DNA重组技术全过程
重组DNA技术详细概述(ppt 41页)(共40张PPT)
胰岛素在大肠杆菌体内的表达
凝血因子VIII高表达载体的构建和及其原理
培育转基因动物的基本步骤
准备供体动物，分离受精卵； 准备注射用转基因DNA溶液；
将转基因DNA显微注射到一个受精卵的雌性原核之 中，进入的DNA通过非同源重组插入到基因组之中 ； 将受精卵移植到代孕母鼠的子宫之中； 对出生的小鼠进行筛选，挑出转基因小鼠。
蛋白质工程一般有三个目的：（1）改变催化性质。这包括提高Vmax、降低 Km值、改变最适pH、去除抑制剂作用位点、改变反应的特异性或去除导致 蛋白质不稳定的氨基酸残基等；（2）改变结构性质。这包括改善热稳定性 、提高在有机溶剂中的稳定性、改变理化性质或改变对配体结合的特异性； （3）创造新系统。这包括合成融合蛋白或多功能蛋白、添加有利于纯化的 标记或增强药用蛋白质的药效。
基因敲除
基因敲除是上个世纪80年代后半期随DNA同源 重组原理发展起来的一门新技术，它是指在分子 水平上，使用特定的手段，将一个结构已知但功 能不详的基因去除，或用其它顺序相近的基因取 代，使原基因功能丧失，然后从整体观察实验动 物的表型变化，进而推断相应基因的功能。这与 早期生理学研究中常用的切除部分-观察整
要使克隆基因在宿主细胞中表达，首先需要将目的基因亚克隆到带有基 因表达所必需的各种元件的载体之中，这些载体通称为表达载体。目的 基因可以放在不同的宿主细胞中表达。针对不同的表达系统，需要构建 不同的表达载体。 表达载体可分为融合载体和非融合载体两类，前者在插入位点上“预 装”了另外一个蛋白质或多肽的基因，因此，插入的外源基因将会与 它发生融合，表达出来的是一种融合蛋白。使用融合载体的主要好 处是方便了目的蛋白的纯化。 理想的表达系统应该满足以下条件：（1）表达载体具有合适的MCS，以便 使外源基因能够插入到正确的表达位置，或者至少是含有3个以上阅读框架 的系列；（2）能够形成正确的翻译后修饰和三维结构，以形成有活性的或 有功能的分子；（3）为可诱导的表达系统，允许细胞生长和诱导表达，防 止毒性蛋白质的积累；（4）易于分离和纯化；（5）最好能分泌到胞外。
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状重组dna技术的名词解释基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
重组dna技术的操作步骤工具(1)酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、(2)载体：质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体1.提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增，如使用PCR技术)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。
如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
人工合成基因的方法主要有两条。
一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。
另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
DNA重组及重组DNA技术
特点
分子水平操作和细胞水平表达 定向地改造生物的遗传性状， 获得人类所需要的品种
克隆(clone) 是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
重组DNA技术的目的 ① 克隆特定基因 ②序
重组DNA技术操作流程图
ACC ACC ACC ACC
AAG AAA AAG AAA
TAC TAC TAC TAC
TTT TTT T TC T TC
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
说明：由于密码存在简并性，合成出来的DNA可能与基因组DNA有所差异，此 问题可通过基因测序解决。如果是为了获得表达产物蛋白质，这种差异也 无所谓。
载体 目的基因
双酶切产生粘性末端
带有与载体 相同粘性末端
重组DNA分子
转化或转染
含重组载 体的细菌
对细菌进 行培养
操作过程可形象归纳为
分 ─ 目的DNA的分离获取 选 ─ 载体的选择与构建 接 ─ 目的DNA与载体的连接 转 ─ 重组DNA转入受体细胞 筛 ─ 重组体的筛选与鉴定
对克隆菌进行筛选、 鉴定和扩增
第二十一章 DNA重组及重组DNA技术
重组DNA技术(recombinant DNA technology)：
又称分子克隆或DNA克隆或基因工程技术，其主要过程包括：在体外 将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又称载体）连接，形成重组 DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大 量拷贝。在克隆目的基因后，还可针对该基因进行表达产物蛋白质或多肽 的制备以及基因结构的定向改造。
说明：这种cDNA中不包含内含子， 便于在宿主细胞中表达,适用 于真核生物基因。
S1核酸酶
AAAAAAAA(n) 3 TT T T T TT T (n) 5
重组DNA完整版PPT
➢ 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识 地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物 体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产 物。
生物技术
4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 （3〕TaqDNA聚合酶； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
5 转化子的分析——Southern杂交 以mRNA为模板，以短的寡核苷酸〔oligo(dT)）分子作引物，加入dATP, dTTP, dGTP和dCTP, oligo(dT)与mRNA分子的多聚A〔polyA〕 尾巴碱基配对，在逆转录酶的作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。 （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 4 转化受体细胞和转化子的筛选 4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 反转录人工合成互补DNA （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（的基因； PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增〔包括分离〕一段目的基因的技术。 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（3〕TaqDNA聚合酶； 美国Mullis教授 开汽车时的联想 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。
DNA片段； ➢ （3〕利用聚合酶链式反应〔PCR〕特异性
地扩增所需要的目的基因片段，等等序
反转录人工合成互补DNA➢ 构建基因获取目的基因存在的 问题——➢
重组PCR的原理
