抗体工程制药PPT课件
特点：基本上消除了单克隆抗体的鼠源性（免疫原性），相 对分子质量为完整抗体分子的1/3-1/80，原来鼠源性单克隆抗 体的诸多生物学活性已消失，如激活补体、促进吞噬功能 （免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留 同抗原特异性结合的活性，即仅应用其导向作用，制备导向 药物用于肿瘤治疗
13.11.2020
抗体制药
13.11.2020
1
一、概述
13.11.2020
2
1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 建立血清疗法，开创了抗体制药
1937年Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白和丙种(γ）球 蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分
13.11.2020
16
动物体内诱生法优点：操作简便，比较经济，所得单 克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细 胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株
动物体内诱生法缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多 种杂蛋白，给纯化带来难度
13.11.2020
17
五、单克隆抗体的纯化
根据Ig的类别和亚类的不同，选择不同的纯化方法 根据用途不同选择不同的纯化方法，如用于体外诊断
13.11.2020
5
单克隆抗体：由单一的B淋巴细胞克隆产生的针对一 个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体
单克隆抗体具有高度特异性、均一性，有稳定来源可 大量生产等特点
单克隆抗体在临床实践中用于疾病的诊断和治疗
13.11.2020
6
基因工程抗体：1984年报道人-鼠嵌合抗体，相继制备出改形 抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等诸多类型
体外免疫法在制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原 性极弱且能引起免疫抑制时使用。优点是所需抗原量少， 一般只需几个微克，免疫期短，仅4-5d，干扰因素少，已 成功制备出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的 杂交瘤细胞株不够稳定
13.11.2020
10
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择
骨髓瘤细胞：融合率高，自身不分泌抗体，所产生的 杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。如 SP2/0、P3.653细胞
7
二、单克隆抗体及其制备
13.11.2020
8
一、 抗原与动物免疫
用于免疫的抗原：多数情况下抗原物质是部分纯化或 极不纯的混合物
一般采用与骨髓瘤供体同一品系动物进行免疫： BALB/c 小鼠和Lou大鼠
免疫方法：体内免疫法（脾内免疫法）、体外免疫法
13.11.2020
9
体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般 用8-12周龄的雌性鼠
克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的 整个培养过程
常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法
13.11.2020
15
四、单克隆抗体的大量制备
制备方法主要有两种：体外培养法，可获得l0µg /ml的 抗体；动物体内诱生法，可获得5-20mg/ml的抗体
目前多采用动物体内诱生法生产制备单克隆抗体：因 为杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB/c小鼠，所 以选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体
13.11.2020
12
饲养细胞：在最适宜培养条件下，大约105个脾细胞能 形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相 继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活，通 常要加入饲养细胞才能使其繁殖
常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺 细胞等
13.11.2020
13
三、筛选阳性克隆与克隆化
常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免 疫技术等
一般来说免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性 抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于 细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组 织标本为目的抗体时，免疫荧光法则更有意义
13.11.2020
14
筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞 或有多株分泌抗体的细胞，而且刚融合获得的杂交瘤 细胞不稳定，染色体易丢失，应尽早克隆化
免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）：将具有抗体活 性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白
所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性
13.11.2020
4
多克隆抗体：针对多种抗原决定簇的抗体 应用过程中经常发生非特异性交叉反应而出现假阳性
结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断。精制单价血清仍然难免 出现假阳性结果；而且其产量很低，很难满足临床治 疗和诊断上的需要
1975年kohler和Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤 技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibody, McAb)
13.11.2020
3
抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的 球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋 巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白
重链（heavy chain, H链）：有450-570个氨基酸残基 轻链（light chain, L链）：约有214个氨基酸残基 可变区（variable region, V区） 恒定区（constant region, C区） 互补决定区（complementary determining region,CDR）
试剂，IgG类抗体应采用沉淀处理结合亲和层析的方 法，IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法； 若制备体内诊断试剂或治疗用药则应注意去除内毒素、 病毒、核酸等微量的污染物，必须经亲和层析和阴离 子交换层析处理
13.11.202018三、基因工程抗 Nhomakorabea及其制备
13.11.2020
19
Ig分子结构
PEG：相对分子质量和浓度越大，促融率越高。但其 黏度和对细胞的毒性也随之增大。目前常用的浓度为 40%-50%，相对分子质量以4000为佳
二甲基亚砜（DMSO）
13.11.2020
11
HAT培养基：用次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)配 制。其中氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细 胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞和脾细胞 在这种组织培养条件，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞 是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株，脾细胞 内有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞HGPRT正常，用 次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长
13.11.2020
