重组酶聚合酶扩增技术的研究进展
重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)方法的建立
重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)方法的建立梁君妮; 尹伟力; 谢爽; 刘宁; 段效辉; 林森【期刊名称】《《中国预防兽医学报》》【年(卷),期】2019(041)010【总页数】4页(P1037-1040)【关键词】重组酶聚合酶扩增技术; 快速检测; 鲤春病毒血症病毒【作者】梁君妮; 尹伟力; 谢爽; 刘宁; 段效辉; 林森【作者单位】烟台海关技术中心山东烟台 264000【正文语种】中文【中图分类】S852.65鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)属水泡病毒属(Vesiculovirus)，是一种弹状病毒[1]，主要流行于欧洲、中东和俄罗斯，近几年蔓延至美洲和亚洲[2-4]。
SVCV 宿主范围非常广泛，四大淡水鱼类均能被感染，其中最易感的为鲤科鱼类，尤其仔鱼，一旦感染死亡率可达70 %[5]。
它可以引起鱼类大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)，是世界动物卫生组织(OIE)必须通报的动物疾病。
SVCV 传统的检测方法是细胞培养分离法，但该方法费时费力。
近年来检测SVCV 的分子生物学方法被广泛研究并应用。
其中重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymerase amplification，RPA)方法可以在25 ℃～42 ℃恒温条件下20 min内快速完成核酸扩增，无需昂贵的变温仪器，反应迅速，灵敏度高，扩增产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测，也可以与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法相结合进行检测[6-8]，适合现场快速检测。
本研究依据SVCV G 基因保守序列设计特异性引物，利用RPA 技术建立一种简便高效、特异性强、灵敏度高的SVCV 检测方法，适用于设备简单的基层实验室及现场检测，是SVCV日常监控及检测的有效手段。
1 材料与方法1.1 主要实验材料 SVCV 由本实验室保存。
传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)和传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)均由深圳出入境检验检疫局提供。
五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立
五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立曹雪锋;康晓平;李裕昌;张森;户义;李靖;吴晓燕;杨银辉【摘要】目的建立五种出血热相关病毒,即扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和黄热病毒的一步法重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术,为病原体的确定提供现场快速检测方法.方法通过基因组序列分析,选择每种病毒的特异核酸片段作为检测靶基因,针对靶基因序列设计RPA检测的引物和探针;取系列稀释的模板基因进行RPA检测,确定其灵敏性;取出血热相关病毒核酸为模板进行RPA检测,确定其特异性;验证不同温度反应条件(37~42℃)对检测结果的影响.结果五种出血热病毒的RPA反应体系均可有效扩增靶基因,灵敏性为1.5×102~1.5×103copies/反应,与其他出血热相关病毒的核酸无交叉反应;RPA实验在37~42℃均可实现靶基因的有效扩增.结论建立了五种出血热病毒的RPA等温扩增体系,该体系反应快速,温度范围宽,适用于现场快速检测.%Objective To establish a one-step recombinase polymerase amplification (RPA) method for pathogen screening and rapid detection in the field targeting for five hemorrhagic fever related viruses (Zaire ebola virus, Sudan ebola virus, Marburg virus, Lassa virus and Yellow fever virus). Methods The specific nucleic acid (NA) fragments of each virus were selected as target genes by genome sequence analysis, and the primers and probes for RPA assays were designed according to the sequence. A series of diluted template genes were used for RPA detection to determine the sensitivity. The hemorrhagic fever-related viral nucleic acids were used for RPA detection