肺炎克雷伯菌 ESBL
产ESBLs肺炎克雷伯菌aac_6_b_cr基因及耐药性检测
文章编号：１００７－４２８７（２０１３）０１－０１３３－０２产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌ａａｃ（６′）－Ⅰｂ－ｃｒ基因及耐药性检测丁秋蕾１，杨小娜１，梅志琴３，赵建宏２，时东彦２（１．石家庄市中心医院医务部，河北石家庄０５００１１；２．河北医科大学第二医院检验科，河北石家庄０５００００；３．石家庄市传染病医院检验科河北石家庄０５００１２） ２００６年初，美国学者Ｒｏｂｉｃｓｅｋ等［１］发现了不仅对氨基糖苷类药物有修饰作用，而且对喹诺酮类药物也有修饰作用的新氨基糖苷类修饰酶ａａｃ（６′）－Ⅰｂ－Ｃｒ基因。
为了了解肺炎克雷伯菌中ａａｃ（６′）－Ⅰｂ－Ｃｒ型基因存在情况，我们从１０８株肺炎克雷伯菌（Ｋ．ｐｅｎｕｍｏｉｎｉａｅ）中，筛选出了４３株产ＥＳ－ＢＬｓ菌株，对其进行了ａａｃ（６′）－Ⅰｂ－Ｃｒ基因的检测和药物敏感性测定，现报告如下。
１．材料与方法１．１ 菌株来源 １０８株产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌来自河北医科大学第二医院保存的菌株，菌株采用法国梅里埃的ＡＰＩ２０Ｅ鉴定条进行鉴定。
１．２ 药敏纸片 所用药敏纸片亚胺培南（ＩＭＰ）和美罗培南（ＭＥＲ）为英国Ｏｘｏｉｄ公司产品；氨苄西林（ＡＭ）、阿莫西林／克拉维酸（ＡＭＣ）、哌拉西林／他唑巴坦（ＴＺＰ）、头孢唑啉（ＣＺ）、头孢呋辛（ＣＸＭ）、头孢曲松（ＣＲＯ）、头孢他啶（ＣＡＺ）、头孢他啶－克拉维酸（ＣＤＯ２）、头孢噻肟（ＣＴＸ）、头孢噻肟－克拉维酸（ＣＤＯ３）、头孢吡肟（ＦＥＰ）、头孢哌酮／舒巴坦（ＣＦＳ）、阿米卡星（ＡＭＫ）、庆大霉素（ＧＥＮ）、诺氟沙星（ＮＯＲ）、环丙沙星（ＣＩＰ）、左氧氟沙星（ＬＥＶ）、头孢西丁（ＦＯＸ）、复方新诺明（ＳＸＴ）均为北京天坛公司产品。
１．３ 药敏培养基及试剂 Ｍ－Ｈ琼脂培养基为英国Ｏｘｏｉｄ公司产品，ＰＣＲ相关试剂由大连宝生物工程有限公司提供，ＡＰＩ２０Ｅ鉴定条由法国生物梅里埃公司生产。
１．４ 药敏试验及ＥＳＢＬｓ酶的检测 药敏试验采用Ｋ－Ｂ法，产ＥＳＢＬｓ菌株检测采用头孢他啶和头孢他啶－克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟－克拉维酸纸片做确证试验，按临床实验室结果判断［２］。
肺炎克雷伯菌产ESBLs和AmpC酶的检测及其质粒分析
ｈ ｒ Ｕｎ ｖ ｒ ｉｙ，Ｗ ｕ ａ ３ ０ ２，Ｃ ｎ ａ ｉｅ ｓｔ ｔ ｈ ｎ４０ ７ ｈｉ ａ）
Ｅ ｂｔ ｅ］ Ｏ ｊｃｉ Ｔ ｖｓ ｇｔ ｅｐｅ ａ ｎｅｏ ｘｅｄ ｄｓｅｔｕ ￣ｌ ｔｍａｅ Ｅ Ｂ ｓ ｎ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔ ｅ ｏｉ ｅｔ ａｅｔ ｒｖ ｌ ｃ ｆ ｔｎ ｅ—ｐ ｃｒｍ ａ ａ ｓｓ（ Ｓ Ｌ ）ａ ｄＡｍｐ － ｃ ｖ ｎ ｉ ｈ ｅ ｅ ｃ ＣＢｌ — ａ
Ｄｅ ｅ ｔｏ ｆ ｅ ｔ ｎ ｄ ｓ ｃ ｒ ｍ ｌ ｃ ａ ａ ｅ ｎｄ Ａｍ ｐ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏ ｘ ｅ ｄｅ — ｐｅ ｔ ｕ ａ ｔ ｍ ｓ ｓａ Ｃ ｌ ｃ ａ ａ ｅ ｏ ａ ｔ ｍ ｓ ｓ ｐｒ —