抗体制药
13.11.2020
1
一、概述
13.11.2020
2
1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 建立血清疗法，开创了抗体制药
1937年Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白和丙种(γ）球 蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分
13.11.2020
16
动物体内诱生法优点：操作简便，比较经济，所得单 克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细 胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株
动物体内诱生法缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多 种杂蛋白，给纯化带来难度
13.11.2020
17
五、单克隆抗体的纯化
根据Ig的类别和亚类的不同，选择不同的纯化方法 根据用途不同选择不同的纯化方法，如用于体外诊断
13.11.2020
5
单克隆抗体：由单一的B淋巴细胞克隆产生的针对一 个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体
单克隆抗体具有高度特异性、均一性，有稳定来源可 大量生产等特点
单克隆抗体在临床实践中用于疾病的诊断和治疗
13.11.2020
6
基因工程抗体：1984年报道人-鼠嵌合抗体，相继制备出改形 抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等诸多类型
体外免疫法在制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原 性极弱且能引起免疫抑制时使用。优点是所需抗原量少， 一般只需几个微克，免疫期短，仅4-5d，干扰因素少，已 成功制备出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的 杂交瘤细胞株不够稳定
13.11.2020
10
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择
骨髓瘤细胞：融合率高，自身不分泌抗体，所产生的 杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。如 SP2/0、P3.653细胞
7
二、单克隆抗体及其制备
13.11.2020
8
一、 抗原与动物免疫
用于免疫的抗原：多数情况下抗原物质是部分纯化或 极不纯的混合物
一般采用与骨髓瘤供体同一品系动物进行免疫： BALB/c 小鼠和Lou大鼠
免疫方法：体内免疫法（脾内免疫法）、体外免疫法
13.11.2020
9
体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般 用8-12周龄的雌性鼠
克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的 整个培养过程
常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法
13.11.2020
15
四、单克隆抗体的大量制备
制备方法主要有两种：体外培养法，可获得l0µg /ml的 抗体；动物体内诱生法，可获得5-20mg/ml的抗体
目前多采用动物体内诱生法生产制备单克隆抗体：因 为杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB/c小鼠，所 以选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体
13.11.2020
12
饲养细胞：在最适宜培养条件下，大约105个脾细胞能 形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相 继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活，通 常要加入饲养细胞才能使其繁殖
常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺 细胞等
13.11.2020
13
三、筛选阳性克隆与克隆化
常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免 疫技术等
一般来说免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性 抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于 细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组 织标本为目的抗体时，免疫荧光法则更有意义
13.11.2020
14
筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞 或有多株分泌抗体的细胞，而且刚融合获得的杂交瘤 细胞不稳定，染色体易丢失，应尽早克隆化
免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）：将具有抗体活 性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白
所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性
13.11.2020
4
多克隆抗体：针对多种抗原决定簇的抗体 应用过程中经常发生非特异性交叉反应而出现假阳性
结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断。精制单价血清仍然难免 出现假阳性结果；而且其产量很低，很难满足临床治 疗和诊断上的需要
1975年kohler和Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤 技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibody, McAb)
13.11.2020
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抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的 球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋 巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白
重链（heavy chain, H链）：有450-570个氨基酸残基 轻链（light chain, L链）：约有214个氨基酸残基 可变区（variable region, V区） 恒定区（constant region, C区） 互补决定区（complementary determining region,CDR）
试剂，IgG类抗体应采用沉淀处理结合亲和层析的方 法，IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法； 若制备体内诊断试剂或治疗用药则应注意去除内毒素、 病毒、核酸等微量的污染物，必须经亲和层析和阴离 子交换层析处理
13.11.202018三、基因工程抗 Nhomakorabea及其制备
13.11.2020
19
Ig分子结构
PEG：相对分子质量和浓度越大，促融率越高。但其 黏度和对细胞的毒性也随之增大。目前常用的浓度为 40%-50%，相对分子质量以4000为佳
二甲基亚砜（DMSO）
13.11.2020
11
HAT培养基：用次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)配 制。其中氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细 胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞和脾细胞 在这种组织培养条件，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞 是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株，脾细胞 内有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞HGPRT正常，用 次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长
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抗体工程制药PPT课件
有限稀释法：通过一系列稀释，使每个细胞
培养孔平均只含一个细胞，而分离细胞
软琼脂法：将杂交瘤细胞悬液分散在半固体
营养琼脂糖上，使呈单个细胞定位生长繁殖， 以达到克隆化的目的。
2003.4.7.