to determine the specificity. The amplification experiments were carried out at di fferent temperature ranging from 37℃ to 42℃ to validate thereaction temperature range. Results The RPA reaction systems of the five hemorrhagic fever viruses could effectively amplify the target genes, the sensitivities were between 1.5×102 and 1.5×103 co pies. No cross reactions existed with the other hemorrhagic fever-related viral genes. Meanwhile, RPA assay could effectively amplify the target genes at 37-42℃. Conclusion The isothermal RPA assays of five hemorrhagic fever viruses are established, which may amply target genes fast and react at a wide temperature range, and be potentially useful for in field pathogens detection.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2017(042)006【总页数】6页(P526-531)【关键词】重组酶聚合酶检测;等温扩增;出血热病毒【作者】曹雪锋;康晓平;李裕昌;张森;户义;李靖;吴晓燕;杨银辉【作者单位】230032 合肥安徽医科大学研究生学院;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;230032 合肥安徽医科大学研究生学院;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R373.3埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)、马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)、拉沙病毒(Lassa virus，LASV)和黄热病毒(yellow fever virus，YFV)均为烈性出血热病毒，主要流行于非洲，均可引起严重的出血热症状，感染率和致死率很高。
《利用重组蛋白技术提高TaqDNA聚合酶活性的研究》范文
《利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究》篇一一、引言DNA聚合酶是分子生物学领域中至关重要的酶类，其作用在于催化DNA链的合成。
Taq DNA聚合酶因其高活性、高保真性和在高温下的稳定性，在PCR（聚合酶链式反应）技术中占据重要地位。
然而，为了提高PCR的效率和准确性，进一步增强Taq DNA聚合酶的活性显得尤为重要。
本文旨在探讨利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究。
二、重组蛋白技术概述重组蛋白技术是一种通过基因工程手段，将特定基因在体外进行克隆、表达、纯化和修饰，从而获得所需蛋白质的技术。
此技术可实现对蛋白质的精确操控，包括改变蛋白质的结构、功能和稳定性等。
在生物医学、生物技术和生物工业等领域，重组蛋白技术都有着广泛的应用。
三、Taq DNA聚合酶的活性提升策略为了提高Taq DNA聚合酶的活性，本研究采用重组蛋白技术，通过以下策略进行：1. 基因克隆与表达：首先，对Taq DNA聚合酶的基因进行克隆，并构建高效表达载体。
通过优化表达条件，如温度、pH值和诱导剂浓度等，实现Taq DNA聚合酶的高效表达。
2. 蛋白质纯化与修饰：采用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等纯化方法，对表达的Taq DNA聚合酶进行纯化。
此外，通过定点突变、糖基化等蛋白质修饰手段，提高Taq DNA聚合酶的稳定性和活性。
3. 酶活性评估：采用PCR实验，对纯化后的Taq DNA聚合酶进行活性评估。
通过比较不同条件下酶的活性，筛选出最佳的表达和纯化条件。
四、实验结果与分析1. 基因克隆与表达：成功克隆了Taq DNA聚合酶的基因，并在大肠杆菌中实现了高效表达。
通过优化表达条件，Taq DNA聚合酶的表达量得到了显著提高。
2. 蛋白质纯化与修饰：采用多种纯化方法，成功纯化了Taq DNA聚合酶。
通过定点突变和糖基化等修饰手段，进一步提高了酶的稳定性和活性。
3. 酶活性评估：在PCR实验中，发现经过优化后的Taq DNA聚合酶活性得到了显著提高。
重组酶聚合酶扩增技术发展趋势
重组酶聚合酶扩增技术（PCR）作为一种在分子生物学领域应用广泛的技术，已经在科学研究、医学诊断、法医学和环境监测等领域发挥着不可替代的作用。
随着科学技术的不断进步和发展，PCR技术也在不断地演变和改进。
本文将就重组酶聚合酶扩增技术的发展趋势进行探讨，分析未来可能的发展方向和应用前景。
一、新一代PCR技术的出现随着生物技术领域的快速发展，新一代PCR技术不断涌现。