ｄ ｃ ｄ ｂ ｌｂ ｉ ｌａ ｐｎｅ ｍ ｏ ａｅ ａ ｄ ｐｌ ｓ ｉ ｎａ ｙ ｉ ｕ ｅ ｙＫ ｅ ｓｅ ｌ ｕ ｎｉ ｎ ａ ｍ ｄ ａ ｌ ｓｓ
维普资讯
国感染控制杂志 ２０ 年 ９ ０７ 月第 ６ 卷箜
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业
・３ ９ ・ ２
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实 验 研 究 ．
肺炎 克 雷伯 菌产 Ｅ Ｂ ｓ和 Ａｍｐ ＳＬ Ｃ酶 的检 测 及 其质 粒 分 析
张 振 鲍连 生 杨 劳荣 郑 义 ， ， ，
况及质粒型耐药基 因。方法
法进行最低抑菌浓度 （ Ｃ） ＭＩ 测定 ； 以美 国临床实验室标准 化委 员会 （ Ｃ Ｓ 推荐 的双纸片协同试验和确证 试验检 ＮＣ Ｌ ） 测 Ｅ Ｂ ｓ酶提取物三维试验检测 Ａｍｐ Ｓ Ｌ； Ｃ酶 ； 质粒接合 和消除试 验检测耐药基因 。结果 菌检出率为 ７ ．） （７ ３ ）产 Ａ Ｃ酶 的肺 炎克雷伯菌检 出率为 １ ． ６ （ ／ ８ ； 中同时产 Ｅ Ｂ ｓ和 Ａ Ｃ １（ ２ ／ ８ ； ｍｐ ５ ３ １ ５ ３ ）其 ＳＬ ｍｐ 酶 的肺炎克雷伯菌检 出率为 ５ ２ （／ ８ 。产酶株对第三代头孢菌素 、 基糖 苷类 、 ．６ ２３ ） 氨 氟喹诺酮类耐药 率均较高 ， 对 亚胺培南 、 厄他培南 等碳青霉烯类 耐药 率最低 。通过质粒接合 和消除试 验 ，Ｏ （ ／ Ｏ 产 Ｅ Ｂ ｓ ４ ４ １） Ｓ Ｌ 的肺炎克 雷伯菌 和 ２】 （／ ） Ａｍｐ （ １５ 产 Ｃ酶的肺炎克雷伯菌检测到传播耐药 的质粒 。结 论 肺炎克 雷伯菌产 Ｅ Ｂ 和 Ａｍｐ ＳＩ Ｓ Ｃ酶是 其对多种抗菌药物耐药的主要原因 ， 耐药 扩散 与细 菌质 粒 的水平 传播有 关 ， 其 对这些 产酶株 的监测 和阻止其传 播 是控制肺炎克雷伯菌感染的重要措施 。 ［ 关 键 词］ 超广谱 内酰胺酶 ； Ａｍｐ Ｃ酶 ； 微生物敏感性 试验 ； 质粒 ［ 文献标识码］ Ａ ［ 文章编号］ １７ —９ ３ （０ ７ ０ —０ ２ —０ ６ １ ６ ８ ２０ ）５ ３ ９ ４ ［ 中图分类号］ Ｒ ７ ． ９ ３ ８９ ６
儿童多重耐药肺炎克雷伯菌败血症危险因素及治疗预后分析
儿童多重耐药肺炎克雷伯菌败血症危险因素及治疗预后分析谢锦金;谢建宁【期刊名称】《中国医药科学》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】Objective To investigate the risk factors, treatment and clinical outcomes for multidrug resistant(MDR) klebsiella pneumoniae bloodstream infections (KP-BSIs)in children. Methods The Clinical data of 37 children with MDR KP-BSIs were retrospectively analyzed. Results Premature birth, twins, low birth weight,history of invasive procedures,neutropenia and perinatal asphyxia were risk factors for MDR KP-BSIs in children.multi-drug resistance was 