环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立

动物医学进展，２０１２，３３（２）：９－１３　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立　温　海　，秦海斌　，朱　骞　，贺星亮　，陆承平　，张汇东ｈ　（１．公安部南京警犬研究所，江苏南京２１００１２；２．南京农业大学预防兽医学重点实验室，江苏南京２１００９５）　

摘　要：旨在建立一种利用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测犬细小病毒感染的新方法。根据Ｇｅｎ—　Ｂａｎｋ中犬细小病毒（ＣＰＶ）ＶＰ２基因序列，设计４条ＬＡＭＰ特异性引物，对反应条件、特异性、敏感性、可视　化效果和应用效果进行研究。结果显示，在６５℃等温条件下、１　ｈ内可完成ＬＡＭＰ扩增过程；病毒的最低检　出限量为１０　个ＴＣＩＤ　。／ｍＬ；特异性和可视效果良好；对３６份临床标本进行检测，阳性检出率为８０．５　（２９／３６），检出率高于普通ＰＣＲ　７２．２　（２６／３６）。建立的ＬＡＭＰ检测方法，显示了较高的特异性和敏感性，　而且兼具高效、快捷、可视化的优势，为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。　关键词：环介导等温扩增；犬细小病毒；快速检测　

中图分类号：￥８５２．６５５；￥８５８．２９２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７　５０３８（２０１２）０２—０００９—０５　犬细小病毒病（Ｃａｎｉｎｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）是一　种以肠炎综合征为特征的犬类、猫科和鼬科动物的　急性传染病，由犬细小病毒（Ｃａｎｉｎｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，　ＣＰＶ）引起，其较高的发病率和病死率在经济动物、　伴侣动物及军犬和警犬的饲养中造成很大的经济损　失ｌ＿】］。该病主要经由粪便向外排毒，犬感染ＣＰＶ后　４　ｄ～７　ｄ粪便中病毒滴度即达１０。ＴＣＩＤ　。／ｇ［２］，病　毒在粪便或固体污染物中可存活数月乃至数年，极　易造成该病的群体性暴发。因此，该病的快速诊断对　于及时采取综合防治措施、避免该病的流行至关重要。　环介导等温扩增技术（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒ—　ｒｅａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是一种新的核酸扩增方　法ｌ＿３ｊ，可在１５　ｍｉｎ　６０　ｍｉｎ内将ＤＮＡ扩增１０。倍　

～１０　倍，效率极高，已建立的不同病原的ＬＡＭＰ方　法　。　都证明了其敏感性为常规ＰＣＲ的１Ｏ倍～１００　倍，且所需设备简单、反应结果具备良好的可视化效　果，目前已成为病原临床快速诊断的一种新思路。　本文利用环介导等温扩增技术，以粪便作为检测材　料，建立了一种新的诊断犬细小病毒感染的方法，兼具　操作简单、高特异性、高敏感性和高时效性的优势，为　ＣＰＶ的临床诊断提供了一种新颖有效的手段。　１材料与方法　１．１　材料　１．１．１　毒株与细胞　犬细小病毒（ＣＰＶ）ＧＮ标准　株、ＣＡＶ　Ｉ型ＧＮ株及其细胞培养物，由南京警犬研　

究所分离鉴定、培养、保存；３６份粪便或肠内容物等　检测材料，采集自南京及周边地区疑似ＣＰＶ感染　犬；猫肾细胞（Ｆ８１）购自中国兽药监察所。　１．１．２　试剂　１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反应缓冲液为Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ公司产品；５．０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｅｔａｉｎｅ为　Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司产品；ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｔａｑ酶为　宝生物工程（大连）有限公司产品。　１．２　方法　１．２．１　引物的设计与合成　ＰＣＲ引物根据　ＧｅｎＢａｎｋ参考序列设计，上游引物为Ｐ１：５，＿ＡＴＧ—　ＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＧＧ一３　，下游引物为Ｐ２：５，＿　ＡＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧ　Ｃ一３　，由南京百龙　基因公司合成，扩增ＣＰＶ　ＶＰ２高度保守区域７１８　ｂｐ　的片段。ＬＡＭＰ引物的设计，根据ＣＰＶ　ＶＰ２　（Ｍ３８２４５）基因序列，应用在线软件Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　Ｖ３（ＮｅｔＬａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｆｕｊｉｔｓｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）设计　能扩增ＶＰ２高度保守区域的引物，引物位置和序列　见表１。　１．２．２　ＬＡＭＰ检测方法的建立　组织样品及细胞　培养物中病毒的ＤＮＡ模板制备按Ｔｒｉｚｏｌ法进行。　ＬＡＭＰ反应总体积２５　Ｌ：内含引物ＣＰＶ—ＢＩＰ和一　ＦＩＰ各１　Ｌ（４０　ｐｍｏ１）、ＣＰＶ—Ｆ３和一Ｂ３各０．５　Ｌ　（１０　ｐｍｏ１）、２．５　Ｌ　１０×Ｔｈｅｒｍｏ　Ｐｏｌ反应缓冲液　［２００　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，　１００　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣ１，　２Ｏ　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍ．ｇＳＯ４，１００　ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２　ＳＯ４，　１０　ｍＬ／Ｌ　Ｔｗｅｅｎ　２０　ｌ、４．０“Ｌ　５．０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｅｔａｉｎｅ、　

