性波长。

从而确定最佳吸收波长。

接下来的事情就是优化HPLC色谱峰形，让色谱峰更加“尖锐点”，从而更好地降低信号检出限、方法检出限。

从第一张HPLC色谱图来看，目标化合物峰形出现前伸峰，且10ppm 信号也不是很高。

经验告诉我们：很明显就是甲醇/水流动相系统某一组分含量不够导致HPLC色谱峰形助推动力不足，从而不够“尖锐”！这样无助于降低信号检出限、方法检出限，调高水相比例如何？甲醇：水=50%：50%，进样调试，得出的HPLC谱图如下图：信号降低了，通过查阅该图的峰顶点3D光谱图并比较上图，得出该色谱峰并不是酚酞(Phenolphthalein)，另外通过On-line Plot在线谱图窗口观察：在设定的分析时间内，目标化合物Phenolphthalein没有出峰，而是在大约12.30min出峰。

通过第二针的谱图我们可以得出以下结论：流动相体系甲醇组分含量需要“更猛一点”，甚至直接来个100% ，从而将色谱峰形推动得更加“尖锐”，信号更高，无扁头峰、前伸峰、拖尾峰，信号检出限、方法检出限自然能降得更低。

但一个要注意的前提是：不能将目标峰助推到和杂质峰重合在一起。

方法开发的中间步骤可以多设几步流动相组分依次改变的细化条件来实现逐步优化，现在的方向是：依次调高甲醇(Methanol)组分，比较得出最佳色谱峰形。

甲醇：水=90%：10%，得出的色谱图为下图：色谱峰形变得比较尖锐了，信号也提高了，但仍出现前伸峰。

改为甲醇：水=100%：0%，得出的色谱图为下图：流动相系统甲醇比例已经是100%了，峰形尖锐，峰宽狭窄，呈现出较为对称的高斯峰形(Gaussian Peak)，同时信号已经提高到最高，再通过点击峰顶点查看3D光谱图，确定该HPLC色谱峰为酚酞(Phenolphthalein)，无杂质干扰。

从而确定最优化流动相比例为：甲醇(Methanol)=100%，等度洗脱，4min内完成色谱分离，同时通过3D-光谱图来进一步辅助定性判断样品是阳性(Positive)抑还是阴性(Negative)。

通过最优化的HPLC色谱图，初步判断最低浓度点能做到1μg/mL，下面将作标准曲线线性范围的讨论。

2.2标准曲线线性实验精密称取0.1021g酚酞标准品于干净50mL烧杯中，加入10mL色谱纯甲醇，超声助溶，转移至100mL容量瓶中，甲醇润洗烧杯几次转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，即成1000μg/mL标准储备液，依次稀释成1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL系列标准曲线使用溶液。