数字PCR 技术的出现，可以实现对DNA的绝对定量，有望广泛应用于癌症早期诊断和评估、胚胎植入前诊断等领域。
环介导等温扩增技术的兴起，使得PCR技术的使用更加简便和快速，有望在临床快速诊断中得到广泛应用。
二、PCR技术与人工智能的结合随着人工智能技术的快速发展，PCR技术也将不可避免地与人工智能技术结合。
人工智能可以帮助分析PCR实验的大量数据，寻找数据之间的关联，加快实验结果的解读和分析。
人工智能还可以在PCR实验设计阶段提供智能化的建议和优化方案，提高PCR技术的效率和准确性。
三、微流控技术在PCR中的应用微流控技术是近年来分析化学领域的一个热点，该技术可以在微型芯片上实现对样品的稀释、混合、加热等一系列操作，结合PCR技术，可以实现对DNA的快速扩增和检测。
微流控技术的应用有望将PCR技术推向微型化、智能化和自动化的方向，提高PCR技术的高通量分析能力。
四、CRISPR技术与PCR的结合CRISPR技术作为一种精准的基因编辑技术，与PCR技术的结合有望在基因诊断和基因治疗领域发挥重要作用。
利用PCR技术快速扩增基因片段，然后结合CRISPR技术对特定基因进行精准编辑，可以为许多遗传病的治疗提供新的思路和方法。
五、PCR技术在环境监测中的应用PCR技术在环境监测中的应用也是一个备受关注的领域。
利用PCR技术可以快速检测水体中的致病微生物和污染物，为环境保护提供重要的技术支持。
未来，随着PCR技术的不断改进和完善，其在环境监测中的应用前景将更加广阔。
重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测拟态弧菌
检验检疫学刊 JOURNAL OF INSPECTION AND QUARANTINE
重组酶聚合酶扩增技术渊RPA冤检测拟态弧菌
周广彪 1*
1.汕头海关 广东汕头 515031曰2.广州海关
摘要 根据编码拟态弧菌不耐热溶血素渊Vibrio mimicus heat-labile hemolysin袁VmhA冤的基因保守序列袁 设计重组酶聚合酶扩增渊RPA冤特异性引物袁建立拟态弧菌 vmhA 基因的 RPA 检测方法并测试其特异性尧灵 敏度和应用效果遥 结果显示袁建立基于 RPA 的检测方法特异性好袁能够从拟态弧菌中扩增得到 467 bp 的特 异性条带袁仅需在 37益下恒温反应 40 min袁不需要特殊的仪器设备曰对比 RPA 和 PCR 两种检测方法的灵敏 度一致袁均达到 0.1 ng/滋L遥 应用检测结果也表明该方法与传统培养方法相当遥 因此袁本研究建立的 RPA 方法 检测 vmhA 特异性强尧灵敏度高袁无需特殊的仪器设备袁适合实验室快速检测遥
Abstract院 A recombinase polymerase amplification 渊RPA冤 assay was developed for the V ibrio mimicus heat-labile hemolysin 渊VmhA冤 detection. The specific RPA primers were designed and tested袁which only a 467 bp fragment was detected in V ibrio Mimicus袁but not detected in V ibrio V ulnificus or other 10 bacteria in this research. The RPA reaction needs the 37益 held temperature about 40 min without using other special equipments. The sensitivity of RPA reached 0.1 ng/滋L DNA袁which was consist with regular PCR. The method established in this paper was showed the equally specificity and sensitivity than the classic method. Taken all together袁the RPA assay provides a rapid袁sensitive and specific method for the detection of VmhAwhich no special equipments needing way was suitable for the rapid detection in laboratory. Key Words院 V ibrio Mimicus曰RPA曰 Detection
重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌
重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌1. 引言1.1 背景介绍创伤弧菌是一种常见的致病菌，主要存在于海水和淡水中，同时也可在生鲜水产品中被检测到。
感染创伤弧菌会引起人类和动物的创伤性疾病，严重时可能导致败血症和坏死性皮肤病等严重后果。
由于其耐热性和抗生物药性强，创伤弧菌在临床和食品安全领域的监测和控制备受关注。
传统的创伤弧菌检测方法存在着操作复杂、耗时长、灵敏度低等问题，难以满足迅速准确的检测需求。
开发一种快速、灵敏、简便的检测技术对于创伤弧菌的监测具有重要意义。
1.2 研究目的本研究旨在探讨重组酶聚合酶扩增技术（RPA）在创伤弧菌检测中的应用，并分析其在该领域中的优势和局限性。
创伤弧菌是一种常见的致病菌，经常引起食物中毒和水污染等问题，对人类健康构成威胁。
