离子交换树脂分离混合氨基酸
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸一、前言1、分离氨基酸的主要方法：(1) 离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。
离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤. 离子交换法也有自身的局限性，由于离子交换法是利用氨基酸等电点的不同，所以当两个或者多个氨基酸的等电点相近时，便无法分离，另外，氨基酸在树脂当中扩散速度较快，就要求料液的流速也相对较慢，这样自然造成了分离的缓慢，离子交换本身的生产原理也决定了反应难以连续还进行，这给工厂自动化生产带来影响，难以大规模地推广。
(2) 沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。
现在较为成熟的分离方法有精氨酸与苯甲醛在低温条件下，缩合成溶解度小的苯亚甲基精氨酸，从而析出沉淀，析出的沉淀用盐酸处理即可分离得到目标氨基酸精氨酸的盐酸盐；亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应，可生成亮氨酸的磺酸盐。
沉淀法的优点是方法简单，选择性强，但是缺点同样明显，沉淀剂回收困难，造成废液排放污染加剧。
(3) 萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。
其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。
溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。
(5) 电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。
离子交换柱层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸【目的要求】1．学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理；2．掌握离子交换柱层析的基本操作；3．掌握氨基酸和茚三酮显色机理。
【实验原理】一、离子交换层析原理离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。
有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如错误！未找到引用源。
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等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如：或这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。
功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。
可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。
因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。
其中使用的最普遍的是离子交换树脂。
由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即可被分离。
带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。
离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。
氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值。
在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。
在pH12条件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。
离子交换树脂层析分离混合氨基酸
实验二离子交换树脂层析分离混合氨基酸【实验目的】1. 了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。
2. 学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。
【实验原理】离子交换树脂是一种合成的高聚物,不溶于水,能吸水膨胀。
高聚物分子由能电离的性基团及非极性的树脂组成。
极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用,而非极性的树脂本身物性不变。
通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(=R=S03H)、弱(=COOH)、强碱(=N+=R:)和弱碱(=NH2=NHR=NR2)。
离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。
但对生物大于物质如蛋白质是不适当的,因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。
故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。
在特定的pH条件下,它们解离程度不同,通过改变脱液的pH 或离子强度可分别洗脱分离。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1.6X20cm);恒流泵;梯度混合器;试管及试管架;紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex 50)2.实验试剂(1)2mol/L HCl(2)2mol/L NaOH(3)0.1mOl/L HCl(4)0.1mol/L NaOH(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液:0.lmol/L柠檬酸54m1加0.1mol/L柠檬酸钠46ml(6)pH5的醋酸缓冲液:0.2mol/L NaAc 70ml加0.2mol/L HAc 30ml(7)0.2%中性茚三酮溶液:0.2g茚三酮加100ml丙酮(8)氨基酸混合液:丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol/L HCl 3m【实验方法】1. 树脂的处理100ml烧杯中置约10g树脂,加25ml 12mo1/L HCl搅拌2h,倾弃酸液,用蒸馏水充洗涤树脂至中性。