94.9%;empirical application of carbapenems vinyl drugs cure rate was 62.5%, four cases ofdeath,strains producing ESBLs were detected. Conclusion MDR of KP-BSIs was serious,and the detection rate of ESBLs-producing was high,to long-term trends in the dynamic monitoring, Screening for the presence of multi-drug resistant positive persons,rational use of antibiotics was essential.%目的：探讨儿童多重耐药肺炎克雷伯菌败血症的危险因素、治疗方法以及临床预后。
NICU感染ESBLs大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的耐药性分析
ｗ ｅ ｒ ｅ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍｅ ｄ ｂ ｙ Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ａ ｎ Ａ Ｔ Ｂ Ｅ ｘ ｐ ｒ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｒ ． Ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ａ ｍｏ ｎ ｇ ３ ７ ４ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ｉ ｎ Ｎ Ｉ Ｃ Ｕ， １ ４ ５ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ （ ３ ８ ． ７ ７ ％ ） ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ
大肠埃希茵 ３ ０ ４ ３ 株 与肺 炎克雷伯 茵２ ２ ２ ６ 株 。ＮＩ Ｃ Ｕ 大肠埃希茵 ３ ７ ４ 株 （ １ ２ ． ２ ９ ％） 中产 Ｅ Ｓ Ｂ Ｌ ｓ １ ４ ５ 株 （ ３ ８ ． ７ ７ ％）和肺 炎克雷伯茵 ７ ９ ９ 株
（ ３ ４ ． ４ １ ％）产 Ｅ Ｓ Ｂ Ｌ ｓ ３ ８ ４株 （ ４ ８ ． ０ ６ ％） 。产 Ｅ Ｓ Ｂ Ｌ ｓ 茵对青 霉 素 类、 头孢 菌素和 氨曲 南均产 生耐 药 ， 第四代 头孢 头孢 吡肟 耐 药率 也达 ６ Ｏ ％ 以 上， 对 亚胺培 南或 美洛培 南 、丁胺 卡那 耐 药低 ，其 次 为派拉 西林 ／ 他 唑 巴坦和 头孢 西丁 。而 头孢 西丁 在产 Ｅ Ｓ Ｂ Ｌ ｓ 肺 炎克 雷伯 茵耐 药率 已上
Ｄｒ ｕ ｇ Ｒｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ Ａ ｎ ａ ｌ ａ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ Ｅ ｘ ｔ ｅ ｎ ｄ ｅ ｄ — ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｕ ｍ Ｂ— Ｌ ａ ｃ ｔ ａ ｍａ ｓ ｅ ｓ Ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ａ ｎ ｄ Ｋｌ ｅ ｂ ｓ ｉ ｅ ｌ ｌ ａ Ｐ ｎ ｅ ｕ ｍｏ ｎ ｉ ａ ｅ ｉ ｎ ＮＩ Ｃ Ｕ