收稿日期：２０１１－１０—２０　。　基金项目：公安部应用创新计划（２００７ＹＹＣＸＮＪＪＱＳ１６１）　作者简介：温　海（１９６１一），男，吉林四平人，副研究员，主要从事动物疫病防控工作。＊通讯作者　１０　动物医学进展２０１２年第３３卷第２期（总第２２４期）　ＣＰＶ—ＦＩＰ　ＣＰＶ—ＢＩＰ　ＣＰ、，＿Ｆ３　ＣＰ、　Ｂ３　５＇－ＧＴＡＧＡＡＡＴＣＣＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣ－ＣＴＡＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＣＧ一３　（Ｆ１ｃ—Ｆ２）　５＇－ＧＧＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡ－ＴＧＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡＧＴＣＴＧ一３　（ＢＩｃ—Ｂ２）　５　ＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧ一３　５　ＣＣＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＴＣＴＴＣＴ一３　

４．０　ｕＬ　２．５　ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ　ｍｉｘｔｕｒｅ、８　Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒｉｓｅ、２　Ｌ模板ＤＮＡ。引物和模板在６０、　６３、６５℃孵育３Ｏ、４５、６Ｏ　ｍｉｎ，孵育反应结束后，再在　８０℃作用１０　ｍｉｎ终止反应。根据反应结果选择合　适的扩增条件。　１．２．３　ＬＡＭＰ特异性鉴定　犬传染性肝炎（ＣＡＶ　Ｉ型）是犬的另一种主要病毒性传染病，利用ＣＡＶ　Ｉ　型ＧＮ株和ＣＰＶ　ＧＮ株细胞培养产物的ＤＮＡ进行　ＬＡＭＰ特异性鉴定，于适宜循环参数下进行ＬＡＭＰ　扩增，判断其特异性。　１．２．４　ＬＡＭＰ敏感性试验　将ＣＰＶ　ＧＮ株Ｆ８１　细胞养产物（病毒含量为ＴＣＩＤ　。一１０／０．１　ｍＬ）进　行１Ｏ倍系列稀释，获得含有１Ｏ。、１０　、１Ｏ　、１００、　１０～、１０＿。、１０一、１０　个ＴＣＩＤ　。病毒量的样本，各　取０．１　ｍＬ提取病毒ＤＮＡ作为ＰＣＲ反应和ＬＡＭＰ　反应的模板，按１．２．２选择的循环参数下进行扩增，　比较ＰＣＲ反应和ＬＡＭＰ反应的敏感性差异。ＰＣＲ　反应总体积２Ｏ　Ｌ：２５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣＩ２　２．０　Ｌ，１０　×ＲＮＡ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　２．０　ｕＬ，２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ　１．６　Ｌ，ＤＥＰＣ—Ｈ２０　１１．５　Ｌ，Ｔａｑ酶　０．５　Ｌ，样品１．６　Ｌ，１０　ｎｍｏｌ／Ｌ　Ｐ１和Ｐ２各　０．４　Ｌ。ＰＣＲ的反应程序为：９６℃预变性５　ｍｉｎ；　９４℃４５　Ｓ，５５℃４５　Ｓ，７２。Ｃ　４５　Ｓ，３５个循环；７２℃　１０　ｍｉｎ，４℃保存备用。　１．２．５　ＬＡＭＰ结果可视化效果检测　分别以　ＣＰＶ　ＧＮ株和蒸馏水作为阳性和阴性对照，对３６份　临床样本在最佳ＬＡＭＰ条件下进行检测，以琼脂糖　凝胶电泳结果为参照，观察ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ染色的　可视化效果。琼脂糖凝胶电泳：４　Ｌ　ＬＡＭＰ产物，　以１５　ｇ／Ｌ浓度的琼脂糖凝胶电泳，成像、观察。　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ染色，按照１：１００的比例向ＬＡＭＰ　反应管中加入ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ，静置观察。　１．２．６　ＬＡＭＰ诊断方法的应用　对３６份疑似　ＣＰＶ感染的病料应用ＬＡＭＰ、ＰＣＲ方法进行检测，　比较两者的符合率和检出率的高低，初步判定ＬＡＭＰ　

