实验9.3 Red ET同源重组2015.3.25
RedET同源重组技术概述
RedET同源重组技术概述RedET同源重组技术是一种利用酵母宿主的遗传重组系统，将目标基因在酵母中进行同源重组而得到转基因株系的技术。
该技术在生物医学和生物工程领域具有广泛的应用前景。
本文将对RedET同源重组技术进行概述并介绍其原理、应用以及存在的问题。
RedET同源重组技术的原理基于酵母自然发生的同源重组机制。
酵母是一种单细胞真核生物，其核糖体RNA和转录因子与哺乳动物的细胞中类似，使得酵母成为一种理想的宿主，用于表达复杂蛋白质的研究和生产。
在RedET同源重组技术中，采用了遗传重组系统来介导目标基因与酵母染色体发生同源重组，从而实现目标基因的插入和表达。
RedET同源重组技术的核心是一种诱导目标基因与酵母染色体同源重组的DNA修复机制。
该修复机制主要基于酵母中两个DNA重组酶RecE和RecT的相互作用。
RecE酶在酵母中识别并切割目标基因与酵母染色体之间的同源序列，形成单链切口。
然后RecT酶结合在切口上，介导目标基因与酵母染色体的DNA重组。
最后，通过酵母DNA修复机制，目标基因与酵母染色体实现了同源重组，并插入到酵母基因组中。
RedET同源重组技术具有广泛的应用领域，尤其在基因工程和蛋白表达中具有重要作用。
首先，该技术可以用于基因敲除和基因座替换，为基因功能研究提供了有效的手段。
其次，RedET同源重组技术也可以用于构建表达突变蛋白或蛋白片段的酵母株系，用于蛋白结构和功能研究。
此外，通过RedET同源重组技术，还可以构建酵母株系用于产生异源重组蛋白，并通过大规模筛选酵母株系实现高效蛋白生产。
然而，RedET同源重组技术在应用过程中也存在一些问题和局限性。
首先，该技术的目标基因与酵母染色体之间需要具有足够的同源性，这对于异源基因的插入造成了一定的限制。
其次，RedET同源重组技术在染色体插入位置的选择性方面存在一定的限制，这可能影响目标基因的表达水平和稳定性。
此外，酵母株系在目标基因插入后可能会发生染色体结构的重组和重排，这可能会对酵母的生长和基因表达产生影响。
Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文
Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。
为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。
然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免外界环境引起的不必要的突变。
1 传统同源重组自然发生的同源重组是两个DNA分子之间进行片段交换，从而使序列重排。
1956年，在大肠杆菌中，A John Clark发现了两种与同源重组有关的酶，RacA和RecBCD.在同源重组发生的时候，RecA 结合DNA单链或双链，对双链DNA进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身与被入侵DNA链配对。
当配对成功后，RecA蛋白脱落。
或者在RecBCD的引导下，使目标DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的帮助下进行重组。
当两条链发生重组时，会产生holliday中间体，该中间体在重组完成时由RuvAB和RecG蛋白进行拆分。
至此，形成两条含有异源序列的双链DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于75bp时会使重组率显着降低。
但是实际上，在RecA重组系统中，要求同源臂的长度在1kb左右，且反应条件要求比较苛刻。
2 Red/ET 同源重组技术Red/ET同源重组系统，其实是Red同源重组系统和ET同源重组系统的总称，其中ET系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中导的Rac噬菌体中发现，随后又在噬菌体中发现了Red系统。
RedET同源重组技术概述.pptx
引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
实验93RedET同源重组XXXX325.pptx
五、 Red/ET重组操作流程
引物设 计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的 制备
重组子 筛选
重组产物转化 至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下 游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序 列包括5’端突出序列的同源序列。 （2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活DNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
同源重组
同源重组同源重组（Homologous Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。
目录1简介2基因敲除1. 2.1 定义2. 2.2 技术路线3转移法4DNA1简介同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
同源重组同源重组反应通常根据交叉分子或holliday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。
同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性，100%重组的DNA分子之间的重组常见于非姐妹染色体之间的同源重组，称为Homologous Recombination，而小于100%同源性的DNA分子之间或分子之内的重组，则被称为Hemologus Recombination。
后者可被负责碱基错配对的蛋白如原核细胞内的MutS 或真核生物细胞内的MSH2-3等蛋白质“编辑”。
同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（Gene Conversion)。
RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法
RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化，当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性 克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。
red同源重组步骤
Red同源重装步骤1.制备BL21及HMS的red同源重组大肠杆菌。
(1)目前有pKD46质粒，BL21化学感受态，HMS174电击感受态。
(2)实验准备①LB液体培养基（无抗/氨苄抗性），LB固体培养基（4个），氨苄抗生素，甘油(3)实验操作①化学转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置5min。
2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置30min；3)42℃热激90s，重新插回冰中放置5min；4)在超净台内每支EP管中各加1mL的LB液体培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；5)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。
弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。
6)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。
②电击转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置2min。
2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置2-3min；3)电击2500v后，立即加入提前预热好的培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；4)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。
弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。
5)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。
2.red同源重组电击感受态制备(1)实验准备①泡酸：两个250mL锥形瓶，一个培养皿。
②灭菌：1)活化培养基25ml（1mL*3*2）2)50*2感受态培养基3)一个过滤L-阿拉伯糖的滤器4)100ml左右去离子水5)150ml左右15% 甘油（22.5mL甘油）6) 1.5ml ep管枪尖（黄枪尖要剪）50ml离心管*4③试剂：1)Amp 抗生素（）2)10M的L-阿拉伯糖（1.80g加入1.2ml水中，过滤。
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广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
EcoRV
EcoRV
PKS from other bacteria： Photorhabdus lumineciens Psedumonas flurescencse
p15A-cm Cluster A
(38015 bp)
异源表达
七、 Red/ET重组新技术的发展 1. 三重同源重组（Triple recombineering）
力，增加电转化效率。
五、 Red/ET重组操作流程
引物设 计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的 制备
重组子 筛选
重组产物转化 至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下 游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序 列包括5’端突出序列的同源序列。 （2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
6. 重组子筛选
复苏培养物8000rpm离心1分钟收集菌体，根据需要将一定 量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上,37℃倒置培养12-16h 后观察菌落生长情况。 使用抗生素的最低抑菌浓度，有利于获得更多的重组子：
在10μg/mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60μg/mL的卡那霉素平板上 重组子的数目的6倍。
引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
2. 线性供体dsDNA底物的制备
选用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，减少
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆 （Subcloning）
4. 直接克隆 （Direct cloning）
（A）亚克隆和直接克隆示意图
（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
PCR反应中的突变；扩增GC含量较高的DNA片段时，选用Triplemaster、
HotStarTaq 等），用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物；
纯化PCR产物：
（1）减少模板背景对筛选工作带来的难度； （2）降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率； （3）去处PCR产物中的盐离子，提高转化效率。
抗生素使用浓度与Red/ET重组效率的关系
常用抗生素的工作浓度
7. 重组子的检测
检测方法：酶切分析、PCR检测、平板双划线、测序等；
一般采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定。为避免假阳性结果，鉴定引物选 择一条为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。
高拷贝质粒修饰存在“质粒多聚体” 现象；
5.重组产物转化至感受态细胞
注意：所使用的感受态细胞效率≥1×108cfu/μg. 冰上融化一管100 μl的DH5α感受态细胞。
加入5-10μl反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育 30分钟。
42℃水浴中热激45-90秒后，冰浴3分钟。
加入890μl SOC液体培养基，37℃复苏45-60分钟。
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
redγ： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片
段的消化。
Digestion Binding
3’ 5’
Reda(RecE)
Redb(RecT) Single-strand
annealing
3’ 5’
Strand invasion
Repair/Replication
Selection
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删 除、突变等；
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp左右，建 议用高保真的聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议 用Dpn I内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率。
不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需>50ng/ul，高浓度的载体有 利于提高效率。
4. 同源重组反应
切酶消化难以得到相应的产物。
➢ 方法看似简单，但实验周期长。
➢ 大片段难以与载体正确连接。
➢ 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段。
限制性内切酶
连接酶
酶切载体
步骤3: 目的片段与载体连接
步骤4: 重组子转化到感 受态细胞 传统克隆步骤
同源重组克隆与传统克隆比较
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
1ul
Recombination Enzyme 1ul
线性化载体（>50ng/ul） 50-100ng
插入片段（>50ng/ul） 150-200ng