儿童肺炎克雷伯菌产ESBLs株的耐药性研究
２ 结 果
２５ 肺炎 克雷伯菌产 Ｅ Ｂ ｓ ． Ｓ Ｌ 株对 常用抗 菌药物 的耐药监测 结果 １２株肺炎克雷伯 菌产 Ｅ Ｂ ｓ 对 ｌ ４ ＳＬ 株 ６种常用 抗菌药 物耐药结果 显示 ， 亚胺培 南 的耐药 率最低 为 ０ ０ ％ ， 次 对 ．０ 其 为美罗 培南 为 ０ ７ ％ ， 哌拉西 林他 唑 巴坦 、 ．０ 对 头孢 哌酮舒 巴 坦 的耐药率 分别 为 ５ ６ ％ 、６ ２ ％ ， ．３ １ ．０ 而对 青 霉素类 、 孢 菌 头
培南的耐药率最低为 ００ ％ ， ．０ 其次为美罗培南 ０ ７ ％ ， 哌拉 西林他唑 巴坦、 ．０ 对 头孢 哌酮 舒 巴坦 的耐药率
分 别 为 ５６ ％ 、６ ２ ％ ， 环丙 沙 星 、 氧 氟 沙 星 、 ． ３ １ ．０ 对 左 阿米 卡 星 的 耐 药 率 分 别 为 ４ ９ ％ 、 ．３ 、４ ０ ％ ， ． ３ ５ ６ ％ １ ．８
２ １ 肺炎克雷伯菌产 Ｅ Ｂ ｓ ． Ｓ Ｌ 株检 出率
１２ ２ ３株肺炎克雷伯
菌中 检 出 肺 炎 克 雷 伯 茵 产 Ｅ Ｂ ｓ株 １２ 株 ， 出 率 ＳＬ ４ 检
素类 、 单环 Ｂ 内酰胺类药物则完 全耐药 ， 一 结果见 表 １ 。
产ESBLs肺炎克雷伯菌多重耐药性与Ⅰ类整合子的相关性研究
２ １ ７月Байду номын сангаас００年
第 ｌ ４卷
第 ７期
・－－—
—
１ ７ －— ０９ － —
文章 编 号 ：０７— ２７ ２１）７ ０７ ３ １０ ４ ８（（０ 【 —１９ —０ 】 ）
产 Ｅ Ｂ ｓ 炎 克 雷伯 菌 多重 耐 药性 ＳＬ肺 与 Ｉ 整 合 子 的相 关 性 研 究 类
郭红 阳 ， 光泽 ， 朱 连树林
ｆｒｎ ａ ｌｓ ａ ｄ ｅｕｃｄ ｔ ｈ ｔｔｓ ｏ ｅ ｅｃ ｓｅｔｓ Ｍ ｅ ｏ ｓ Ｒｏ ｔｎ ｔｏ ｓ ｓ ｄ ｔ ｓｌｔ ． ｎ ｕ ｏ ｉｅ；ｄ ｎ ｉｅ ｙ ｅｅ ｔｓ ｍｐｅ ， ｎ ｌ ｉａｅ ｔｅ ｓａｕ ｆｇ ｎ ａ ｓ ｔ ． ￣ ｄ ｅ ｕｉ ｅｍｅ ｄＷａ ｕ ｏ ｉｏａｅＫ ｐ ｅ ｍ ｎａ ｉｅ ｔｆ ｂ ｈ ｅ ｉ ｄ
ｆ ｅａ ｓ ｎｅ ｒ ｎ ． ｎｃｕ ｉ ｎ ｏ ｌｓ Ｉｉ ｔｇｏ ｓ Ｃｏ ｌｓｏ Ｃｌｓｌｉ ｔｇｏ ｓｗｅｅ Ｐ ｒ ｖ ｌｎ ｎ ＥＳ ａｓ ｎｅ ｒ ｎ ｒ ｅ ａｅ ｔｉ Ｂｋｓ— ｐ ｏ ｕｃｎ ｅ ｓｅｌ ｎ ｕ ｏ ｉ ｄ ｐａ ｅ ｍｐ ｒ ｒｄ ｉ ｇＫｌｂ ｉｌ ｐ ｅ ｍ ｎａ ａ ｌｙ ｄ ａ ｉ ｏ — ａ ｎ ｎ
ＶＩＥ Ａ ｔｉ ｉｓｓｅ ｂ ｉ ａ ｔ ｔ ｉ ｅ Ｋ； ｎｂｏｃ ｕ ｐｔｉｔ Ｗ ｓ ｗｔ ｔ Ｔ ｉ ｔ ｅ ｉｌｙ ｓ ｅ ｅ ｈ ｈ Ｋ—Ｂｄ ｕｉ ｅ ｏ ； ｌ ｓ ｔ ｒ ｓ ｅｅ ｅ ｃ ｄｂ Ｃ Ｒ ｓｌ Ｃ ｓ ｄ ｉ ｓ ｎ ｔ ｄ Ｃａ ｉ ｅ ｏ ｒ ｄｔ ｔ Ｐ Ｒ． ｅｕ ｓ ｌ ｆ ｏｍｈ ｓ １ｎ ｇ ｎ ｗ ｅ ｅ ｙ ｔ ｓ ａ
Ｉ 类整合 子广泛地存 在产 Ｅ Ｂ ｓ 炎克雷伯菌 中 ，类 整合子对 ＳＬ 肺 Ｉ
下呼吸道标本肺炎克雷伯菌的耐药性分析及产ESBLs和AmpC酶的检测
管插 管或气 管切 开 内吸痰或经 纤维支 气管镜 下 冲洗 留取痰标
本。