通过研究RPA技术在创伤弧菌检测中的表现，我们希望能够为提高创伤弧菌的快速、准确检测水平提供科学依据。
我们还将探讨RPA技术在创伤弧菌检测中的前景，并提出未来研究方向，为该领域的发展提供参考和指导。
本研究旨在为解决创伤弧菌检测中存在的问题，保障食品安全和公共健康做出贡献。
2. 正文2.1 重组酶聚合酶扩增技术(RPA)原理重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型的核酸扩增技术，其原理基于同源重组DNA修复机制。
该技术利用特殊的重组酶在等温条件下介导两个互补的引物与靶序列结合，形成DNA双链，然后通过DNA聚合酶的作用在靶序列上合成新的DNA链，实现核酸扩增。
RPA在温度较低(37-42摄氏度)下运行，不需要复杂的仪器和设备，使其成为一种便携式的核酸扩增技术。
RPA技术的原理是基于同源重组原理，依赖于专一性的重组酶和DNA结合蛋白，实现引物与靶序列的结合和合成新的DNA链。
这种技术可以在短时间内完成核酸扩增，且具有高敏感性和特异性，能够在复杂的样品中准确检测目标DNA。
RPA技术的原理简单而高效，为快速检测创伤弧菌提供了新的可能。
通过结合RPA技术与其他技术的优势，可以更快速、更可靠地检测创伤弧菌，为预防传染病提供有力支持。
重组酶介导的核酸快速扩增法
重组酶介导的核酸快速扩增法摘要：体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术。
重组酶介导的扩增(recombinase-aid amplification,RAA)技术是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。
RAA 法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶代替了传统PCR 的热循环解链过程, 实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，有望在不远的将来取代传统的热循环PCR 反应。
Abstract:Nucleic acid amplification is a biotechnology that trace nucleic acid can be rapidly amplified in vitro. Recombinase-aid amplification (RAA) is the most recent isothermal amplification technology, in which the classical thermal stable enzyme has been replaced by recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and DNA polymerase. Therefore, the RAA reaction can be carried out at optimized37°C or under the room temperatures without any heating assistance. These merits could largely facilitate RAA more applicable than PCR in the near future.关键词：重组酶体外核酸扩增在过去１０年中，若干恒温核酸扩增技术得到快速发展[1]，如SDA技术、TM A技术、HDA技术、LAMP技术和RPA／RAA技术等。
重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病毒病检测中的应用
重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病毒病检测中的应用秦立得;南文龙;陈义平【摘要】重组酶聚合酶扩增技术是近年来建立起的一种常温DNA扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、反应速度快、所需仪器简单等优点.本文介绍了该技术的检测原理、引物及探针设计和影响因素,分析了该技术在动物病毒病检测方面的应用,指出该技术具有良好的现场快速检测与多重及大量样品检测的应用前景.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2017(034)005【总页数】5页(P81-85)【关键词】重组酶聚合酶扩增技术;动物病毒病;研究进展;展望【作者】秦立得;南文龙;陈义平【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032【正文语种】中文【中图分类】S851.342006年，Olaf Piepenburg等[1]报道发明了重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplifi cation，RPA）。
该技术可在37～42 ℃条件下、10～20 min内等温扩增目的基因片段。
随后，英国TwistDx公司开发出了商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用。
与聚合酶链式反应（PCR）相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单（甚至可制作成侧流层析试纸条）等优点，特别适用于快速检测。
目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用。