方法临床使用效果。　２　结果　２．１　ＬＡＭＰ检测方法的建立　以ＣＰＶ　ＧＮ株ＤＮＡ为模板，分别以６Ｏ、６３、　６５℃反应６０　ｍｉｎ，１５　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，显示在　６５℃时该实验的条带清晰、分辨率较高（图１）。在　６５℃，分别反应３０、４５、６０　ｍｉｎ，以１５　ｇ／Ｌ琼脂糖凝　胶电泳，表明在４５　ｍｉｎ、６０　ｍｉｎ即可实现扩增，考虑　到产物量与时间的关系，本试验选择６０　ｍｉｎ以提高　反应的灵敏度（图２）。　２．２　ＬＡＭＰ反应特异性试验　分别以ＣＰＶ　ＧＮ株、犬传染性肝炎（ＣＡＶ工型）　ＧＮ株和蒸馏水对照ＤＮＡ为模板，在６５℃反应　６０　ｍｉｎ，产物以１５　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，ＣＰＶ对照　的阳性条带明显，ＣＡＶ工型ＧＮ株和蒸馏水对照均　未出现ＬＡＭＰ特异性条带，表明该方法只能特异检　出ＣＰＶ，对其他犬ＤＮＡ病毒不能检出（图３）。　

２　０００　ｂｐ　１　０００ｂｐ　７５０　ｂｐ　

５００　ｂｐ　

Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ　２　０００；１．６５℃；２．６３℃；３．６０。Ｃ　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００；１．６５℃；２．６３℃；３．６０℃　图１　ＣＰＶ　ＧＮ株的ＬＡＭＰ反应在　不同温度的扩增结果　Ｆｉｇ．１　ＬＡＭＰ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ＣＰＶ　ＧＮ　ｓｔｒａｉｎ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　１２　动物医学进展２０１２年第３３卷第２期（总第２２４期）　表２　ＣＰＶ　ＬＡＭＰ方法和ＰＣＲ方法的应用比较　Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＬＡＭＰ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　

３讨论　目前对于ＣＰＤ的诊断，已建立病毒分离培养、　电镜检查、胶乳凝集试验、免疫荧光技术、ＥＬＩＳＡ、　ＨＡ和ＰＣＲｃ　。　等多种检测ＣＰＶ的方法，在一定程　度上满足了ＣＰＶ实验室检测的需要，但在时效性、　灵敏性、便捷性上存在缺陷，有些方法容易出现假阳　性或假阴性结果，无法满足基层现场快速诊断的要　求。本研究建立的快速检测ＣＰＶ病毒的ＬＡＭＰ方　法，可在６５。Ｃ等温的条件下、１　ｈ内完成扩增；与常　规ｐＣＲ相比，检测灵敏度是ＰＣＲ的１００倍；对３６　份可疑样本的检测证实ＬＡＭＰ阳性检出率高于　ＰＣＲ方法，能有效防止假阴性结果的出现Ｌｌ　，证明　ＬＡＭＰ扩增技术比现有的检测方法更具临床应用　的前景。　ＬＡＭＰ方法的另一个优势是其结果的可视化，　反应产生的大量焦磷酸盐离子在产物中形成白色的　焦磷酸镁沉淀＿１　，可作为判断ＬＡＭＰ扩增是否发　生的标准；裸眼观察白色沉淀存在一定的误差，添加　溴化乙锭（ＥＢ）、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ、钙黄绿素等染料进　行染色，能够增加可视化反应的灵敏度。本研究在　ＬＡＭＰ扩增产物中加入１　Ｌ　ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ，阳性产　物在自然光下由橙色转变为绿色，观察效果直观明　显，在临床检测中可替代凝胶电泳，大大增加操作便　捷性和当地操作的可行性。与ＬＡＭＰ方法的高灵　敏度对应，其假阳性是该方法的一个缺陷，尤其是频　繁检测时环境中产生气溶胶污染增加了假阳性的出　现，通过加强操作环境的控制、裸眼观察ＬＡＭＰ产　物的浑浊度进行判定结果、在反应体系中预加羟基　萘酚蓝（ＨＮＢ）［１　］可有效降低气溶胶污染。另有报　导应用Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ仪来实时监控分析　ＬＡＭＰ反应过程，可以直观、实时地观察反应情况，　能够减低污染因素的干扰ｌ１引，但是仪器造价昂贵，　在当地检测中推广使用较为困难。通过规范操作过　程、增加通风操作、减少开盖检测次数仍然是控制污　染的主要措施。