】 细 菌鉴 定和 药敏 试 验 ． ２
取痰标 本按照《 国临床检验操作规 程》 全 进行分 离培养 ， 并 上机进行细菌鉴定 ， 中菌株鉴定采用法 国梅里埃 Ａ Ｂ Ｅ ｐｅ— 其 Ｔ — ｘｒｓ ｓ ｎ分析仪及配套 Ｉ ３ Ｅ鉴定卡进行 ，另加 吲哚试验与产酸克 ｉ ｏ Ｄ２
２ 结 果
１０株 分 离 的肺 炎 克 雷 伯 菌 中 检 出 单 产 Ｅ Ｂ￣ ７ ８ Ｓ Ｉ ０株 （８９ ， 产 Ａｍ Ｃ酶 ２ ３ ．％）单 ｐ ２株 （２２ ， １ ．％） 同时产 Ａ ｐ ｍ Ｃ酶和 Ｅ — ｓ Ｂｓ Ｌ 即超超 广谱 一内酰胺 酶 （Ｓ Ｌ ）２株 （ ． 。单产 Ａ ｐ Ｓ Ｂ ｓ１ ６７ ％） ｍＣ
采用双纸片协同扩散法 。先按常规纸片扩散法将待测菌涂
在 Ｍ Ｈ平板培养基上 ，放置 １ｍｉ ５ ｎ后在平板 中央位置贴上 阿莫
究较 多的两类 Ｂ一内酰胺酶 ，在肺炎克雷伯菌耐药机制 中起非
西林 ／ 拉维酸 甲纸片 ， 克 再在平板周围分别贴上 ５种抗生素纸片
１４ Ａｍｐ 酶 检 测 ． Ｃ
按 Ｃ ｕ ｒｎＰ ｏ ｄｏ Ｅ等目 方法并略加以改进。 将头孢 西丁纸片抑 菌 环 直径 ≤１ ｅ 的菌株转种到胰酶大豆消化液 中， 细菌 生长至 ．ｍ ８ 待 对数期 后将培养 物离心 ， 取沉 淀部分经 反复冻融 ｆ７ 及 ３ ℃ 一Ｏ ７
水浴交替 ５次） 制备酶粗 提取 物。按标准药 敏纸 片扩散法在 ＭＨ
１ 种常用抗生素的耐药率均高于不产酶菌株（ ８ 除哌拉西林 ／ 巴唑 ） 他 。结论 下呼吸道感染肺炎克雷伯菌对 Ｂ一内酰胺类抗
产ESBLs和AmpC肺炎克雷伯菌医院感染分子流行病学研究
Ａ ｐ ｍ Ｃ菌株中酶 的表型。以质粒为模板 ， Ｂ一内酰胺酶通用引物 、ｌ Ｅ ｂａＨＶ及 ｂａ ｍ Ｃ作 Ｐ Ｒ扩增 ， 以染色体为模 用 ｂａ Ｍ、ｌ Ｔ Ｓ ｌＡ ｐ Ｃ 并 板， ｂＡ ｐ 用 ｌ ｍ Ｃ为引物作 Ｐ Ｒ扩增 以确定 酶的基 因型 。结果 ：２ ａ Ｃ １０株非 重复 的肺炎 克雷伯 菌 中， Ｂ一内酰胺酶 的有 ９ 株 产 ３ （７５ ， 中 １ 株产 Ｅ Ｂ ｓ １． ， ７． ％）其 ５ Ｓ Ｌ （２５ ９株产 Ａ ｐ （．％） 医院感染 Ｅ Ｂ ｓ阳性率（５５ 明显高于院外感染株（ ．％）所有 ％） ｍ Ｃ ７５ 。 ＳＬ ２ ．％） ｓ ｉ ｄｇｎ ｍｃＤ Ａ ｅｔ ｃ ｄ ｒｍｔｅｂｃ ｒ ｅｅ ｓｄｔ ｄｔ ｍｉ ｅｏ ｐ ｅ ｌ ｔ ａｅ ｙ ｏｊｇｔｎｍｅ ｄ． ｈ ａｍ ｄａ ｅｏ ｉ Ｎ ｒ ｔ ｏ ａｔ ａ ｒ ｕｅ ｅｅ ｎ ｇｎ ｔ ｅｏｔ ａ ａ ｓ ｓ ｉ ｈ ｐ ｎ ｘａｅｆ ｈ ｅ ｗ ｉ ｏ ｒ ｅ ｙ ｆ Ｂ－ ｃ ｍ ｈ ｂ
一
３４ 一 ０
重庆医科大学学报 ２ １ 年 第 ３ 卷第 ２ （ ｕｎ ｌ ｆ ｈ ｎ ｑ ｇＭ ｄ ａ Ｕ ｉ ｒｔ １ ． ｏ． ｏ２） ００ ５ 期 Ｊ ｒａ ｏ Ｃ ｏ ｇ ｉ ｅ ｉ ｌ ｎ ｅｓ ｙ ０ ０ Ｖ １５Ｎ ． ｏ ｎ ｃ ｖ ｉ ２ ３
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肺炎克雷伯菌是医院感染常见的条件致病菌。
临床肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素及单环β-内酰胺类抗生素敏感性降低，主要原因是产超广谱β-内酰胺酶。