重组PCR的原理重组PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于在DNA分子水平上编辑、修复和重组DNA序列的分子生物学技术。
它是基于传统PCR技术的改进和扩展，可以在体外实现DNA序列的重组，是研究基因功能与结构、合成新的DNA 序列和构建重组DNA分子的重要手段。
本文将从原理、步骤和应用三个方面详细介绍重组PCR的工作原理。
重组PCR的原理：重组PCR是通过引物扩增和DNA重组技术进行的，其中引物扩增是用于扩增片段DNA的目的而设计的，而DNA重组技术则用于实现DNA序列的修饰和重组。
具体原理如下：1. 引物扩增：在重组PCR中，引物的设计很重要。
引物是引导DNA聚合酶合成新DNA链的短序列。
引物的设计要求与待扩增的目标DNA序列的两端相互互补。
通过在PCR反应中添加两个互补的引物，可以在两个位点上产生互补的DNA序列。
这些引物将引导DNA聚合酶在这两个位点之间合成新的DNA链。
2. DNA重组：DNA重组是利用DNA聚合酶的活性并借助引物扩增合成新的DNA序列的过程。
在重组PCR反应中，引物的设计使其能够与待重组的DNA 序列的两个位点相互互补。
这使得DNA聚合酶能够在待重组的DNA序列之间合成新的DNA链。
重组PCR的步骤：重组PCR通常包括以下几个步骤：1. DNA模板制备：将待重组的DNA序列提取和纯化，得到用于PCR反应的DNA模板。
这可以通过常见的DNA提取和纯化方法（如酚/氯仿提取、离心纯化等）实现。
2. 引物的设计：根据待重组的DNA序列设计引物。
引物应该在目标序列的两个位点上互补，并且在温度上退火时，具有适当的Tm（退火温度）值。
引物的设计是重组PCR成功的关键因素之一。
3. PCR反应的设置：根据预定的PCR方案设置PCR反应体系。
PCR反应需要适当的DNA模板和引物浓度，合适的缓冲液，核苷酸和DNA聚合酶。
PCR反应通常包括预热步骤、扩增循环步骤和最终延伸步骤。
第十三单元 重组DNA技术
【执业】1．限制性内切酶是一种
A.核酸特异的内切酶
B. DNA特异的内切酶
C.DNA序列特异的内切酶
D.RNA特异的内切酶
E.RNA序列特异的内切酶
答案：C
【执业】2．限制性内切酶的作用是
A.特异切开单链DNA
B.特异切开双链DNA
C.连接断开的单链DNA
D.切开变性的DNA
E.切开错配的DNA
答案：B
二、发展新药物
利用基因工程技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项重大产业。目前已经或正投入市场的基因工程产品有胰岛素、生长素、促红细胞生成素、因子VIII、白介素-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肥大细胞生长因子及白血病抑制因子等。
三、DNA诊断
DNA诊断又称基因诊断，目前已发展成为一门独具特色的诊断学科——DNA诊断学。DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平上分析、鉴定遗传性疾病所涉及的基因的置换、缺失或插入等突变。目前用于DNA诊断的方法很多，但其基本过程相似：首先分离、扩增待测的DNA片段，然后利用适当的分析手段，区分或鉴定DNA的异常。目前广泛用于待测基因的分离及扩增技术是PCR技术，其次是连接酶链反应。常用的DNA分析手段有限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、核酸分子杂交、变性梯度胶电泳、核酸酶A技术以及DNA序列分析等。
五、遗传病的防治
受累疾病基因克隆不仅为医学家提供了重要工具，使他们能深入地认识、理解一种遗传病的发生机制，为寻求可能的治疗途径、预测疗效提供了有力手段；更重要的是可以利用这成果进行极有意义的产前诊断，而后通过治疗技巧与治疗、预防能力的结合，从根本上杜绝遗传性疾病的发生和流行。
重组DNA技术
（二）表达载体
表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因
的载体。
根据宿主细胞分为：
原核表达载体 真核表达载体
目录
1. 原核表达载体
原核表达载体的基本组成
R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列
目录
2. 真核表达载体
真核表达载体的基本组成
OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点； TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。
设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
目录
（一）克隆载体
1. 克隆载体应具备的基本特点
至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制； 至少有一个选择标志（selection marker）：选择标志是 区分含与不含载体的细胞所必需的，如抗生素抗性基因。 有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
目录
2.
从基因组DNA文 库获取目的基因
组织或细胞染色体DNA
限带的所 有基因组DNA的集合
克隆载体 重组DNA分子 受体菌录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个 RE的单一切点，
可 供 外 源 基 因 插 入 时 选 择 ， 叫 多 克 隆 位 点 （ multiple cloning sites，MCS）。
第二十三章 DNA重组和重组DNA技术【生物化学与分子生物学 9版原版】
第二节
重组DNA技术
序言：
重组DNA技术
又称： 分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因工程（genetic engineering）
主要过程：
——在体外将目的DNA与能自主复制的遗传元件（载体）连接， 形成重组DNA分子 ——重组DNA分子在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得 单一DNA分子的大量拷贝
• 大多数RE的识别序列为回文结构（palindrome） • 有些RE所识别的序列虽然不完全相同，但切割DNA双链后可产
生相同的黏端，这样的酶彼此互称同尾酶（isocaudamer） • 有些RE虽然来源不同，但能识别同一序列（切割位点可相同或
不同），这样的两种酶成同裂酶（isoschizomer）
克隆载体
——是指用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子。
克隆载体的基本特点：
至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到 同步扩增； 至少有一个选择标志（selection marker），从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如 抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等； 有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体。
第一节小结
小结：
自然界DNA重组方式 主要包括： 同源重组，Holliday模式是最经典的同源重组模式 位点特异性重组 转座重组或转座，包括插入序列和转座子的重组 接合，通过细胞接触所发生的基因转移 转化，通过细胞自主摄取发生的DNA整合 转导，病毒感染介导的DNA整合 CRISPR/Cas9系统，细菌获得病毒DNA用于攻击病毒
一、同源重组
同源重组的Holliday模型