33
四.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
1. 杂交瘤细胞借助染色体分析鉴定
多数为端着丝粒染色体,染色体数目
2003.4.7.
21
HAT选择培养机制
主要途径
糖 氨基酸
氨甲喋呤（A）
次黄嘌呤(H) DNA
GMP
核苷酸
HGPRT
核苷酸前体
TK(胸苷激酶)
胸腺嘧啶核苷(T)
2003.4.7.
dTMP 22
HAT培养基：
H 为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为 DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原 料）
A 可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP 合成受抑制）
2003.4.7.
5
免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范
围从150,000到950,000道尔顿。分五类：
• IgG在血清中含量最高，达75~80%,是抗感染
的主要抗体;
• IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为
五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的
第一个抗体；
• IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参
20
2、杂交瘤细胞的选择性培养
常用的选择培养基为HAT培养基。 次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻断DNA合成)、
胸腺嘧啶(T)。 脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
(HGPRT),因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用 HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成 DNA,使杂交瘤细胞得以生长。
培养孔平均只含一个细胞，而分离细胞
软琼脂法：将杂交瘤细胞悬液分散在半固体
营养琼脂糖上，使呈单个细胞定位生长繁殖， 以达到克隆化的目的。
2003.4.7.
33
四.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
1. 杂交瘤细胞借助染色体分析鉴定
多数为端着丝粒染色体,染色体数目
2003.4.7.
21
HAT选择培养机制
主要途径
糖 氨基酸
氨甲喋呤（A）
次黄嘌呤(H) DNA
GMP
核苷酸
HGPRT
核苷酸前体
TK(胸苷激酶)
胸腺嘧啶核苷(T)
2003.4.7.
dTMP 22
HAT培养基：
H 为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为 DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原 料）
A 可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP 合成受抑制）
2003.4.7.
5
免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范
围从150,000到950,000道尔顿。分五类：
• IgG在血清中含量最高，达75~80%,是抗感染
的主要抗体;
• IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为
五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的
第一个抗体；
• IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参
20
2、杂交瘤细胞的选择性培养
常用的选择培养基为HAT培养基。 次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻断DNA合成)、
胸腺嘧啶(T)。 脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
(HGPRT),因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用 HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成 DNA,使杂交瘤细胞得以生长。
第四章 抗体制药-1ppt课件
用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不
抗 体
分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长
制 期稳定。
药
细胞融合后可产生多种融合
脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞
如何去除脾-瘤以外的融和细胞？
选择性培养 －脾-瘤培养基为HAT培养液。 次黄 嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。
A阻断DNA合成。
制
药 交瘤技术制备出单克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳 定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提 供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的 发展。
Biotechnological Pharmaceutics
第二节 McAb及制备
抗 体
一、 McAb
制
1、McAb定义
药
是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的针对一个
Biotechnological Pharmaceutics
杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定—染色体分析
抗 体
正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。
制
小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1
药
为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝
点。
杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数 目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应 出现少数标志染色体。
染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗 体；反之，则反。
5、 McAb的大量制备
抗 体 制 药
体外培养法
可获的 10μg/ml抗体
Biotechnological Pharmaceutics
体内诱生法可获的 5～20mg/ml抗体
抗体工程要点PPT课件
.