A类超广谱β-内酰胺酶(Extend-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)在克雷伯菌、大肠杆菌为代表的肠杆菌科细胞中最为多见，包括TEM型、SHV型、non-TEM、non-SHV型三类，CTX-M-ESBLs是non-TEM、non-SHV型的重要代表。
本文对多重耐药的肺炎克雷伯菌临床株KP9941产超广谱β-内酰胺酶的耐药机制进行研究。
材料与方法一、材料(一)菌株1.测试菌株KP9941是1999年自我院一患者痰标本中分离获得。
菌株鉴定采用AP120E(BioMerieux,Marcy L‘Etoile,France)系统。
2.参考菌株ATCC25922，本实验室保存。
E.coli J53-2(SHV-1),Wu,S.W.博士惠赠，E.coli J53-2(TEM-4),沈定霞教授惠赠，E.coli J53-2(SHV-3),，王睿教授惠赠。
(二)药敏纸片奥格门丁(阿莫西林+克拉维酸，AMC，20μg/10μg)，头孢他定(CAZ，30μg)，头孢噻肟(CTX，30μg)，头孢曲松(CRO，30μg)，亚胺培南(IPM，10μg)等为Oxoid公司产品。
氨曲南(ATM，30μg)，Bristol-Myers Squibb公司产品。
环丙沙星(CIP，5μg)，庆大霉素(Gm,10μg)纸片购自北京药物生物制品检定所。
(三)工具酶与DNA分子量参照物PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶购自Takara生物工程公司。
限制内切酶NheI(G‘CTAGC)购自美国MBI公司。
DNA分子量参照物DL-2000购自Takara生物工程公司。
(四)PCR纯化试剂盒：Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)二、方法(一)琼脂纸片扩散法(Kirby-Bauer,K-B法)药物敏感试验应用K-B法测定临床菌株KP9941对抗菌药物的敏感性，药敏实验培养基为Mueller-Hinton琼脂培养基(M-H，OXOID公司)。
药敏判定标准遵照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)规定执行。
(二)双纸片协同试验(DDST)挑取单个新鲜菌落，置于灭菌生理盐水中混匀，用麦氏比浊管比浊至0.5×108，无菌棉签将待测菌液均匀涂布在厚度约为4mm的M-H琼脂上。
在平皿中央放置AMC纸片，四周放置四种三代头孢菌素纸片，三代头孢菌素纸片与AMC纸片中心距离约为25mm。
温箱35℃孵育16～18小时后读取结果。
如果三代头孢菌素纸片邻近AMC纸片侧的抑菌环增大(≥5mm)，视为产ESBLs阳性菌株。
(三)细菌总DNA提取参照Pitout JDD方法提取细菌总DNA。
取2μl提取物作为PCR模板。
(四)PCR扩增根据GenBank和EMBL公布的blaTEM DNA、blaSHV DNA和blaCTX-M-DNA序列分别设计合成3对特异性引物 TP1，TP2；SP1，SP2；M1，M2(上海生工生物工程有限公司合成)，分别扩增349bp、1014bp、551bp长的片段。
TP1：5‘CAGCGAATTCAGTTCTGCTATGTGG3‘，TP2：5‘ATTGCTGCAGGCATCGTGGT3‘。
SP1：5‘CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC3‘，SP2：5‘TCTTTCCGATGCCGCCGCCAGTCA3‘。
M1：5‘CGCTTTGCGATGTGCAG3‘，M2：5‘ACCGCGATATCGTTGGT3‘。
