原发免疫性血小板减少症GPIIb／IIIa抗体检测的临床意义

பைடு நூலகம்
C MY K
实用医学杂志 ２０１５ 年第 ３１ 卷第 ２０ 期
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微球：７０ 滋ｇ 单抗，室温下震荡摇匀 ２ ｈ。 ３０００ × ｇ离 心 １５ ｍｉｎ，然后用 ＰＢＳ ／ Ｔｗｅｅｎ 洗涤 ３ 次。 单抗包被 好的微球加入微球封闭液，震荡封闭 ２ ｈ。 ３０００ × ｇ 离心 １５ ｍｉｎ，然后用 ＰＢＳ ／ Ｔｗｅｅｎ 洗涤 ３ 次。 包被后 的微球用微球储存液（含 ０．０２％叠氮钠）重悬，调节 微球最终浓度为 ０．２５％，储存在 ４℃冰箱、备用。 分 别 于 第 １、３、７、１４、２１、２８、３５、４２ 天 检 测 微 球 的 包 被效果及稳定性。 １．３．２ 样本的采集和处理 依照患者血小板计数 （采血前先行血象检查）， 用枸橼酸钠抗凝管采集 外周静脉血 （根据血小板计数使采集血液中至少 含有 １ × 1０７ 个血小板，参考文献［10］）。 按文献［１1］制 备富血小板血浆（ＰＲＰ），转移至 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管，３０００ ×ｇ 离心 ５ ｍｉｎ，ＰＨ６．２，０．０５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的枸橼酸钠洗 涤血小板 ５ 次，３０００Ｘｇ，２ ｍｉｎ。加枸橼酸钠摇匀，光 镜下计数，取 １ × １０７ 个血小板放于 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中， ３ ０００ × g 离心，弃上清，然后加入 １１０ 滋L 裂解液 （含 ｌ％ＴｒｉｔｏｎＸ鄄１００），室温下裂解 ２０ ｍｉｎ 后 ５ ０００ × g 离心 ５ ｍｉｎ，将上清液转入到另一个 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管。 １．３．３ 抗原俘获及流式细胞仪检测 取包被好的 微球，震荡混匀，加入 ４ 滋L（浓度为 ４ ０００ 个 ／ 滋L） 单抗包被过的微球至裂解后的上清液中，室温下 震荡孵育 ２ ｈ。 ５ ０００ × g 离心 ５ ｍｉｎ，弃掉上清液， 用 ＰＢＳ鄄ＴＷＥＥＮ 液洗涤 ３ 次，稍后加入 ０．０１ mol ／ L ＰＢＳ ９８ 滋L，重悬微球。 加入 ２ 滋L ＰＥ 标记的羊抗人
组别 ITP 组与非免疫性血小板减少组比较 ITP 组与正常对照组比较 非免疫性血小板减少组与正常对照比较
字2 值 17.33 31.37
2.80
P值 < 0.001 < 0.001
0.25
假如将正常对照组 ＭＦＩ 比率的上限定为界值， 比率＞ １．９３ 的样本当作阳性（即视为 ＩＴＰ），则 ＣＢＡ 在 ＩＴＰ 诊断中的敏感性为 ７１．８８％，特异度为８４．６２％。 由 ＲＯＣ 曲线（图 １）得 ＣＢＡ 辨别 ＩＴＰ 患者和非免疫 性血小板减少患者的能力（即鉴别效度）为 ０．８４８。
关键词 血小板； 紫癜； 流式微球技术； 血小板糖蛋白 ＧＰⅡｂ ／ Ⅲａ 复合物
原 发 免 疫 性 血 小 板 减 少 症 （pｒｉｍａｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ， ＩＴＰ）是临床上常 见 的 出 血 性 疾 病，目前认为 ＩＴＰ 发病机制是体液免疫和细胞免疫 异常导致血小板破坏增多、 生成减少而最终以外 周血血小板减少、皮肤黏膜出血为特征的疾病 。 ［１-3］ 目前，ＩＴＰ 仍为排除性诊断，尚无可供应用的“金标 准”，需要排除自身免疫性疾病和其他原因所致继 发性血小板减少之后才能诊断 ＩＴＰ 。 ［4－6］ 因此需要 一个特异性强的实验室诊断指标， 以进一步确定 临床诊断， 并能鉴别免疫性与非免疫性血小板减 少。 流式微球技术（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ， ＣＢＡ）是 建立在荧光免疫技术、 免疫微球捕获技术和流式 细胞术等实验技术上的一种用途广泛的实验方 法。 其大致原理是：聚苯乙烯被用作捕获小分子物 质的载体。 用 ＣＤ４１ａ 单抗物理吸附于微球表面（包 被微球），之后利用 ＣＤ４１ａ 单抗包被后的微球和血 小板裂解液一起孵育， 之后加入藻红蛋白标记的 二抗。 如果血小板表面存在针对 ＧＰⅡｂ ／ Ⅲａ 的特 异性自身抗体，则形成：包被微球－ＣＤ４１ａ 单抗－ＧＰ Ⅱｂ ／ Ⅲａ－针对 ＧＰⅡｂ ／ Ⅲａ 的自身抗体－ＰＥ 标记的 羊抗人 ＩｇＧ 多克隆抗体这样一个复合物结构。 上 机检测则表现为微球的荧光强度较对照增强。 笔 者运用 ＣＢＡ 检测了血小板减少症患者和正常对照 血样中血小板膜表面的抗 ＧＰⅡｂ ／ Ⅲａ 自身抗体， 探讨其在 ＩＴＰ 诊断中的临床意义。
天数 MFI
第1天 24.42
第3天 20.56
表 １ 包被微球稳定性测试结果（ＭＦＩ 值）
第7天 28.45
第 14 天 21.17
第 21 天 21.32
第 28 天 25.62
第 35 天 22.74
第 42 天 19.88
CV（%） 12.7
表 2 ３ 组间 MFI 比率及其中位数、上下限比较 ｘ ± ｓ
２ 结果
２．１ 检测包被微球效果 微球包被好后用 ＦＩＴＣ 标记羊抗鼠的 ＩｇＧ 检测其荧光强度，用 ＦＩＴＣ 标记的 羊抗人 ＩｇＧ 作为阴性对照，检测包被微球 ＭＦＩ，一 共检测 ６ 次。 ＭＦＩ 比率（测定 ／ 对照）为 ４．４３ ± １．５５ （２．１５ ~ ６．５３）。 ２．２ 微球的稳定性测试 表 １。 ２．３ ３ 组 样 本 的 ＭＦＩ 比 率 分 布 情 况 及 统 计 结 果 表 ２、３。
ＩｇＧ 多克隆抗体，避光、摇匀 ｌ ｈ 后离心，弃掉上清， 用 ＰＢＳ鄄ＴＷＥＥＮ 液洗涤两次，加入 ０．０１ mol ／ L ＰＢＳ 调整体积到 ２００ 滋L， 上 Ｐａｒｔｅｃ鄄ＰＡＳ 流式细胞仪进 行检测。 利用流式 ＦＳＣ ／ ＳＳＣ 圈出待检测微球门，检 测 １ ０００ ～ １ ５００ 个微球，记录荧光通道（ＦＬ鄄２）中 所检测微球的平均荧光强度（ＭＦＩ）值，存盘后采用 Ｐａｒｔｅｃ Ｆｌｏｍａｘ 软件分析数据，记录分析后结果。 另 外测试三个正常对照的血样，将其设为对照，计算 对照 ＭＦＩ 算术平均值，然后将标本检测得到的ＭＦＩ 与均值比较并计算比率。 １．４ 统计学分析 数据均采用 ＳＰＳＳ 统计学软件 （１７．０ 版本）处理。计数资料采用 ｘ ± ｓ 表示。组间比 较采用多个样本比较的非参数检验（Ｋｒｕｓｋａｌ鄄Ｗａｌｉｓ 法），多个样本两两比较采用 Ｎｅｍｅｎｙｉ 法。 Ｐ ＜ 0．０５ 为差异有统计学意义。
组别
例数 MFI比率 MFI 比率中位数及上下限
ITP 组
32 2.61 ± 1.09
2.71（0.65 ～ 5.08）
非免疫血小板减少组 26 1.32 ± 0.59
1.29（0.49 ～ 2.45）
正常对照组
20 0.95 ± 0.40
0.88（0.44 ～ 1.93）
表 3 ３ 组间 MFI 比率两两比较的秩和检验（Nemenyi 法） 结果
目前血小板特异性自身抗体的检测方法主要
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有单克隆抗体俘获血小板抗原技术 （ＭＡＩＰＡ） ， ［１2］ 放射免疫微球技术［10］等，这些方法特异性较高，约 为 ７８％ ~ ９３％，但敏感性偏低，为 ４９％ ~ ６６％ 。 ［１3］ 因这些方法实验室要求高，且操作繁琐，耗时长， 难以在临床广泛开展［１2］。