17
抗体的来源
• 抗体的定义
• 抗体的发现：1888年Emile Roux和Alexander Yersin发现了白喉毒素，1890年Von Behring发 现，白喉毒素或者破伤风毒素免疫动物后，血 液中可以产生阻止毒素诱发疾病的物质，称为 抗毒素（antitoxin)。
• 电泳分析gamma球蛋白（并不全是抗体）
800kb。 • 抗体轻链Lamda基因簇（IgL）：22号染色体，
700kb)。
.
23
抗体重链的基因及其表达
RNA alternative splicing
.
V基因：51个 J基因： 6个 D基因：27个 C基因：10个
24
轻链的基因与重排
V基因：30个 J基因：4个 C基因：4个
V基因：40个 J基因：5个 C基因：1个
• 6个CDR区，非共价结合抗原，空间可变结 构的结合。
• 作用特点： 1. 特异性 2. 可逆性 3. 有量效关系。
.
29
抗体的制备
多克隆抗体： 抗血清 血清与血浆 抗体的滴度 单克隆抗体：由单一细胞克隆分泌的，识别
同一个抗原决定簇，结构与功能都完全相同 的抗体。 基因工程抗体：通过基因工程方法生产或者 改造过的抗体分子，一般采用工程细胞进行 表达。
测血清中的抗体滴度，然后可以放血，制备抗体。 • 免疫方案：皮下多点注射。第1次福氏完全佐剂，后面福氏
不完全佐剂。
.
34
福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分
成分 石蜡油 无水羊毛脂 杀死的分枝杆菌 磷酸缓冲溶液
完全佐剂
6份
+
4份
+
3-5 mg
《抗体工程制药》课件
新型抗体药物的出现
随着抗体工程技术的发展，新型抗体药物不断涌现，如双特异性抗 体、抗体融合蛋白等。
抗体药物的生产技术的发展
随着生物技术的不断发展，抗体药物的生产技术也不断改进，如细 胞培养技术的优化、基因工程技术的应用等。
抗体工程制药的未来研究方向
新型抗体的研究与开发
研究新型抗体的结构和功能，开发具有新作用机制的抗体药物。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是一种利用噬菌体展示肽库筛选特异 性抗体的技术。
该技术将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使外 源基因编码的肽段在噬菌体外壳上展示，然后通过筛
选噬菌体展示肽库来获得特异性抗体。
噬菌体展示技术具有筛选效率高、特异性强等优点， 为抗体药物的研究和开发提供了新的工具。
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术是通过改变蛋白 质的氨基酸序列和结构来改变其
功能的一种技术。
在抗体工程制药中，蛋白质工程 技术可用于优化抗体分子的结构 和功能，提高抗体的亲和力和稳
定性，降低免疫原性。
蛋白质工程技术为抗体药物的研 发提供了强有力的手段，有助于 推动抗体工程制药领域的发展。
03 抗体药物的药效学研究
CHAPTER
抗体药物的生产技术研究
优化抗体药物的生产工艺，降低生产成本，提高产量和质量。
抗体药物的免疫原性研究
研究抗体药物的免疫原性机制，寻找降低免疫原性的新方法。
谢谢
THANKS
抗体药物的药效学研究进展
1 2 3
新型抗体药物的开发
随着抗体工程技术的发展，越来越多的新型抗体 药物被开发出来，如人源化抗体、单域抗体、双 特异性抗体等。
抗体药物的疗效和安全性
随着临床试验的深入开展，抗体药物的疗效和安 全性得到进一步验证，为抗体药物的应用提供了 更可靠的依据。
随着抗体工程技术的发展，新型抗体药物不断涌现，如双特异性抗 体、抗体融合蛋白等。
抗体药物的生产技术的发展
随着生物技术的不断发展，抗体药物的生产技术也不断改进，如细 胞培养技术的优化、基因工程技术的应用等。
抗体工程制药的未来研究方向
新型抗体的研究与开发
研究新型抗体的结构和功能，开发具有新作用机制的抗体药物。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是一种利用噬菌体展示肽库筛选特异 性抗体的技术。
该技术将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使外 源基因编码的肽段在噬菌体外壳上展示，然后通过筛