在目的DNA片段扩增的过程中，引物与uvsX重组酶形成的复合物与DNA结合并沿DNA链寻找引物的同源序列，完成定位后发生链交换反应并打开2条DNA单链间的氢键，单链绑定蛋白（SSB）与单链DNA链结合，阻止形成双链，之后Bsu聚合酶从发生链交换反应的位置开始复制DNA；同时反应体系中含有uvsY 酶，能与uvsX结合并促进uvsX与单链DNA更加紧密的结合，以发生链交换反应，如此循环，从而完成了对目的DNA片段的扩增（图1）。
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１ 前 言
利用 重组 酶和 单链 结合 蛋 白在 常 温下协 同实现 引物 和模 板 的特异 结合 。 反应 体 系主要 有 Ｔ ４噬菌 体编码 的重 组 酶蛋 白 ｕ ｖ ｓ Ｘ和 ｕ ｖ ｓ Ｙ Ｅ ￣ 、 单链 结 合蛋 白ｇ ｐ ３ ２及 Ｂ ｓ ｕ Ｄ Ｎ Ａ聚合 酶 、 引物 、 模板 、 缓 冲液等 ［ ２ １ 。 在恒 温下 ． 重 组 酶蛋 白在 Ａ Ｔ Ｐ的参 与下 与单 链 核酸 （ 引物 ） 结 合形成 蛋 白一 核苷 酸复合 物 ， 该复合 物 可 以在 双链 Ｄ Ｎ Ａ（ 模板 ） 上 进行 双 向扫 描 ， 寻 找 与引 物同源的靶序列 。 一旦找到 ， 重组酶可打开双链Ｄ Ｎ Ａ， 同 时引 物与 同源 序列 发生链 交换 反应 ， 在Ｄ Ｎ Ａ聚合 酶 的作 用下启 动 Ｄ Ｎ Ａ合成 反应 。 单 链结 合蛋 白与 被引 物替 换掉 的母链 结合 ， 防止被 进一 步替换 。 在这个 体 系 中 ．由一对 相对 的引 物 同时启 动和完 成一 个合 成
ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ２ ５℃ 一 ４ ３℃ ｉ ｎ ５ ｔ ｏ ２ ０ ｍｉ ｎ ｕ ｔ ｅ ｓ ．Ｄｕ ｅ ｔ ｏ ｉ ｔ ｓ ｃ ｏ ｎ ｖ ｅ ｎ ｉ ｅ ｎ ｔ ｏ ｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｌ Ｏ Ｗ
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２ ０ １ ６年第 ５期 Ｖ ｏ １ ． ２ ６ Ｎ ｏ ． ５
检 验检 疫学 刊 Ｊ Ｏ Ｕ Ｒ Ｎ Ａ Ｌ Ｏ Ｆ Ｉ Ｎ Ｓ Ｐ Ｅ Ｃ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ Ａ Ｎ Ｄ Ｑ Ｕ Ａ Ｒ Ａ Ｎ Ｔ Ｉ Ｎ Ｅ
重组酶聚合酶扩增技术 的研究进 展
刘冬 虹 ห้องสมุดไป่ตู้德 莲 ’ 郭 燕华 聂 炎炎 吴 环 曾国权
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（ 广州质量监督检测研究 院 广东广州 ５ １ １ ４ ４ ７ ）
摘 要 重组酶 聚合 酶扩 增技 术是 一种 可使 微 量核酸 在体 外 高效 快速扩 增 的新技 术 。 与传 统 Ｐ Ｃ Ｒ及 等 温 扩增 技术 相 比较 ， 其最 显著 的优势 是在 ２ ５℃． ４ ３℃条 件 下 ， ５ — ２ ０ ｍｉ ｎ内观察 到检 测 结果 ， 且 操作 简单 ， 设 备 成 本低廉， 被 认 为是 一种 可 以代 替 Ｐ Ｃ Ｒ 的新技 术 。 本文 综述 了重 组酶 聚合 酶扩增 技术 的原 理和 特 点 、 检测 方 法 及 近 十年 来在 国内外不 同领 域 的应用 情况 ， 并 展望 了该 技术在 检 测领域 中的未来 方 向。 关 键词 重组 酶聚合 酶 扩增技 术 ； 检测 方 法 ； 应用 领域
Ｈｕ ａ ｎ， Ｚ Ｅ ＮＧ Ｇｕ ｏ ｑ ｕ ａ ｎ
（ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｑ ｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ Ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ ｖ ｉ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ，Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ，Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ，５ ｌ １ ４ ４ ７ ）
中图分 类号 Ｑ ７ ８ ９
Ａｄ ａｖ ａ ｎｃ ｅ ｓ ｉ ｎ Ｒｅ ｃ ｏｍｂｉ ｎａ ｓ ｅ Ｐｏｌ ｙｍｅ ｒ ａ ｓ ｅ Ａｍ ｐｌ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏｎ
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Ｋｅ ｙ Ｗ ｏｒ ｄ ｓ：Ｒｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ Ｐｏ ｌ ｙ ｍｅ ｒ ａ ｓ ｅ Ａｍ ｐ ｌ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｔｅ ｃ ｈ ｅ ｎ ｉ ｑ ｕｅ； Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ； Ａｐｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ａｒ ｅ ａ