ｄｏｉ：１０．３９６９ ／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００６鄄５７２５．２０１５．２０．０２５ 作者单位：８３２０００ 石河子大学医学院第一附属医院
１ 材料与方法
１．１ 病例收集 血小板减少患者，为 ２０１３ 年 ９ 月 到 ２０１４ 年 １ 月在石河子大学医学院第一附属医 院血液科住院患者，共 ５８ 例。其中 ＩＴＰ 患者 ３２ 例， 男 １０ 例，女 ２２ 例，中位年龄 ５７（１８ ～ ８４）岁，诊断 全部参考文献［7］标准。 非免疫性血小板减少患者 ２６ 例，男性 １３ 例，女性 １３ 例，中位年龄 ５８（３９ ～ ９６）岁，其中急性白血病 ４ 例，巨幼细胞性贫血 ３ 例，ＡＡ７ 例，ＭＤＳ ９ 例，骨髓纤维化 ２ 例，淋巴瘤 １ 例，均经骨髓穿刺或病理诊断。 正常对照 ２０ 例，男 ６ 例，女 １４ 例，中位年龄 ５１（２３ ～ ７５）岁，为我院体 检中心健康体检者，均无输血史等特殊病史。 １．２ 主要仪器与试剂 流式细胞仪（德国 Ｐａｒｔｅｃ鄄 ＰＡＳ 流式细胞仪），聚苯乙烯微球，直径 ９．６ 滋ｍ，购 自天津市倍思乐公司；抗人血小板 ＧＰＩＩｂ ／ ＩＩＩａ 单克 隆 抗 体 （ＣＤ４１ａ，Ｐ２ 克 隆 ， 冻 干 型 ，０．２ 毫 克 ） 购 自 Ｂｅｃｋｍａｎ鄄ｃｏｕｌｔｅｒ 公司。 ＰＥ 标记的羊抗人 ＩｇＧ 多克 隆抗体购自北京博奥森公司，ＦＩＴＣ 标记的羊抗鼠 ＩｇＧ 多克隆抗体，ＦＩＴＣ 标记的羊抗人 ＩｇＧ 多克隆抗 体购自北京中 杉 公 司 ， 抗 人 ＣＤ４ ＦＩＴＣ ／ ＣＤ８ＰＥ ／ ＣＤ３ＰＥ鄄ＣＹ５ 单克隆抗体购于天津协和干细胞基因 工程有限公司。 １．３ 研究方法 参考 Ｔｏｍｅｒ 等的方法［8-9］，稍作修改。 １．３．１ 微球包被 抗体的 Ｆｃ 段具有疏水作用，采 用物理吸附作用使之与聚苯乙烯微球结合，而抗体 的 Ｆａｂ 段仍保持活性。 包被前重悬微球，ＣＤ４１ａ 单 抗与 ０．１ mol ／ L ＰＢＳ 缓冲液混合，然后加入 ５０ 滋L 重悬了的微球，使所添加的微球与抗体比例为 １ ｍL
敏感性
ROC Curve 1.0
0.8
0.6
0.4 AUC = 0.848
0.2
0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1-特异度
图 １ ＩＴＰ 患者与非免疫性血小板减少患者平均荧光强度 比率的 ＲＯＣ 曲线，曲线下面积为 ０．８４８，９５％的置信区间为
（０．７５，０．９５）
３ 讨论
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实用医学杂志 ２０１５ 年第 ３１ 卷第 ２０ 期
原发免疫性血小板减少症 ＧＰＩＩｂ ／ ＩＩＩａ 抗体检测的 临床意义
潘歆 陈志刚 张恒 吴广胜
摘要 目的：检测原发免疫性血小板减少症（ＩＴＰ）患者 ＧＰＩＩｂ ／ ＩＩＩａ 抗体水平并探讨其临床意义。 方法： 应用流式微球技术（ＣＢＡ）检测血小板 ＧＰⅡｂ ／ Ⅲａ 自身抗体，记录各个样本的平均荧光强度（ＭＦＩ），计算样 本的 ＭＦＩ 与正常对照 ＭＦＩ 均值的比率。结果：ＩＴＰ 组、非免疫性血小板减少组和正常对照组的 ＭＦＩ 比率分别 为（２．６１ ± １．０９）、（１．３２ ± ０．５９）和（０．９５ ± ０．４０），非参数检验得 ＩＴＰ 组 ＭＦＩ 比率高于非免疫性血小板减少 组和正常对照组（Ｐ < ０．０１），而后两者 ＭＦＩ 比率差异无统计学意义（Ｐ ＞ ０．０５）。 经统计学处理，ＣＢＡ 对 ＩＴＰ 诊断的敏感性为 ７１．８８％，特异性为 ８４．６２％，由 ＲＯＣ 曲线得 ＣＢＡ 区分 ＩＴＰ 患者与非免疫性血小板减少患者 的能力为 ０．８４８。 结论：ＣＢＡ 检测血小板 ＧＰＩＩｂ ／ ＩＩＩａ 抗体敏感性、特异性均较高，且操作简便，重复性好，对 ＩＴＰ 的辅助诊断具有一定的实用价值。