选噬菌体展示肽库来获得特异性抗体。
噬菌体展示技术具有筛选效率高、特异性强等优点， 为抗体药物的研究和开发提供了新的工具。
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术是通过改变蛋白 质的氨基酸序列和结构来改变其
功能的一种技术。
在抗体工程制药中，蛋白质工程 技术可用于优化抗体分子的结构 和功能，提高抗体的亲和力和稳
定性，降低免疫原性。
蛋白质工程技术为抗体药物的研 发提供了强有力的手段，有助于 推动抗体工程制药领域的发展。
03 抗体药物的药效学研究
CHAPTER
抗体药物的生产技术研究
优化抗体药物的生产工艺，降低生产成本，提高产量和质量。
抗体药物的免疫原性研究
研究抗体药物的免疫原性机制，寻找降低免疫原性的新方法。
谢谢
THANKS
抗体药物的药效学研究进展
1 2 3
新型抗体药物的开发
随着抗体工程技术的发展，越来越多的新型抗体 药物被开发出来，如人源化抗体、单域抗体、双 特异性抗体等。
抗体药物的疗效和安全性
随着临床试验的深入开展，抗体药物的疗效和安 全性得到进一步验证，为抗体药物的应用提供了 更可靠的依据。
抗体工程制药课件
v 轻链和重链中靠近N-端氨基酸序列 变化较大的区域
v 重链和轻链的V区分别称为VH和VL v 分别占重链和轻链的1/4和1/2 v VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和
排列顺序高度可变，称为高变区 （HVR）或互补决定区（CDR）， 共同组成Ig的抗原结合部位 v 在V区中CDR之外的区域氨基酸组 成和序列相对不变，称为骨架区 （FR）
v 二级结构由反向平行的两个
-片层（-sheet）组成，两 个-片中心的两个Cys由一个链内二硫 Nhomakorabea垂直连接，形
成“-桶状（-barrel）”
结构，这种折叠方式称为 “免疫球蛋白折叠 （immuno- globulin folding）”
10
› 铰链区（hinge region）
v 位于CH1与CH2之间 v 含有丰富的Pro v 易伸展、弯曲，能改变两个
结合抗原的Y形臂之间的距 离，有利于两臂同时结合两 个不同的抗原表位 v 易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 等水解，产生不同的水解片 段
11
12
13
19.1.3抗体制备发展历程
（1）多克隆抗体
➢1890年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素 ➢1937年， Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲 种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ）球蛋白，并 证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。
阳性克隆
28
› 杂交瘤细胞的筛选 —— 筛选阳性克隆
v 筛选要求：微量、快速、特异、敏感、简便，可一次 性检测大批标本
v 常用方法：免疫分析法，如ELISA
将抗原固定在微孔板上，细 胞培养上清培育一定时间后，用 酶标的抗鼠二抗，通过酶促反应 底物颜色变化，了解是否含有针 对该抗原的抗体存在。
v 重链和轻链的V区分别称为VH和VL v 分别占重链和轻链的1/4和1/2 v VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和
排列顺序高度可变，称为高变区 （HVR）或互补决定区（CDR）， 共同组成Ig的抗原结合部位 v 在V区中CDR之外的区域氨基酸组 成和序列相对不变，称为骨架区 （FR）
v 二级结构由反向平行的两个
-片层（-sheet）组成，两 个-片中心的两个Cys由一个链内二硫 Nhomakorabea垂直连接，形
成“-桶状（-barrel）”
结构，这种折叠方式称为 “免疫球蛋白折叠 （immuno- globulin folding）”
10
› 铰链区（hinge region）