3对引物分别经GeneBank B1AST软件进行同源性分析，与GeneBank核酸数据库中非目的序列无同源性。
PCR反应体系(50μl)：10×Taq酶缓冲液5μl，引物各100pmol，4×dNTPs 100μmol/L模板NA 2μl，Taq酶2.5U。
PCR扩增blaTEM DNA即预变性94℃ 5分钟。
变性94℃ 45秒，复性55℃ 45秒，延伸72℃ 60秒，共30循环。
最后，72℃延伸5分钟，PCR扩增blaSHV DNA复性55℃，PCR扩增blaCTX-M-ESBLs复性52℃。
PCR产物在10%的琼脂糖凝胶上电泳，在波长254nm的紫外灯下检测扩增结果。
大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照，E.coli J53-2(TEM-4)和E.coli J53-2(SHV-3)的细菌总DNA分别作为blaTEM DNA、blaSHV DNA的阳性对照。
(五)PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)PCR产物纯化参照Wizard PCR Preps DNA Purification System使用说明进行。
限制内切酶NheI(G‘ CTAGC)对blaSHV DNA扩增产物1014bp片段进行酶切反应。
反应体系20μl：取blaSHV DNA PCR产物10μl,10×RE Buffer Y+/T ANqo TM(含BSA)2μl，限制内切酶NheI 1μl(10U/μl),ddH2O7μl37℃孵育2小时。
酶切产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上分析。
E.coli J53-2(SHV-1)及E.coli J53-2(SHV-3)的PCR产物分别作为酶切反应阴性对照和阳性对照。
(六)DNA序列分析：采用ABI PRISM 377型DNA测序仪进行DNA序列分析。
四色荧光末端标记，双脱氧法测定DNA序列，正向及反向各测一次。
结果一、K-B法检测临床分离株表型发现KP9941对头孢他定中度敏感，对头孢噻肟，头孢曲松，氨曲南，环丙沙星，庆大霉素等耐药，仅对亚胺培南敏感。
大肠埃希菌ATCC25922的各抗生素抑菌圈直径均在质控范围内。
二、DDST试验检测临床分离株KP9941发现头孢他定，头孢噻肟，头孢曲松，氨曲南与奥格门丁纸片协同现象均阳性。
三、PCR扩增blaTEM DNA、blaSHV DNA及blaCTX-M-ESBLs以TP1、TP2为引物扩增blaTEM β-内酰胺酶基因发现阳性对照株E.coli J53-2(TEM-4)出现349bp长的blaTEM DNA扩增片段，而KP9941菌株及阴性对照株大肠埃希菌ATCC25922未出现扩增条带。
以SP1、SP2为引物扩增blaSHV DNA，发现阳性对照株E.coli J53-2(SHV-1)、E.coli J53-2(SHV-3)和KP9941均出现1014bp长的扩增片段，而阴性对照株大肠埃希菌ATCC25922未出现扩增片段。
以M1、M2为引物扩增blaCTX-M-ESBLs发现KP9941出现551bp的扩增片段，而阴性对照株E.coli J53-2(TEM-4)和E.coli J53-2(SHV-3)未发现扩增条带。