加25ml 12mol/L NaOH至上述树脂中搅拌2h,倾弃碱液,用蒸馏水洗涤至中性。
学习指南5 离子交换柱层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸——学习指南l 学习重点 1. 学习离子交换柱层析技术的基本原理和操作。
2. 掌握根据分离对象的性质差异进行实验条件的选择和设计。
l 知识要点1. 树脂：惰性的不溶高分子化合物。
根据树脂修饰的功能基团的性质差异，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂：功能基团是酸性的，其可解离的H ＋离子可与溶液相中的其它阳离子发生交换作用。
阴离子交换树脂：功能基团是碱性的，其可解离的OH －离子可与溶液相中的其它阴离子发生交换作用。
2. 离子交换柱层析法分离氨基酸：不同氨基酸的等电点不同，在同一缓冲液中，不同氨基酸所带电荷的性质和数量具有差异，与离子交换树脂的亲和力不同。
因此，不同的氨基酸会在洗脱的过程中先后流出层析柱，达到分离的目的。
3. 茚三酮法：在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成紫蓝色化合物（脯氨酸、羟脯氨酸反应生成黄色化合物），最大检测波长在570nm 处。
l 试剂 1. 阳离子交换树脂（Amberlite IR-120）。
2. 0.45mol/L pH5.3柠檬酸缓冲液。
3. 氨基酸样品：0.005mol/L 的Asp 和Lys （用0.02mol/L HCl 配制）。
4. 0.5%茚三酮溶液。
5. 0.1% CuSO 4溶液。
l 仪器层析柱、层析柱支架台、螺旋夹、恒流泵、旋涡混合仪、电磁炉、电磁炉锅、紫外可见分光光度计l 操作l 注意事项 1. 新鲜树脂通过预处理，可去除树脂生产过程中残留的溶剂、低聚物及少量的重金属离子等杂质。
2. 树脂预处理后的保存液与洗脱液不同，因此需预先平衡，以保证分离体系已经全部替换成洗脱液。
一般来说，需2~3倍柱床体积完成平衡。
3. 装柱时应注意液面不能低于树脂表面，加入树脂的速度不能太快，以免产生气泡。
4. 加样时应避免冲坏树脂表面，注意不能将样品全部加在某一局限部位。
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理主要是基于它们在不同条件下的溶解性、酸碱性和极性的差异。
以下是常用的氨基酸分离方法：
1. 薄层层析法：将氨基酸溶液均匀涂布在薄层层析板上，通过上机进行高效层析分离。
根据氨基酸在固定相和流动相中的相互作用力的不同，氨基酸在薄层上的迁移距离也不同，从而实现分离。
2. 离子交换色谱法：利用带电的树脂固定相对氨基酸进行分离。
树脂可以选择正离子交换树脂或阴离子交换树脂，根据氨基酸的酸碱性质进行选择。
溶液中的氨基酸通过与固定相发生离子交换，从而实现分离。
3. 气相色谱法：利用气相色谱仪将氨基酸蒸发后送入色谱柱进行分离。
根据氨基酸在固定相和载气中的分配系数不同，氨基酸在色谱柱中的保留时间也不同，从而实现分离。
4. 高效液相色谱法：利用高效液相色谱仪将氨基酸在流动相中进行分离。
根据氨基酸与固定相之间的亲疏水性差异，通过调节流动相组成及流速，实现氨基酸的分离。
综上所述，氨基酸的分离原理主要是利用它们在不同条件下的物理化学性质的差异，通过各种色谱方法实现分离。
实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离
实验二氨基酸的离子交换柱色谱分离【原理】本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。
在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
【操作】1、树脂的处理关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。
待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。
装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。
用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。
沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。
洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm 高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
实验八离子交换色谱分离混合氨基酸（初稿）.doc
实验八离子交换层析离混合氨基酸一、目的要求1. 了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。
2. 学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。
二、实验原理有些高分子物质含有一些可以解离的基团，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。
这类高分子物质统称离子交换剂，其中使用的最普遍的是离子交换树脂。
由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量为133.1）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=9.74，分子量为146.2）的混合液。
在pH=5.8条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。
在碱性条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。
这样，通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
三、试剂与器材1、材料磺酸型阳离子交换树脂（732型）2、试剂树脂处理液：2mol/L NaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.10mol/L 柠檬酸缓冲液（pH=5.8）、0.01mol/L NaOH溶液、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。