v 位于CH1与CH2之间 v 含有丰富的Pro v 易伸展、弯曲，能改变两个
结合抗原的Y形臂之间的距 离，有利于两臂同时结合两 个不同的抗原表位 v 易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 等水解，产生不同的水解片 段
11
12
13
19.1.3抗体制备发展历程
（1）多克隆抗体
➢1890年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素 ➢1937年， Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲 种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ）球蛋白，并 证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。
阳性克隆
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› 杂交瘤细胞的筛选 —— 筛选阳性克隆
v 筛选要求：微量、快速、特异、敏感、简便，可一次 性检测大批标本
v 常用方法：免疫分析法，如ELISA
将抗原固定在微孔板上，细 胞培养上清培育一定时间后，用 酶标的抗鼠二抗，通过酶促反应 底物颜色变化，了解是否含有针 对该抗原的抗体存在。
第六章抗体工程制药-PPT精品文档
胃蛋白酶水解片段
作用于铰链区二硫键所连接的
两条重链的近C-端，水解后可 获得一个F(ab')2片段和一些小片 段pFc' F(ab')2片段由两个Fab及铰链区 组成，是双价抗体片段，可同 时结合两个抗原表位，可发生 凝集反应和沉淀反应 F(ab')2片段保留了结合相应抗 原的生物学活性，又避免了Fc 片段免疫原性可能引起的副作 用，广泛用作生物制品
杂交瘤技术制备出 McAb. 在临床上主要用于诊断和
治疗。
木瓜蛋白酶水解片段
水解部位是Ig铰链区二硫键连接的两
条重链在近N-端，可将Ig裂解为两个 完全相同的Fab片段和一个Fc片段 Fab片段即抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整的 轻链和重链的VH和CH1结构域组成，为 单价抗体片段，可与抗体结合，但不 凝集 Fc片段即可结晶片段（fragment cry-stallizable），相当于IgG的 CH2和CH3结构域，无抗原结合活性， 是Ig与效应分子或细胞相互作用的部 位
第十九章抗体药物制备工艺
19.1 概述
19.2 鼠源单克隆抗体的制备
19.3 基因工程抗体
19.1 概 述
19.1.1 抗体与抗原
抗体（antibody，Ab）： 指能与相应抗原 特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有 抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白
恒定区（constant region，C区）
靠近C-端氨基酸序列相对稳定的区
域
重链和轻链的C区分别称为CH和CL 分别占重链和轻链的3/4和1/2 不同型Ig的CL长度基本一致，但不
6抗体工程药物-PPT文档资料41页
–利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。
• 第三代抗体药物
3 3. OKT3单抗被美国FDA批准上市
2
4 4. 单抗用于肿瘤治疗效果不佳
2.应用抗体治疗淋巴瘤取得成功
7. FDA批准21个治疗性单抗上市
6. 抗17-1A和ReoPro上市
7
1 1.单克隆抗体-杂交瘤技术宣告诞生
6 5
5.抗内毒素单抗试用于治疗败血症性休克失败
– (4)其它抗原，如细胞因子、酶、血浆原蛋白、免疫球 蛋白、补体、激素等。
• 针对上述抗原的鼠单抗大部分被用于实
验研究，如抗原分类、鉴定和功能研究、 抗原基因克隆、蛋白分离纯化等，有一 部分抗体用于检验、疾病诊断、预后判 断等，少部分鼠单抗也被用于人类疾病 治疗研究。
• 目前，我国已批准的诊断性单抗有31个，
–基因工程抗体
基因工程抗体概念
• 将制备单克隆抗体的细胞工程技术与生