四、PCR-RFLP检测blaSHV DNA G827A突变(即氨基酸G238S替代)blaSHV-1 DNA扩增片段1014bp中不含有NheI限制位点，而blaSHV-ESBLs在nt827发生G A突变(G827A即G238S)，产生一个NheI(G‘CTAGC)限制位点，在NheI限制内切酶作用下1014bp片段被切成771bp和243bp，可检测blaSHV-ESBLs G827A的突变。
本实验用NheI进行酶切分析发现阳性对照株E.coli J53-2(SHV-3)酶切后出现771bp和243bp两个片段，阴性对照株E.coli J53-2(SHV-1)及KP9941均未被切开。
五、序列分析：对KP9941的blaSHV DNA 的PCR扩增片段进行序列分析发现与blaSHV-1 DNA高度同源，第238位氨基酸为甘氨酸，未发生突变，其它blaSHV-ESBLs突变位点如39、69、104、164、205、237、240、244、265、276均未见改变。
对KP9941的blaCTX-M-ESBLs的PCR扩增片段进行序列分析发现该序列中498bp片段与blaCTX-M-1同源性高达98%，共8个核苷酸改变，即A337G，T375C，G411A，T489G，T644G，T671C，T740A，G810C。
与blaCTX-M-12同源性高达99%，仅有1个核苷酸改变G810C(附图)。
氨基酸序列分析表明KP9941的CTX-M-ESBLs与CTX-M-12的同源性最高，达99%，仅有一个氨基酸改变，即A250P，第250位丙氨酸(A)被苯丙氨酸(P)替代。
该CTX-M-ESBLs与CTX-M-3氨基酸序列的同源性是98%，4个核苷酸不同引起2个氨基酸替代即N92S(N，门冬酰胺)，和A250P。
与CTX-M-1氨基酸序列的同源性为97%，有4个氨基酸替代即N92S，D117N(D，门冬氨酸)，S143A和A250P。
总之，KP9941的blaCTX-M-ESBLs与CTX-M亚组1(如CTX-M-1，CTX-M-3，CTX-M-12)同源性最高，达97%～99%，属于CTX-M亚组1。
与CTX-M亚组2(CTX-M-2，CTX-M-4，Toho-1等CTX-M亚组3(Toho-2，CTX-M-13等)和CTX-M亚组4(CTX-M-8)的同源性在68%～86%之间。
讨论自1983年德国首次报导分离出产ESBLs的克雷伯菌以来，ESBLs目前已发现100多种。
国内细菌耐药性监测，上海地区1988～1998年内肺炎克雷伯菌对头孢噻肟和头孢他定耐药的菌株从2%和13%上升为31%和33%。
世界发现的产ESBLs的肺炎克雷伯菌以SHV-ESBLs为主，亦有TEM-ESBLs等其它类型。
blaSHV-ESBLs是由相应的广谱酶基因blaSHV-1衍生而来，在国外报道的blaSHV-ESBLs中，绝大多数都有G238S位点的突变，该点对扩大β-内酰胺酶的活性区、增加酶与底物的亲和力、降低Km值都有重要意义。
本次对一株多重耐药的肺炎克雷伯菌KP9941进行三种ESBLs的研究，未发现存在TEM DNA，发现存在SHV DNA。
用PCR-RFLP方法分析KP9941的blaSHV DNA，未发现G238S位点的突变，blaSHV DNA的序列分析发现与blaSHV-1高度一致，并证实238位为甘氨酸。
其它blaSHV-ESBLs 突变位点如39、69、104、164、205、237和240位均未见改变。
SHV-ESBLs目前已发现近30种，我国曾报道过产SHV-2型ESBLs的聚团肠杆菌。
近年来，非TEM、非SHV型ESBLs 种类数量不断增加，包括CTX-M、PER，VEB等类型［3，8，13］。