0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮（或者---显色剂：2克水合茚三酮溶于95%乙醇中，加水至100毫升）。
标准氨基酸溶液：将天门冬氨酸和赖氨酸分别配成2mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液。
混合氨基酸溶液：将上述天门冬氨酸和赖氨酸溶液按1：4比例混合。
3、器具离子交换层析柱（1.6X20cm）、量筒、吸管、收集器、试管及试管架、恒流泵。
四、操作方法1、新树脂的处理和转型干树脂用蒸馏水充分浸泡膨胀后，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCL和2mol/L NaOH依次浸洗搅拌30min，并分别用蒸馏水洗至中性（最后应处理至溶液无黄色）。
离子交换法分离提纯氨基酸
精品整理
离子交换法分离提纯氨基酸
氨基酸是蛋白质组成的基本单元，氨基酸在国民经济尤其是医药方面尤为重要，分离纯化氨基酸的技术就成了医药领域重要的技术。
氨基酸的分离提纯方法主要有沉淀法、离子交换法、萃取法、电渗析等。
其中，常用的是离子交换法。
离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征，以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异，利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。
离子交换法应用广泛，如味精厂采用强酸性阳离子交换树脂对L-谷氨酸阳离子进行选择性吸附，使发酵液中影响L-谷氨酸晶的杂质得以分离，某采用逆流多级交换，大大减少了树脂用量和洗涤树脂用水量；732阳离子交换树脂可用来分离纯化L-苯丙氨酸；分离纯化L - 谷氨酰胺基本上都采用阴阳双柱离子交换法；将胱氨酸发酵液通过732阳离子交换柱分离出精氨酸、组氨酸和赖氨酸；采用离子交换热参数泵从水解液和制革废水中浓缩分离氨基酸；采用强酸性阳离子交换树脂从发酵液中吸附L-赖氨酸等等的方法。
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离子交换树脂分离混合氨基酸
一、实验目的
1. 了解离子交换树脂的工作原理及操作技术。
2. 掌握离子交换法的操作技术
二、实验原理
离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。
高聚物分子由能电离的性基团及非极性的树脂组成。
极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。
通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸、弱酸、强碱和弱碱。
离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。
但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。
故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。
在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH或离子强度可分别分离。
天冬氨酸（Asp）2.77 , 赖氨酸（Lys）
9.74
三、实验材料
1．实验器材
732阳离子交换树脂
磁力搅拌器、
烘箱：1个调至80℃，公用。
毛细管：若干。
培养皿：
烧杯
层析滤纸（定性）：直径15cm，每人一张。
直尺、铅笔、电吹风：自备。
喷雾器：3-4个，公用。
2．实验试剂
(1)1mol／L HCl
(2)1mol／L NaOH
(3)0.1mol／L HCl
(4)0.1mol／L NaOH
(5)醋酸缓冲液：水150ml，无水醋酸钠82克，无水醋酸25ml，加水定容250ml （pH=5.5）。
(6)标准氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L的盐酸溶液（pH=1）。
(7)混合氨基酸溶液：将2种标准氨基酸溶液按1∶2.5的比例混合，、每个小组需要50mL。
(8)扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。
(9)显色剂：0. 25%水合茚三酮正丁醇溶液。
四、实验方法
1.732树脂的处理（全班统一处理）
将干树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀, 倾去清液。
再用8-10倍体积1mol/L的氢氧化钠浸泡4小时，倾去清液，洗至中性。
再用8-10倍体积的1mol/L 的盐酸浸泡2小时，倾去清液，洗至中性。
最后用0.1mol／L HCl,盐酸浸泡2小时，倾去清液。
2.吸附（每组处理一个）
将原料液体积与732离子交换树脂以5：1的比例装在三角瓶中，搅拌至吸附平衡，搅拌3h，过滤，弃去溶液。
3.第一次洗脱（每组处理一个）
取树脂，加入3倍体积的醋酸缓冲液，搅拌2h，过滤，收集滤液及树脂。
4.第二次洗脱（每组处理一个）
取树脂，加入3倍体积的0.1mol／L NaOH洗脱液，搅拌2h，过滤，收集
滤液及及树脂
5氨基酸鉴定（每人都要做）
（1）滤纸的准备：
取一长方形滤纸(9cm×8cm)，在滤纸纵向对应的两边距边沿1.5cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔1cm画一个“+”作为点样位置，共5个点。
（2）点样：
用毛细管点样，中间的点混合氨基酸，左侧点两种标准氨基酸，右侧分别点第一次和第二次洗脱的溶液；每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触。
（3）展层：
向培养皿中加入层析溶剂，液层不要超过点样线，（高约1.5cm）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将培养皿上盖一烧杯密闭，待溶剂到达标志线后取出，冷风吹干。
（4）显色：
用喷雾器将0.25％茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显色。
（5）计算
显色完毕测量洗脱液的Rf值，并判断洗脱液中都有哪中氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上。
五、思考题
1、做好本实验的关键是什么？
2、为什么两种氨基酸在不同的洗脱液中洗脱？。