产重组分子的基因工程技术和蛋白质工 程技术结合起来，对编码蛋白质的基因 按不同需要进行加工改造和重新组装， 转染适当的受体细胞后表达出抗体分子， 这种经基因重组的抗体称为基因工程抗 体，又称重组抗体。
基因工程抗体优点
• ①通过基因工程技术的改造，可以降低
75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 2000
图1.治疗性抗体发展历程和事件
一、抗体药物的发展历程
• 第一代抗体药物 • 第二代抗体药物
–利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。
• 第三代抗体药物
基因工程技术公司 （Genentech）
武汉生物制品研究 所
• 第三代抗体药物
3 3. OKT3单抗被美国FDA批准上市
2
4 4. 单抗用于肿瘤治疗效果不佳
2.应用抗体治疗淋巴瘤取得成功
7. FDA批准21个治疗性单抗上市
6. 抗17-1A和ReoPro上市
7
1 1.单克隆抗体-杂交瘤技术宣告诞生
6 5
5.抗内毒素单抗试用于治疗败血症性休克失败
– (4)其它抗原，如细胞因子、酶、血浆原蛋白、免疫球 蛋白、补体、激素等。
• 针对上述抗原的鼠单抗大部分被用于实
验研究，如抗原分类、鉴定和功能研究、 抗原基因克隆、蛋白分离纯化等，有一 部分抗体用于检验、疾病诊断、预后判 断等，少部分鼠单抗也被用于人类疾病 治疗研究。
• 目前，我国已批准的诊断性单抗有31个，
–基因工程抗体
基因工程抗体概念
• 将制备单克隆抗体的细胞工程技术与生
产重组分子的基因工程技术和蛋白质工 程技术结合起来，对编码蛋白质的基因 按不同需要进行加工改造和重新组装， 转染适当的受体细胞后表达出抗体分子， 这种经基因重组的抗体称为基因工程抗 体，又称重组抗体。
基因工程抗体优点
• ①通过基因工程技术的改造，可以降低
75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 2000
图1.治疗性抗体发展历程和事件
一、抗体药物的发展历程
• 第一代抗体药物 • 第二代抗体药物
–利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。
• 第三代抗体药物
基因工程技术公司 （Genentech）
武汉生物制品研究 所
抗体制药最新PPT课件
第三节 杂交瘤细胞系的建立
一、免疫B淋巴细胞的制备
1. 抗原 凡是能具有抗原性质的物质均可制备单 克隆抗体，抗原可以是全病毒、亚单位 或纯化分子，也可以是蛋白质、多糖、 脂类等
用于制备单克隆抗体的抗原在理论上讲， 纯度要求就可以不高，也可以使混合抗 原
2. 免疫
动物的选择 目 前 常 用 的 骨 髓 瘤 细 胞 系 来 自 BALB/c 小 鼠和Lou大鼠 免疫方法 A. 体内免疫法 B. 脾内免疫法 C. 体外免疫法
所有抗体混合
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 細胞
31 2 4
二、杂交瘤及杂交瘤技术
细胞杂交的含义包括同一细胞的自融合 或是在诱导物的作用下不同细胞间的融 合 淋巴细胞通过融合剂的作用和肿瘤细胞 形成融合的杂交细胞称杂交瘤细胞 通过肿瘤细胞和淋巴细胞的融合，用于 某些细胞特性的研究和生产所期望的免 疫分子，称为杂交瘤技术
二、 骨髓瘤细胞的选择
在B淋巴细胞杂交瘤技术中，主要是用多 发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细 胞是来自骨髓造血细胞的一种肿瘤，分 泌单一抗体的浆细胞，并且衰变成不表 达自身抗体或部分表达 常见的骨髓瘤亲本细胞系有Sp2/0，NS-1， Y3，YB2
三、 免疫脾细胞的制备
经免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼 球、断颈等方法处死后，无菌摘取脾脏， 研磨制取B淋巴细胞悬液，经氯化铵破碎 红细胞后，洗涤并调整到（1～5）X107 个／ml浓度备用
六、杂交瘤细胞的克隆和建株
1. 杂交瘤细胞的克隆化
2. 杂交瘤细胞系建株
七、单克隆抗体的制备
1. 动物体内诱生法
2. 体外培养法
八、单克隆抗体生产的一般流程